一种能够显著清除活性氧（ROS）的天然寡肽的制作方法

本发明属于辣木籽深加工领域，具体涉及一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽。

背景技术：

活性氧(ROS)包括羟基自由基、超氧阴离子自由基、单线态氧和过氧化氢，是人类细胞正常代谢的副产物，在细胞信号转导和增殖中发挥重要作用。过量的ROS会导致氧化和抗氧化作用失衡，超过细胞在体内的有效抗氧化反应能力时，会在体内引发氧化应激反应。氧化应激可引起蛋白质交联、脂质过氧化、DNA和RNA损伤等氧化损伤，进而导致糖尿病、心血管疾病、类风湿关节炎、癌症、帕金森病等一系列疾病。为了减少或抑制自由基的产生，常见的人工抗氧化剂叔丁基对苯二酚、二叔丁基对甲酚和丁茴香醚已经广泛应用于食品保鲜，但其肝损伤和致癌性的缺陷对人类健康造成潜在的巨大的威胁，从而限制了他们的使用范围和用量。因此，寻找天然、高效、无毒的抗氧化剂作为合成抗氧化剂的替代品，一直是人们的主要兴趣。近年来，抗氧化肽因其来源广泛、抗氧化活性强而受到广泛关注。辣木属辣木科多年生木本植物，原产于热带或南亚热带干旱或半干旱地区。一系列研究发现，辣木叶、种子和根的提取物对人类有很多好处，如抗糖尿病和保护肝脏，抗尿石性能，以及改善肝纤维化。我们之前的研究表明，FM3(辣木籽蛋白水解物的分子量小于3.5kDa)能有效地清除DPPH·(EC504.0mg/mL)，HO·(EC50 4.2mg/mL)，O2^-·(EC50 4.3mg/mL)和ABTS·⁺(EC50 5.3mg/mL)。

现有技术如授权公告号为CN 20130404993.4 B的中国发明专利，公开了一种核桃粕抗氧化肽及其制备方法，该发明利用核桃粕蛋白，通过酶法水解，得到青养蛋白酶解液，再利用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱对其进行分离纯化得到十四种新的抗氧化肽产品，并测定其氨基酸序列。本发明所制得的抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，氧自由基吸收能力都约为粗肽的4倍，而且肽具有分子量小、可被人体直接吸收的特点，因此可以广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽，该天然寡肽分子量低，容易穿过屏障，靠近缺电子基团，增强肽的活性，带有非极性脂肪团的疏水氨基酸Tyr，对疏水脂肪酸具有较高的反应活性，表面疏水性较高，容易捕获脂质，对Fe²⁺的静电吸引作用较强。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽，是清除细胞内ROS的天然寡肽，分离自辣木籽蛋白水解物，该天然寡肽的氨基酸序列为Gln-Tyr，分子量为309.18Da。肽的抗氧化活性与其氨基酸的组成及排列顺序、疏水性、空间体积大小及酸碱性等有关。辣木籽蛋白含有较丰富的具有供质子或供电子能力的氨基酸，包括Tyr、Met、Cys，较丰富的疏水性氨基酸包括Leu、Pro、Phe、Val以及丰富的酸性氨基酸Glu。因此，对辣木籽蛋白进行水解可以制备得到具有强抗氧化活性的辣木籽肽。一般来说，低分子量、疏水性和芳香氨基酸的多肽具有较高的抗氧化活性。含2-10个氨基酸的短肽具有较强的自由基清除活性，能有效抑制脂质过氧化，可以穿过膜屏蔽并在组织水平上发挥多种生物活性，分子质量越小越容易穿过屏障，靠近缺电子基团，增强肽的活性；较大分子质量的多肽与自由基反应时存在空间位阻，导致多肽的抗氧化活性下降。含有非极性脂肪族基团Tyr的疏水氨基酸对疏水脂肪酸具有较高的反应活性，能够有效清除高脂食物的自由基。多肽序列中芳香氨基酸残基Tyr的芳香环可以促进促氧化金属离子的螯合，因此带有非极性脂肪团的疏水氨基酸Tyr对该寡肽的抗氧化活性贡献较大。

作为优选，上述天然寡肽能够提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性。在生物体中，有酶和非酶的抗氧化系统来保护自己免受活性氧损伤。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是人体天然的抗氧化酶，可将氧自由基最终转化为水进入人体，本发明提供的天然寡肽通过提高抗氧化酶的活性来提高清除细胞内ROS的能力。

作为优选，上述天然寡肽对DPPH自由基的半数有效浓度为0.75mg/mL，对ABTS自由基的半数有效浓度为0.33mg/mL。本发明提供的寡肽对DPPH自由基的半数有效浓度明显低于分离前辣木籽蛋白水解物的半数有效浓度，并且显著低于来源于欧洲泥鳅、大鲑鱼胸鳍、鳐科软骨以及蓝贻贝的抗氧化肽的半数有效浓度，因此，能够有效的清除DPPH自由基。本发明提供的寡肽对ABTS自由基的半数有效浓度明显低于分离前辣木籽蛋白水解物的半数有效浓度，并且显著低于来源于玉米麸粉、绿鳍马面鲀的头部以及鲑鱼的抗氧化肽的半数有效浓度，因此，能够有效的清除ABTS自由基。

作为优选，上述天然寡肽二巯基丙磺酸钠进行处理。疏水性氨基酸能够加强肽与脂质中自由基的相互作用，阻断脂质自氧化的链式反应，寡肽Gln-Tyr上的疏水氨基酸残基可与二巯基丙磺酸钠的疏水基团碳氢链结合，使寡肽的二级有序结构减少，使寡肽的疏水残基进一步暴露，使表面疏水性提高，更容易捕获脂质从而提高寡肽对脂质过氧化的抑制作用。过渡金属离子Fe²⁺是非常强的自由基发生剂，能够催化形成轻自由基，而二巯基丙磺酸钠有较多的负电荷，与寡肽结合后，寡肽上带有的负电荷增多，提高了其对Fe²⁺的静电吸引作用，从而提高了抗氧化肽螯合Fe²⁺的能力，最终提高天然寡肽清除ROS的能力。二巯基丙磺酸钠的浓度更优选为40-6mg/ml，二巯基丙磺酸钠的进一步优选为50mg/ml。上述二巯基丙磺酸钠的处理方式为：配制5-7mg/mL的天然寡肽，加入二巯基丙磺酸钠溶液，在55-65℃水浴条件下处理12-16min，冰浴冷却，用截留分子量为400Da的超滤膜处理，收集滤液，冻干，即得修饰后天然寡肽。

本发明的另一个目的在于提供本文描述的任一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽的制备方法硅化合物的制备方法，该制备方法增加了蛋白质的溶解性，促进与风味蛋白酶作用的结合位点发生裸露，蛋白质水解度高，释放出分子量较小的抗氧化活性强的目标功能短肽。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽的制备方法，该天然寡肽由风味蛋白酶对辣木籽蛋白水解后分离纯化得到。就一种蛋白质而言，用不同来源的蛋白酶水解，其水解速率、水解程度以及水解产物的组成有所不同，本发明选择风味蛋白酶有利于提高蛋白质的水解效率，获得目标寡肽。

作为优选，上述风味蛋白酶酶解前用氨基丁三醇进行预处理。更优选地，取100mL质量体积比为5％(mg/mL)的辣木籽蛋白悬浮液加入3-5mL 2-3mmol/mL氨基丁三醇，在室温条件下进行预处理。辣木籽蛋白肽的抗氧化活性与肽的分子量大小有关，辣木籽蛋白水解程度不同，水解得到的抗氧化肽分子量不同，活性也不同。风味蛋白酶酶解时加入一定量的氨基丁三醇，能够对蛋白质侧链上的羧酸敏感基团进行特异性修饰，使蛋白质氨基酸残基和多肽链发生改变，从而引起蛋白质空间结构和理化性质的改变，增加了蛋白质的溶解性，且易被风味蛋白酶作用的结合位点发生裸露，且不会对风味蛋白酶酶解反应产生影响，有利于蛋白质水解，水解度可达48.1％，释放出分子量较小的目标功能短肽。

作为优选，上述风味蛋白酶的酶解条件为：温度49-51℃，调节pH至6.5-6.9，酶添加量为4.8-5.2％，酶解时间为280-300min。本发明提供的温度、pH、总加酶量和酶解时间为最佳反应条件，最有利于酶促反应的进行。酶量较低时随着酶量的增加，酶解反应越充分，但酶量过大并不利用酶解的进行，因为蛋白质深度降解后产生了较多疏水性氨基酸含量高的小肽，在疏水相互作用及静电相互作用的影响下导致肽凝集。酶解时间越长，酶解反应越充分，但达到一定值后，由于蛋白质中可供酶切的位点大幅度减少，其与酶相接触的几率也大幅度下降。

作为优选，上述天然寡肽从辣木籽蛋白水解物中分离纯化的步骤包括：

超滤；

阴离子交换色谱法；

凝胶过滤层析；

反相高效液相色谱法。生物活性肤的分离纯化技术己成为制约进一步研究活性肤的结构及功能的关键所在。目前，生物活性肤的分离纯化常用的方法有超滤、离子交换色谱、凝胶过滤层析以及反相高效液相色谱(RP-HPLC)等。本发明采用超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱以及反相高效液相色谱结合的方法对辣木籽蛋白水解物进行分离纯化，具有很好的效果，得到了抗氧化活性高的短肽。

更为优选，上述反相高效液相色谱条件为：色谱柱为4.6×250mm的Zorbax300SB-C18柱，流动相为A相-B相，A相为含0.05-0.07％三氟乙酸的超纯水，B相为含0.04-0.06％三氟乙酸的甲醇，洗脱程序为：在0-2min内采用的流动相中B的体积百分比为0-2％；在2-4min内采用的流动相中B的体积百分比为2-30％；在4-27min内采用的流动相中B的体积百分比为30-60％，在27-30min内采用的流动相中B的体积百分比为60-100％，30-35min内采用的流动相中B的体积百分比为95％，流速为1mL/min，检测波长为280nm。C18柱对小片段(<20碱基)的DNA合成分离效果较好，片段更长的DNA分子不易进入固定相，在本发明提供的流动相和洗脱程序下具有理想的分离效果，极性较大的分子可以很快洗脱下来，随着洗脱液B含量的不断提高，分子极性只有微小差别的粗产物各组分，由于它们在固定相和流动相之间分配系数不同，在保留方面显现出明显差异而彼此分离开来，得到了显著清除ROS的天然寡肽。

本发明的有益效果为：

1)本发明通过对辣木籽蛋白水解物进行分离纯化得到氨基酸序列为Gln-Tyr，分子量为309.18Da的天然寡肽，该寡肽能够提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性从而显著清除ROS，同时能够有效清除DPPH自由基和ABTS自由基；

2)本发明通过对天然寡肽进行处理，表面疏水性提高，容易捕获脂质从而提高寡肽对脂质过氧化的抑制作用，增加寡肽上的负电荷，提高其对Fe²⁺的静电吸引作用，从而提高了抗氧化肽螯合Fe²⁺的能力；

3)本发明通过对辣木籽蛋白酶解条件的优化，增加了蛋白质的溶解性，促进与风味蛋白酶作用的结合位点发生裸露，提高蛋白质水解度和蛋白水解物的抗氧化活性，释放出分子量较小的抗氧化活性强的目标功能短肽；通过对分离纯化条件的优化，分子极性差别下的各短肽彼此分离开来，从而得到目标短肽。

附图说明

图1为本发明实施例1的反高效液相色谱图；

图2为本发明试验例1的示意图；

图3为本发明试验例2的示意图；

图4为本发明试验例3细胞内SOD和CAT活性的示意图；

图5为本发明试验例3细胞荧光强度的示意图；

图6为本发明试验例3细胞荧光图像。

具体实施方式

除非另外说明，本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以整体援引的方式并入本文中，如同将其全文进行阐述。

除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。在相抵触的情况下，则以本说明书中的定义为准。

当以范围、优选范围或一系列上限优选值和下限优选值给出数量、浓度或其他数值或参数时，应理解其具体公开了由任何较大的范围限制或优选值和任何较小的范围限制或优选值的任何一对数值所形成的所有范围，而无论这些范围是否分别被公开。例如，当描述“1至5”的范围时，所描述的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。除非另有说明，在本文描述数值范围之处，所述的范围意图包括范围端值和范围内的所有整数和分数。

另外，在本发明的要素或组分之前的词语“一”和“一种”意图表示对于该要素或组分的出现(即发生)次数没有限制性。因此，“一”或“一种”应理解为包括一种或至少一种，除非明确表示数量为单数，否则单数形式的所述要素或组分也包括复数的情况。

本发明的实施方案，包括在发明内容部分中所述本发明的实施方案以及本文下述的任何其他的实施方案，均可任意地进行组合。

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽的制备方法，包括：

1)辣木籽蛋白水解物的制备：首先将粉碎的辣木籽与乙酸乙酯按质量体积比为1:6的比例混合2天；将辣木籽在空气中自然干燥，将干燥后的辣木籽与pH＝8.8，1.5mol/L的Tris-HCL按质量体积比为1:38的比例在42℃下混合，100min后离心，取上清；在上清液中加入4.25mol/L硫酸铵，25℃下沉淀蛋白质，析出的辣木籽蛋白质用透析袋透析脱盐，然后冻干；制备质量体积比为5％的辣木籽蛋白悬浮液，取100mL蛋白悬浮液，然后调节pH至6.7，加入风味蛋白酶，总加酶量为5％，50℃下酶解300min。

2)分离纯化：

超滤：对酶解后的产物采用截留分子量3.5kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量<3.5kDa的超滤酶解物FM3。

阴离子交换色谱法：取5mL 60mg/L的FM3溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤后，上样到阴离子交换色谱柱QFF(1.6×80cm)上分离纯化，分别用0.1M NaCl Tris-HCl缓冲液、0.25M NaCl Tris-HCl缓冲液、0.5M NaCl Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为2.0mL/min，收集器每个试管收集的馏出体积为6mL，检测波长为280nm，最后在色谱峰上收集到F-I，F-II，F-III三个组分，进行冻干处理。

凝胶过滤层析：取1mL 5mg/mL的F-I溶液，上样到Sephadex G15柱(3.6×150cm)上分离纯化，用超纯水洗脱，流速为0.6mL/min，收集器每个试管收集的馏出体积为1.8mL，检测波长为280nm，最后在色谱峰上收集到F-I-I，F-I-II，F-I-III三个组分，进行冻干处理。

反相高效液相色谱法：取10μL 1mg/mL的F-I-I溶液，上样到4.6×250mm Zorbax 300SB-C18柱上分离纯化，流动相为A相-B相，A相为含0.05-0.07％三氟乙酸的超纯水，B相为含0.04-0.06％三氟乙酸的甲醇，洗脱程序为：在0-2min内采用的流动相中B的体积百分比为0-2％；在2-4min内采用的流动相中B的体积百分比为2-30％；在4-27min内采用的流动相中B的体积百分比为30-60％，在27-30min内采用的流动相中B的体积百分比为60-100％，30-35min内采用的流动相中B的体积百分比为95％，流速为1mL/min，检测波长为280nm。反相高效液相色谱结果见图1，最后在色谱峰上收集到11个组分(LM1-LM11)，进行冻干处理，称重，测定各个组分。

氨基酸序列及其分子质量的测定：采用494蛋白质序列测序系统测定LM1至LM11的N端氨基酸序列，埃德曼降解按照测序系统提供的标准程序性进行。采用电喷雾串联质谱法(ESI-Q-TOF)对LM1-LM11的分子量进行精确测定，电离是在毛细管电压为3500V的阳性模式下进行的。氮气在雾化过程中保持在40强度，在350℃下的蒸发过程中保持9L/min。以质心控制模式分析质子数/电荷数的比值。测得峰7组分(LM7)的氨基酸序列为Gln-Ty的寡肽，并测得其分子量为309.18Da。序列为Gln-Ty的寡肽的得率计算公式为：

得率(％)＝目标产物冻干粉的质量(g)/蛋白质冻干粉的质量(g)

测得目标寡肽的得率为1.19％。

实施例2：

一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽的制备方法，辣木籽蛋白悬浮液酶解前加入4mL 3mmol/mL氨基丁三醇室温处理2h，其余部分和实施例1完全一致。测得序列为Gln-Ty的寡肽的得率为1.62％。

实施例2中目标寡肽的得率高于实施例1，这说明，辣木籽蛋白酶解前用氨基丁三醇进行处理后，能够对蛋白质侧链上的羧酸敏感基团进行特异性修饰，使蛋白质氨基酸残基和多肽链发生改变，从而引起蛋白质空间结构和理化性质的改变，增加了蛋白质的溶解性，使风味蛋白酶作用的结合位点发生裸露，有利于蛋白质水解，从而增加氨基酸序列为Gln-Ty的寡肽的得率。

实施例3：

一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽的制备方法，将得到的目标寡肽配制成5-7mg/mL的寡肽溶液，取1mL加入0.5mL 40-60mg/mL的二巯基丙磺酸钠溶液，在55-65℃水浴条件下处理12-16min，冰浴冷却，用截留分子量为400Da的超滤膜处理，收集滤液，冻干，其余部分和实施例1完全一致。

试验例1：

水解度的测定：

取5mL辣木籽蛋白水解液，加入等量10％的三氯乙酸(TCA)溶液，混匀，4000rpm离心20min，取上清，用福林-酚法测定可溶性多肽的含量。水解度的计算公式如下：

水解度(DH/％)＝(N2-N1)/(N0-N1)×100％

式中N0为辣木籽总蛋白含量，N1为水解反应前辣木籽蛋白中的TCA可溶性多肽含量，N2为水解液中的TCA可溶性多肽含量。水解度的测定结果见图2。

由图2可以看出，实验例2中辣木籽蛋白质的水解度大于实施例1，这说明，经过预处理再酶解的产物水解程度较高，能够释放出更多的分子量较小且抗氧化性强的目标寡肽。

试验例2：

鳌合Fe²⁺能力的测定：

精确配置5mmol/L菲洛嗪试剂。取0.3mL与0.2mL 0.5mmol/L的FeCl2混合，加入1mL 3mg/mL样本溶液反应20min，测定562nm处的吸光值；在空白组中，用1mL超纯水代替1mL的样本溶液。Fe²⁺鳌合率的计算公式如下：

Fe²⁺鳌合率＝(1-A/A0)×100％

式中A，A0分别为样本组，空白组的吸光值。

抑制脂质过氧化能力的测定：

取1mL 3mg/mL样本溶液，加入1mL质量体积分数为2.5％的亚油酸无水乙醇溶液、2mL 0.05mmol/L pH7.0的PBS缓冲液、1mL超纯水，密闭后在黑暗条件下放置，保持温度在39-41℃；在空白组中，用1mL超纯水代替1mL样本溶液。

取0.1mL反应液，依次加入4.7mL体积分数为75％的乙醇溶液、0.1mL 30％硫氰酸铵、0.1mL 0.02mmol/LFeCl2，30min后在500nm处测定OD值，OD值计为At，每24h测定一次，以144h氧化抑制率表示样品的抗氧化能力。脂质氧化抑制率的计算公式如下：

脂质氧化抑制率＝[1-(A样,144h-A样,0h)]/(A空,144h-A空,0h)×100％

Fe²⁺鳌合率和脂质氧化抑制率的测定结果见图3。

由图3可以看出，实施例3鳌合Fe²⁺能力和抑制脂质过氧化能力与实施例1相比均较高，这说明对所得寡肽用二巯基丙磺酸钠溶液处理后表面疏水性提高，容易捕获脂质，从而提高寡肽对脂质过氧化的抑制作用，且寡肽上带有的负电荷增多，提高了其对Fe²⁺的静电吸引作用，从而提高了抗氧化肽螯合Fe²⁺的能力。

试验例3：

细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、ROS水平的测定：

将细胞按照3.5×10⁵个细胞/孔接种到6孔板中，并在1.6mL培养基中孵育24h。将实施例1所得的寡肽制成500μmol/L的样本溶液，在样本组中加入200μL样本溶液培养3h。在模型组和对照组中，用PBS代替200μL样本溶液。3h后，将200μL终浓度为300μmol/L的H2O2分别加入模型组，样本组和阳性对照组中，并温育2h。将200μL RPMI-1640培养基代替H2O2加入对照组。然后，除去培养基，用PBS洗涤细胞，重复三次。最后根据SOD，CAT检测试剂盒的说明测量SOD，CAT的水平。

吸弃培养液，将细胞接种至200μL 10μmol/L的双氯荧光素荧光探针溶液，孵育40min，然后除去溶液，用PBS冲洗细胞，重复三次。用多功能酶标仪在500±15nm激发波长和530±20nm发射波长的条件下检测，得到细胞的荧光强度。用倒置显微镜记录细胞荧光图像。细胞内SOD、CAT、ROS水平的测定结果见图4、图5、图6。

细胞内ROS可被体内抗氧化剂和抗氧化酶清除，由图4和图5可以看出，实施例1和实施例3中细胞的SOD和CAT活性显著高于模型组，H2O2诱导的模型组细胞荧光强度高于对照组，实施例1和实施例3的细胞荧光强度与模型组相比显著降低，即细胞内ROS水平明显降低，图6的细胞荧光图像再次证实了这一结果，这说明本发明提供的氨基酸序列为Gln-Ty，分子量为309.18Da的寡肽能通过改善细胞内SOD和CAT活性显著清除细胞内ROS。同时，实施例3中的细胞的SOD和CAT活性明显高于实施例1，细胞荧光强度明显低于实施例1，这说明寡肽用二巯基丙磺酸钠处理后，脂质过氧化的抑制作用和螯合Fe²⁺的能力的提高，增强了肽的抗氧化活性，对细胞氧化损伤的保护作用更高，进一步提高了细胞内SOD和CAT的活性，具有显著清除细胞内ROS的能力。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。