近海水域中金黄色葡萄球菌的快速检测方法与流程

本发明涉及常见病原菌检测技术领域，涉及到金黄色葡萄球菌保守性基因片段的一种q-pcr检测方法。

背景技术：

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)为球型直径约0.8um左右，在显微镜下呈单个、成双并且排列成葡萄串状，属于葡萄球菌属，无芽胞和鞭毛，且大多数无荚膜。金黄色葡萄球菌广泛存在自然界中(如空气、水、人和动物的的排泄物等)。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界卫生问题。由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大则更多，占到45％，中国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也时有发生，而随着人类活动对近海水质的影响以及滨海旅游业的发展，金黄色葡萄球菌在海水中引发的卫生问题也越来越受到人们的重视。不过目前对于海水中金黄色葡萄球菌含量的评估主要通过传统的培养计数法(如发酵法、滤膜法、最大可能计数法等),虽然这些方法也可以达到准确计数，但是比较耗时耗力。而对于今后近海水域病原菌的监测的发展带来极大的影响。所以发明一种快速、简便、灵敏的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种近海水域中金黄色葡萄球菌的快速检测方法。

本发明的技术方案如下：近海水域中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，包括如下步骤：

1)监测海域水环境细菌总dna的获取

通过抽滤方法将一定体积(500ml)海水样品中总细菌全部截留在0.22μm的微孔滤膜上，在-80℃下保存，用waterdnakit试剂盒(omega,usa)提取滤膜上细菌总dna，具体步骤参见试剂盒说明书。

2)目的片段的获取

查阅相关文献查找或通过genscriptreal-timepcr(taqman)primerdesign设计特性引物，本方法针对金黄色葡萄球菌特异性耐热核酸酶基因设计特异性引物，目的片段大小约130bp，引物信息如下：

上游引物：5′-cgattgatggtgatacggtt-3′

下游引物：5′-gcacttgcttcaggaccat-3′

利用金黄色葡萄球菌(阳性对照)以及环境dna样品进行pcr实验，体系为：2×pcrmastermix12.5μl、ddh2o9.5μl、上游引物(10μm)1μl、下游引物(10μm)1μl、dna1μl。采用的pcr程序：95℃预变性5min；95℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸2min。通过普通dna纯化试剂盒回收纯化pcr产物并获得目的片段

3)构建标准质粒

(ⅰ)纯化的目的产物与ptopo-t载体进行连接，室温下连接或20℃恒温连接5-10分钟；

(ⅱ)取5ul连接产物，加入置于含有50ule.colidh5α感受态细胞1.5ml的离心管中(含有感受态细胞离心管放置在冰上解冻)，轻轻搅拌混匀后，冰浴30min；

(ⅲ)将离心管放在金属浴上，42℃热击45s～90s,然后放回冰上2min.(ⅳ)加入800ullb培养基，37℃、170rpm摇床上培养1-2h后，取30ul、100ul涂布在含有苄青霉素的lb固体培养基，37℃培养12-16h；

(ⅴ)挑取单菌落，在含有氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜培养。然后将用小质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒，并将质粒送去测序公司测序。

4)建立q-pcr定量标准曲线

提取完成后用nd-1000uv-visspectrophotometer(thermofisherscientific,usa)核酸含量测定仪测出质粒的浓度，并用在线计算软件(http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html)计算出质粒模板的准确拷贝数。对其进梯度稀释，在copies/μl范围内建立定量标准曲线。q-pcr的程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；体系为：2×sybrgreenqpcrmix5μl、ddh2o3.5μl、上游引物(10μm)0.25μl、下游引物(10μm)0.25μl、dna1μl。反应完成后以ct值和log拷贝数建立标准曲线。

5)环境样品金黄色葡萄球菌数测定

采用q-pcr技术测定肠球菌dna浓度。反应体系：2×sybrgreenqpcrmix5μl、ddh2o3.5μl、上游引物(10μm)0.25μl、下游引物(10μm)0.25μl、dna1μl；q-pcr程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。然后按照定量标准曲线将ct值转换成拷贝数，从而定量环境样品中金黄色葡萄球菌的浓度。

有益效果：荧光定量pcr检测方法是一种快速、灵敏、特异性检测方法，可以弥补传统培养计数法耗时长(分离，鉴定，计数)缺陷，可以大规模检测环境样品。传统培养计数法只能检测可培养的病原菌，然而，有研究表明，细菌在环境压力下可以进入“具有活性但不可培养(viablebutnonculturable,vbnc)的状态，荧光定量pcr是基于基因层面的，可以弥补这方面的缺陷更准确的定量环境中的病原菌的丰度。与当下基于选择性培养检测方法相比，该方法有以下优点：首先，缩短了检测时间，检测时间由原方法的2-3天，缩短为1天，在完成标准曲线的情况下仅需3-4个小时。其次，克服了原方法无法测定不可培养肠球菌的问题，提高了鉴别的准确度。

附图说明

图1是琼脂糖凝胶电泳图，从左到右依次是marker，大亚湾d1，d2，空白以及金黄色葡萄球菌阳性。

图2是在1.8x10³～1.8x10⁷copies/μl范围内建立q-pcr定量扩增曲线。

图3是在1.8x10³～1.8x10⁷copies/μl范围内建立q-pcr溶解曲线，其中溶解曲线呈现单峰，表明模板中扩增产物是单一产物。

图4是q-pcr所得ct值与log拷贝数之间的线性关系(即标准曲线)。

图5是测定2018.11和2019.1深圳大亚湾淡澳河口海域金黄色葡萄球丰度。

图6是测定2018.11和2019.1深圳大亚湾淡澳河口海域金黄色葡萄球菌丰度。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。

本研究建立的方法适用于对海水样品中的金黄色葡萄球菌进行定量，方法说明书如下：

1、在设定的采样点，用水样专门的样品采集器在水面下0.5m处采集水样样本，装入容积为1l的无菌玻璃瓶中，编号后保存于冰盒中，所有样品采集完成后，立即将其低温运送回实验室处理，运回实验室后，对于部分水样样品用孔径为0.22μm的微孔滤膜进行过滤，每张滤膜过滤水样500ml，每个采样点过滤三张滤膜，在-80℃冰箱内保存并用于后续dna的提取。

2、提取样品dna，水样样品的dna提取选用e.n.z.a.tmwaterdnakit试剂盒(omega,usa)，为确保排除外界杂菌的污染干扰，以下操作需在超净工作台中进行，具体提取步骤见试剂盒说明书。

3、提取dna后，按照如下体系进行q-pcr实验：2×sybrgreenqpcrmix5μl、ddh2o3.5μl、上游引物(10μm)0.25μl、下游引物(10μm)0.25μl、dna1μl。程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。然后按照定量标准曲线将ct值转换成拷贝数，从而定量环境样品中金黄色葡萄球菌的浓度。

运用该检测方法对2018年11月份2019年1月、3月份秦皇岛滦河口海域与深圳大亚湾淡澳河口海域金黄色葡萄球菌丰度进行评估，并取得良好效果。

图1为金黄色葡萄球菌目的基因的获取，空白对照与环境均为出现其他条带差异。

图2为此标准样品的扩增曲线，看同一稀释度样品ct值相差0.5个循环，梯度样品循环数间隔良好，并且阴性无扩增，表示扩增曲线良好。

图3为溶解曲线呈现单峰，表明模板中扩增产物是单一产物，扩增的产物是待检测基因，并没有出现引物二聚体或其他产物。

图4建立ct值与log拷贝数的回归方程，应用于环境样品中待测菌的检测。其中r2＝0.9934>0.9表示回归性良好，可用于实际检测病原菌丰度。

图5是测定2018.11和2019.1深圳大亚湾淡澳河口海域金黄色葡萄球丰度。

图6是测定2018.11和2019.1深圳大亚湾淡澳河口海域金黄色葡萄球菌丰度。

应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110>天津大学

<120>近海水域中金黄色葡萄球菌的快速检测方法

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<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)

<400>1

cgattgatggtgatacggtt20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)

<400>3

gcacttgcttcaggaccat19