一种海桑属植物的叶绿体DNA提取方法与流程

本发明属于植物基因工程技术领域。更具体地，涉及一种海桑属植物的叶绿体dna提取方法。

背景技术：

红树林生态系统处于海陆动态交界面、周期性遭到海水浸淹的潮间带环境，作为独特的海陆边缘生态系统，具有极高的生态、社会和经济价值，特别是在固岸护堤、发展近海渔业、维持生物多样性、调节小气候、净化环境、发展生态旅游以及维持海岸带生态平衡等方面表现的尤为突出，是目前全球海洋生物多样性保护和全球气候变化研究的重要内容。海桑属(sonneratia)红树植物隶属海桑科(sonneratiaceae)，是热带和亚热带海岸红树林中的重要类群，属于典型的印度-西太平洋群系植物(iwp)。海桑属植物凭借其生长速度快，适应能力强，改良土壤效应的特点，成为我国海洋生态文明修复系统的首选植物。在我国，海桑属植物包括海桑、拟海桑、无瓣海桑、海南海桑、卵叶海桑和杯萼海桑6种。海桑属植物的叶片为适应环境，相较于陆生植物表现出了较厚的角质层和贮水组织等旱生及抗盐结构，这些结构对植物的蒸腾作用和调节水分平衡具有重要意义，但同时也为叶绿体的提取带来了很大的难度。

叶绿体是负责捕获能量的绿色光合作用细胞器，具有半自主性的遗传表达系统，能编码部分自身遗传信息。随着分子测序技术的发展，1986年，shinozaki等首次获得烟草植物的叶绿体基因组完整序列，使得叶绿体数据库迅速得到补充。据ncbi数据库统计，截止2018年，已发表的叶绿体基因组达到911个。因叶绿体基因组结构、大小和基因种类比较保守，叶绿体基因组成为研究海桑属植物的系统进化发育的有效工具，且提取纯度高的海桑属植物的叶绿体dna，是进行完整海桑属植物叶绿体基因组测序、序列分析的前提。

目前，提取植物叶绿体dna的方法有蔗糖密度梯度离心法、percoll密度梯度离心法、高盐低ph法、dnase处理法、ctab法和sds法等，主要步骤为：叶绿体分离提取，叶绿体纯化裂解和叶绿体dna提取等。由于植物界物种的丰富多样性，尤其是次生代谢产物的存在，导致了不同植物种类的样品存在巨大差异，因此，目前没有任何一种叶绿体dna提取方法可以适用于全部的植物类型。研究人员需要针对不同类型、不同特征的植物，开发适用该植物的叶绿体dna提取方法。海桑属植物是我国红树植物类群中非常重要的一个群体，因此，开发适用于海桑属植物的叶绿体dna提取方法，对我国的红树植物分子进化研究具有重要的意义。

但是，目前还没有针对海桑属植物的叶绿体dna的提取方法。因此，亟待开发一种可以快速、简单、高效且安全的提取出高质量、高纯度的海桑属植物的叶绿体dna的方法，以为进一步开展海桑属植物叶绿体基因组结构、功能和分子生物学研究方面提供前提保证。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有海桑属植物的叶绿体dna的提取方法的空白，提供一种海桑属植物的叶绿体dna提取方法。本发明在秉承经济有效、耗时短的原则的基础上，应用改进的高盐低ph法，结合海桑属植物本身的生物学特性进行研究，成功提取分离得到了高产量、高纯度的海桑属植物的叶绿体dna，能够为后续的基因组测序工作奠定生物学基础。

本发明的目的是提供一种海桑属植物的叶绿体dna提取方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种海桑属植物的叶绿体dna提取方法，包括以下步骤：

s1.将海桑属植物叶片黑暗处理，匀浆，离心，过滤，得到的滤液即为海桑属植物叶绿体；

s2.在步骤s1得到的叶绿体中加入裂解缓冲液充分裂解，将得到的裂解混合溶液先用酚抽提，再用酚-氯仿抽提，离心，得到的沉淀进行溶解，rnase消化，即可得到所述海桑属植物的叶绿体dna；

其中，步骤s2所述裂解缓冲液中的十二烷基硫酸钠的浓度为3.5％～4.5％。

由于海桑属植物具有红树植物的一般特征，可能与其适应海水浸泡的生物环境有关，具有肉质化、此生代谢物多等特征，这些特征导致了现有方法提取海桑叶绿体dna时，均发现产率低，dna纯度不足等问题。因此，本发明以高盐低ph法为基础，进行了重要的技术改进，从而获得了高产量、高纯度的海桑属植物的叶绿体dna。

本发明改进了叶绿体裂解混合溶液的离心条件，得到了最适合海桑属植物叶绿体的离心速度和时间；改进了裂解缓冲液中的十二烷基磺酸钠(sds)的浓度，从而使得叶绿体获得了更好的裂解效果；叶绿体dna提取过程中，增加了rnase消化，有效的避免了rna污染，显著提高了海桑属植物的叶绿体dna的纯度和质量。

优选地，步骤s1所述离心的速度为100～300×g。

当离心的速度过小(＜100×g)时，影响海桑属植物细胞器的分离质量，加大细胞核的污染；当离心的速度过大(＞300×g)时，影响海桑属植物细胞器的分离质量，加大线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子的污染。

更优选地，步骤s1所述离心的速度为300×g。

优选地，步骤s1所述离心的时间为1～5min。

当离心的时间过短(＜1min)时，使得海桑属植物细胞器的分离不彻底；当离心的时间过长(＞5min)时，分离效率降低。

更优选地，步骤s1所述离心的时间为3min。

优选地，步骤s2所述裂解缓冲液中的十二烷基硫酸钠的浓度为3.8％～4.2％。

当十二烷基硫酸钠的浓度＜3.5％时，叶绿体裂解不充分，dna产量降低；当十二烷基硫酸钠的浓度＞4.5％时，盐分增加，对后续实验步骤有影响。

更优选地，步骤s2所述裂解缓冲液中的十二烷基硫酸钠的浓度为4％。

优选地，步骤s2所述rnase的浓度为100～500ng/ul。

当rnase的浓度过小(＜100ng/ul)时，rna降解的效率降低，容易产生rna污染；当rnase的浓度过大(＞500ng/ul)时，成本增高，造成不必要的浪费。

更优选地，步骤s2所述rnase的浓度为300ng/ul。

优选地，步骤s2所述消化的时间为1～2h。

当消化的时间＜1h时，会造成消化不完全，得到的dna纯度不高；当消化时间＞2h时，效率降低。

更优选地，步骤s2所述消化的时间为1.5h。

优选地，步骤s2所述裂解混合溶液和所述酚的体积比为0.8～1.2：1。

更优选地，步骤s2所述裂解混合溶液和所述酚的体积比为1：1。

优选地，步骤s2所述裂解混合溶液和所述酚-氯仿的体积比为0.8～1.2：1。

更优选地，步骤s2所述裂解混合溶液和所述酚-氯仿的体积比为1：1。

所述酚的作用为：抽提叶绿体细胞dna，使蛋白质变性，同时抑制dnase的降解。

所述氯仿的作用为：克服酚的缺点，加速有机相与液相分层。

另外，所述方法制备得到的海桑属植物的叶绿体dna，也应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种海桑属植物的叶绿体dna提取方法。本发明结合海桑属植物本身的生物学特性，制备得到了大量完整性好的海桑属植物叶绿体，并成功提取分离获得了质量高、纯度高的海桑属植物的叶绿体dna；该方法经济有效、耗时短，有助于对海桑属植物这一重要的红树植物类群进行以叶绿体dna序列为基础的分子进化研究，对分析海桑属植物的进化关系，设计ssr引物对现存海桑属植物群体进行遗传多样性分析，以及分析外来海桑属植物在国内的扩张和演化情况等具有重要意义，为海桑属植物的分子生物学研究奠定了基础。

附图说明

图1是海桑属植物叶绿体在不同离心条件下的荧光显微镜镜检结果；其中，a图为100×g离心沉淀；b图为200×g离心沉淀；c图为300×g离心沉淀。

图2是在100×g离心条件下得到的海桑属植物叶绿体的完整性检测结果。

图3是海桑属植物的叶绿体dna的电泳检测结果；其中，a图为未改进的方法制备得到的海桑属植物的叶绿体dna的电泳检测结果；b图为改进后的方法制备得到的海桑属植物的叶绿体dna的电泳检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所用的材料与仪器如下：

1、植物材料

海桑属植物材料来源于海南文昌。

2、主要试剂

缓冲液a(提取缓冲液)：0.3mol/l山梨糖醇、50mmol/ltris-hcl、20mmol/ledta、0.1％bsa；

缓冲液b(裂解缓冲液)：4％十二烷基硫酸钠(sds)、50mmol/ltris-hcl、0.4mmol/ledta、0.1％蛋白酶k(m/v)，ph＝8.0；

te缓冲液：10mmol/ltris、5mmol/lna2edta、ph＝7.5；

dna提取酚试剂、氯仿、3mol/l乙酸钠/醋酸钠溶液(naac)、99％乙醇和75％乙醇。

3、主要仪器

制冰机为海南光威科技有限公司产品；搅拌器为小熊电器有限公司llj-d06d2产品；智能高速冷冻离心机为湖南赫西仪器转备有限公司3h24ri产品；电热恒温水浴锅为上海博讯实业有限公司医疗设备厂hhs-21-6产品；电泳仪为韦克斯公司wix-ep300产品；凝胶成像电泳系统为上海天能科技有限公司产品；微量紫外分光光度计为基因有限公司nanodropone产品；荧光显微镜为leicadm2500产品；电子天平为梅特勒-托利多仪器有限公司me204e/02；10ml离心管、1.5ml的ep管、-20℃冰箱为国产产品。

实施例1海桑属植物的叶绿体分离和dna提取

海桑属植物叶绿体提取分离方法参考palmer等发表的文章(palmerjd,steindb.conservationofchloroplastgenomestructureamongvascularplants.currgenet,1986,10:823-833.)，并进行改进。所有的操作步骤除特殊说明均在4℃下进行，所有的试剂、仪器均需要提前预冷。具体的实验方法和实验结果如下：

(1)海桑属植物叶绿体的分离与纯化

收集30g展开不久的、健康无病虫害的海桑幼嫩叶片，放置4℃冰箱黑暗培养处理36h，以降低叶片中的淀粉含量。除去叶片的叶脉、称重，剪切成8cm²的碎片，放入制冷的榨汁机，每20g叶片样品加入80ml缓冲液a(按叶片与缓冲液a的质量体积比为1：4加入)，得到混合溶液，再加入质量体积比(交联聚乙烯吡咯烷酮的质量比混合溶液的体积)为1％交联聚乙烯吡咯烷酮，然后进行匀浆。为了防止磨样过程造成发热，低速匀浆1次20s，期间间隔20s，循环30次，用8层纱布过滤匀浆液于烧杯中。将滤液装入10ml离心管中，即可得到海桑属植物叶绿体。

(2)海桑属植物的叶绿体dna的提取与纯化

称取4g步骤(1)得到的海桑属植物叶绿体颗粒，重悬于1ml缓冲液b(缓冲液b中的sds的浓度为4％)，每管加入0.1％蛋白酶k，摇匀后56℃加热15min，期间振荡3次，使其裂解充分，得到裂解混合溶液；加入等体积酚(裂解混合溶液和酚的体积比为1：1)抽提2次，颠倒混匀，5000rpm离心5min，收集上层清液；再加入等体积的酚-氯仿(上层清液和酚-氯仿的体积比为1：1)抽提1次，静置待完全分层20min左右，吸取上层。将水相转至干净离心管中，加入1/10体积乙酸钠和2.5体积无水乙醇，-20℃过夜，沉淀dna。第二天将样品取出，13000rpm，15min离心，回收dna，倒掉上清，加入1ml75％乙醇洗涤，13000rpm，2min离心，开盖室温静置15min，防止残留的乙醇对dna电泳的影响。沉淀溶于50～150ulte缓冲液(65℃预热)中，在样品加入2ul浓度为300ng/ul的rnase消化1.5h，-20℃保存。

实施例2海桑属植物叶绿体的荧光显微观察

1、实验方法

将实施例1中步骤(1)制备得到的海桑属植物叶绿体的滤液，分别在100×g、200×g、300×g的离心条件下离心3min，上清液转移至10ml新管中，取5ul沉淀，在荧光显微镜(10×目镜、40×物镜)下进行镜检。

2、实验结果

海桑属植物叶绿体在不同离心条件下的荧光显微镜镜检结果如图1所示，可以看出，在荧光显微镜下，可以清楚地看到球状、完整的红色叶绿体颗粒，其大小集中分布在200μm左右，在100×g、200×g、300×g离心条件下，叶绿体数量依次增多，其中，100×g离心条件下得到的海桑属植物叶绿体数量较少，且大部分杂质已被去除；300×g离心条件下的叶绿体数量最多。

实施例3海桑属植物叶绿体的完整性检测

1、实验方法

根据实施例2的荧光显微观察结果，取实施例2中100×g离心条件下得到的海桑属植物叶绿体，上清5000×g离心5min，弃上清，留沉淀，取5ul沉淀在荧光显微镜(10×目镜、40×物镜)下进行镜检。

2、实验结果

在100×g离心条件下得到的海桑属植物叶绿体的完整性检测结果如图2所示，可以看出，未发现细胞核，得到了大量的、高纯度的海桑属植物叶绿体，且叶绿体均保持完整。

实施例4海桑属植物的叶绿体dna的电泳检测

1、实验方法

取5ul实施例1制备得到的海桑属植物的叶绿体dna(未改进)，另外，取5ul实施例1制备得到的海桑属植物的叶绿体dna，加入2ul浓度为300ng/ul的rnase消化1.5h(改进后)，均在0.8％琼脂糖凝胶上用80v电泳45min后，置于凝胶成像电泳系统观察结果。

2、实验结果

海桑属植物的叶绿体dna的电泳检测结果如图3所示，可以看出，未改进的方法制备得到的海桑属植物的叶绿体dna的电泳检测结果中，除大片段以外，还出现小片段条带，分析可能是dnase或rnase污染，同时也说明提取的海桑属植物的叶绿体dna不纯，且含量很低；而改进后的方法制备得到的海桑属植物的叶绿体dna的电泳检测结果中，条带为清晰、明亮、单一的大片段，结果说明，加入rnase后，避免了rna污染，同时也说明提取的海桑属植物的叶绿体dna的质量好，纯度高。

实施例5海桑属植物的叶绿体dna的od值检测

1、实验方法

取5ul实施例1制备得到的海桑属植物的叶绿体dna(未改进)，另外，取5ul实施例1制备得到的海桑属植物的叶绿体dna，加入2ul浓度为300ng/ul的rnase消化1.5h(改进后)，分别进行od值检测。

2、实验结果

海桑属植物的叶绿体dna的od值检测结果如表1所示，可以看出，未改进的方法制备得到的海桑属植物的叶绿体dna的a260nm/a280nm小于1.8，a260nm/a320nm小于2.0，且质量浓度较低，分别为388.6ng/ul和342.1ng/ul，说明未改进的方法制备得到的海桑属植物的叶绿体dna的纯度较低，含有rna、蛋白质、多酚类、盐试剂以及有机溶剂等的污染；而改进后的方法制备得到的海桑属植物的叶绿体dna的a260nm/a280nm为1.8～1.9，a260nm/a320nm大于2.0，且质量浓度1253.6ng/ul和696.9ng/ul，说明改进后的方法制备得到的海桑属植物的叶绿体dna的质量高、纯度高。

表1海桑属植物的叶绿体dna的od值检测结果

注：“a1”、“a2”均代表未改进的方法制备得到的海桑属植物的叶绿体dna；“b1”、“b2”均代表改进后的方法制备得到的海桑属植物的叶绿体dna。

因此，本发明制备得到了大量完整性好的海桑属植物叶绿体，并成功提取分离获得了质量高、纯度高的海桑属植物的叶绿体dna。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。