一种快速检测罗汉果小西葫芦黄化花叶病毒的方法与流程

本发明涉及植物病毒检测领域，特别涉及一种快速检测罗汉果小西葫芦黄化花叶病毒的方法。
背景技术：
：罗汉果(siraitiagrosvenorii)为广西特有的一种葫芦科作物，具有珍贵的药用功能和甜味剂功能，由于罗汉果具有药用和食用的功能，因此罗汉果在国内外都受到广泛的欢迎。日渐增大的市场需求促进农民种植罗汉果的积极性，使得罗汉果种植面积迅速增加，罗汉果病虫害种类也随着快速增长的罗汉果种植面积变得越来越多，对产量和质量的影响程度也开始日益增大。罗汉果病毒病是重要的罗汉果病害之一，其严重发生不仅影响罗汉果的产量同样也影响罗汉果的质量，大大降低了罗汉果的经济效益。林纬等调查表明，以罗汉果种薯作为种苗的传统罗汉果种植，其病毒病的发病率甚至可达到100％，以脱毒组培苗种作为种苗种植的罗汉果其发病率也可达到63％，受害罗汉果植株的产果量可减少50％以上，并产生大量次果，导致罗汉果品质下降。1995年，陈振光通过浸出法以pta负染进行电镜观察，结果表明罗汉果花叶病病原为一种线状病毒。廖咏梅和秦碧霞分别用分子生物学和血清学方法鉴定出罗汉果花叶病的另一种病毒病原为zymv。到目前为止，已知罗汉果花叶病的病原病毒有zymv、prsv、wmv三种。白1973年及1979年分别在意大利北部和法国发现zymv以来，在全球50多个国家都已发现和报道了该病毒，其地域涵盖南极洲以外的各大洲，其气候条件覆盖热带到温带。当前，zymv已成为罗汉果病毒病重要病原病毒之一。zymv已成为危害罗汉果生产最主要的病毒之一，而加强检测、快速及时地鉴定田间zymv发生情况是防治该种病毒的首要任务。桂林为我国主要的罗汉果生产区，其病毒病危害较为严重，因此建立快速高效的zymv鉴定方法，对明确罗汉果病毒病的危害程度必不可少。目前，zymv的检测方法主要有生物学检测、电子显微检测、血清学检测和分子生物学检测4种方法。分子生物学检测方法因其重复性好、检测时间短、灵敏度和精确度高等特点被广泛应用于zymv的检测，一般根据zymv相对保守的外壳蛋白(cp)序列设计引物进行rt-pcr检测，随后又开发出了能够同时检测多个病毒的多重rt-pcr。此后，又根据zymv保守基因序列的差异性相继开发出基因芯片技术、分子杂交技术以及一维电泳肽指纹技术等，大大提高了对zymv种群内部的辨识度和灵敏度。但基因芯片技术、分子杂交技术操作复杂、成本较高，虽然rt-pcr技术已有报道，但由于引物设计不合理，检测不够灵敏，结果不可靠，出现假阳性。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述现有技术之不足，提供一种快速检测罗汉果小西葫芦黄化花叶病毒的方法，显著提高罗汉果小西葫芦黄化花叶病毒检测的灵敏性。本发明的目的是通过下述方案来实现的：本发明提供一种用于快速检测罗汉果小西葫芦黄化花叶病毒的引物体系，其特征在于，所述的方法采用包括以下任一引物对进行pcr检测：引物对1zv1：其核苷酸序列如sedidno.1所示；zv2：其核苷酸序列如sedidno.2所示；引物对2zv3：其核苷酸序列如sedidno.3所示；zv4：其核苷酸序列如sedidno.4所示；引物对3zv5：其核苷酸序列如sedidno.5所示；zv6：其核苷酸序列如sedidno.6所示；引物对4zv7：其核苷酸序列如sedidno.7所示；zv8：其核苷酸序列如sedidno.8所示；引物对5zv7：其核苷酸序列如sedidno.7所示；zv9：其核苷酸序列如sedidno.9所示；优选地，一种利用上述任一引物对快速检测罗汉果小西葫芦黄化花叶病毒的方法，包括如下步骤：1)提取待测罗汉果的总rna；2)以所提取的总rna为模板，反转录合成第一链cdna；3)以步骤2)得到的cdna样品为模板，采用上述的任一引物对进行pcr，得到扩增产物，检测扩增产物的长度；4)根据扩增产物目标片段的长度判断是否感染小西葫芦黄化花叶病毒，若所述扩增产物长度与目标片段的长度相符，则所述待测罗汉果感染小西葫芦黄化花叶病毒；优选地，所述引物对1目标片段的长度为222bp；优选地，所述引物对2目标片段的长度为216bp；优选地，所述引物对3目标片段的长度为213bp；优选地，所述引物对4目标片段的长度为219bp；优选地，所述引物对5目标片段的长度为216bp；优选地，所述pcr体系为25μl，包含：ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，第一链cdna1μl，dntp1μl，引物对2μl，extaq聚合酶0.2μl；优选地，所述pcr反应的条件为：95℃5min，然后95℃30sec，56℃30sec72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。本发明通过根据目前发现的罗汉果小西葫芦黄化花叶病毒dna序列，在ncbi核酸数据库找到大量高度同源病毒序列，把已知罗汉果病源病毒dna与从数据库找到的病毒同源序列进行比对，找到高度保守区。在dna高度保守区域设计pcr引物，根据所设计引物，优化pcr参数，快速检测目前在罗汉果植株小西葫芦黄化花叶病毒(zymv)，新方法灵敏度高，结果可靠，假阳性、假阴性几率为零。本发明的有益效果：1、本发明通过深入分析罗汉果小西葫芦黄化花叶病毒核酸序列特征，在其最保守区域设计了不同以往的新的引物对，避开某些变异株的变异区，预期产物特异性强、敏感性高、重复性好，假阳性、假阴性几率为零。2、克服了传统方法无法在移栽前检定并及时去除还没有产生症状的小西葫芦黄化花叶病毒种苗等弊端，避免了把混在健康种苗群体里面的带毒种苗移栽大田，增加罗汉果种植区小西葫芦黄化花叶病毒传布的风险；同时，相对于传统的基因芯片技术、分子杂交技术，本发明检测成本低、检测周期短，可实现幼苗期罗汉果小西葫芦黄化花叶病毒的快速检测。附图说明图1.罗汉果叶片总rna样品的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1-5为不同的罗汉果总rna样品。图2不同引物对pcr扩增小西葫芦黄化花叶病毒的特异性比较。其中，泳道1：zv1/zv2；泳道2：zv3/zv4；泳道3：zv5/zv6；泳道4：zv7/zv8；泳道5：zv7/zv9；n：pcr阴性对照；m：dna条带长度标记。图3pcr检测不同罗汉果植株小西葫芦黄化花叶病毒。其中，泳道1-10为10个不同罗汉果样品；p1和p2:zymv感染植株对照，n：无毒植株对照，m：dna长度标记，其中最亮的dna条带为400bp。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。实施例一1)检测引物的设计根据genbank中zymv外壳蛋白基因核苷酸序列保守区设计检测引物，正向引物zv1：catgccgaggtatggtttgcttcg，反向引物zv2：acatcacgtgcagtgtgccgttca，预期特异性产物的长度为222bp。2)罗汉果种苗总rna提取称取0.1g叶片置于研钵中，液氮下研磨至粉末状，迅速转移到预冷的1.5mlep管中；加入600μltrizol裂解液，迅速混匀，室温静置10min；加入200μl氯仿，迅速混匀，置于室温中10mim；4℃10000rpm，15min；将上清转移到一个新的无rnase的ep管内，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置15min；4℃下，12000rpm，离心10min；弃上清，75％乙醇洗2次；室温中晾置10min，加入20μldepc处理水，轻轻敲打，溶解总rna。获得的罗汉果叶片总rna置于-80℃中保存。3)pcr反应第一链cdna合成体系参考revertaidfirststrandcdnasynthesiskit所提供的方法。pcr体系为25μl，其中ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，模板(合成的第一链cdna)1μl，dntp1μl，正向引物zv11μl，反向引物zv21μl，extaq聚合酶0.2μl。反应的参数为：95℃5min，然后95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。4)pcr产物的电泳将步骤3)的pcr扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，每个泳道上样量为5μl，电压为70v，并以感染小西葫芦黄化花叶病毒的罗汉果叶片作为阳性对照样品。5)病毒感染的判断若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有222bp的dna片段，则结果为阳性，待测罗汉果感染小西葫芦黄化花叶病毒。若阳性对照样品的扩增产物含有222bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有222bp的dna片段，则结果为阴性，待测罗汉果不感染或候选不感染小西葫芦黄化花叶病毒。若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。实施例二1)检测引物的设计根据genbank中zymv外壳蛋白基因核苷酸序列保守区设计检测引物，正向引物zv3：atacatgccgaggtatggtttgcttcg，反向引物zv4：gcagtgtgccgttcagtgtcttcg，预期特异性产物的长度为216bp。2)罗汉果种苗总rna提取称取0.1g叶片置于研钵中，液氮下研磨至粉末状，迅速转移到预冷的1.5mlep管中；加入600μltrizol裂解液，迅速混匀，室温静置10min；加入200μl氯仿，迅速混匀，置于室温中10mim；4℃10000rpm，15min；将上清转移到一个新的无rnase的ep管内，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置15min；4℃下，12000rpm，离心10min；弃上清，75％乙醇洗2次；室温中晾置10min，加入20μldepc处理水，轻轻敲打，溶解总rna。获得的罗汉果叶片总rna置于-80℃中保存。3)pcr反应第一链cdna合成体系参考revertaidfirststrandcdnasynthesiskit所提供的方法。pcr体系为25μl，其中ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，模板(合成的第一链cdna)1μl，dntp1μl，正向引物zv11μl，反向引物zv21μl，extaq聚合酶0.2μl。反应的参数为：95℃5min，然后95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。4)pcr产物的电泳将步骤3)的pcr扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，每个泳道上样量为5μl，电压为70v，并以感染小西葫芦黄化花叶病毒的罗汉果叶片作为阳性对照样品。5)病毒感染的判断若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有216bp的dna片段，则结果为阳性，待测罗汉果感染小西葫芦黄化花叶病毒。若阳性对照样品的扩增产物含有216bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有216bp的dna片段，则结果为阴性，待测罗汉果不感染或候选不感染小西葫芦黄化花叶病毒。若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。实施例三1)检测引物的设计根据genbank中zymv外壳蛋白基因核苷酸序列保守区设计检测引物，正向引物zv5：catgccgaggtatggtttgcttc，反向引物zv6：gcagtgtgccgttcagtgtcttc，预期特异性产物的长度为213bp。2)罗汉果种苗总rna提取称取0.1g叶片置于研钵中，液氮下研磨至粉末状，迅速转移到预冷的1.5mlep管中；加入600μltrizol裂解液，迅速混匀，室温静置10min；加入200μl氯仿，迅速混匀，置于室温中10mim；4℃10000rpm，15min；将上清转移到一个新的无rnase的ep管内，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置15min；4℃下，12000rpm，离心10min；弃上清，75％乙醇洗2次；室温中晾置10min，加入20μldepc处理水，轻轻敲打，溶解总rna。获得的罗汉果叶片总rna置于-80℃中保存。3)pcr反应第一链cdna合成体系参考revertaidfirststrandcdnasynthesiskit所提供的方法。pcr体系为25μl，其中ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，模板(合成的第一链cdna)1μl，dntp1μl，正向引物zv11μl，反向引物zv21μl，extaq聚合酶0.2μl。反应的参数为：95℃5min，然后95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。4)pcr产物的电泳将步骤3)的pcr扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，每个泳道上样量为5μl，电压为70v，并以感染小西葫芦黄化花叶病毒的罗汉果叶片作为阳性对照样品。5)病毒感染的判断若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有213bp的dna片段，则结果为阳性，待测罗汉果感染小西葫芦黄化花叶病毒。若阳性对照样品的扩增产物含有213bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有213bp的dna片段，则结果为阴性，待测罗汉果不感染或候选不感染小西葫芦黄化花叶病毒。若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。实施例四1)检测引物的设计根据genbank中zymv外壳蛋白基因核苷酸序列保守区设计检测引物，正向引物zv7：atacatgccgaggtatggtttgcttc，反向引物zv8：cgtgcagtgtgccgttcagtgtcttc，预期特异性产物的长度为219bp。2)罗汉果种苗总rna提取称取0.1g叶片置于研钵中，液氮下研磨至粉末状，迅速转移到预冷的1.5mlep管中；加入600μltrizol裂解液，迅速混匀，室温静置10min；加入200μl氯仿，迅速混匀，置于室温中10mim；4℃10000rpm，15min；将上清转移到一个新的无rnase的ep管内，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置15min；4℃下，12000rpm，离心10min；弃上清，75％乙醇洗2次；室温中晾置10min，加入20μldepc处理水，轻轻敲打，溶解总rna。获得的罗汉果叶片总rna置于-80℃中保存。3)pcr反应第一链cdna合成体系参考revertaidfirststrandcdnasynthesiskit所提供的方法。pcr体系为25μl，其中ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，模板(合成的第一链cdna)1μl，dntp1μl，正向引物zv11μl，反向引物zv21μl，extaq聚合酶0.2μl。反应的参数为：95℃5min，然后95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。4)pcr产物的电泳将步骤3)的pcr扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，每个泳道上样量为5μl，电压为70v，并以感染小西葫芦黄化花叶病毒的罗汉果叶片作为阳性对照样品。5)病毒感染的判断若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有219bp的dna片段，则结果为阳性，待测罗汉果感染小西葫芦黄化花叶病毒。若阳性对照样品的扩增产物含有219bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有219bp的dna片段，则结果为阴性，待测罗汉果不感染或候选不感染小西葫芦黄化花叶病毒。若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。实施例五1)检测引物的设计根据genbank中zymv外壳蛋白基因核苷酸序列保守区设计检测引物，正向引物zv7：atacatgccgaggtatggtttgcttc，反向引物zv9：gcagtgtgccgttcagtgtcttcgct，预期特异性产物的长度为216bp。2)罗汉果种苗总rna提取称取0.1g叶片置于研钵中，液氮下研磨至粉末状，迅速转移到预冷的1.5mlep管中；加入600μltrizol裂解液，迅速混匀，室温静置10min；加入200μl氯仿，迅速混匀，置于室温中10mim；4℃10000rpm，15min；将上清转移到一个新的无rnase的ep管内，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置15min；4℃下，12000rpm，离心10min；弃上清，75％乙醇洗2次；室温中晾置10min，加入20μldepc处理水，轻轻敲打，溶解总rna。获得的罗汉果叶片总rna置于-80℃中保存。3)pcr反应第一链cdna合成体系参考revertaidfirststrandcdnasynthesiskit所提供的方法。pcr体系为25μl，其中ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，模板(合成的第一链cdna)1μl，dntp1μl，正向引物zv11μl，反向引物zv21μl，extaq聚合酶0.2μl。反应的参数为：95℃5min，然后95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。4)pcr产物的电泳将步骤3)的pcr扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，每个泳道上样量为5μl，电压为70v，并以感染小西葫芦黄化花叶病毒的罗汉果叶片作为阳性对照样品。5)病毒感染的判断若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有216bp的dna片段，则结果为阳性，待测罗汉果感染小西葫芦黄化花叶病毒。若阳性对照样品的扩增产物含有216bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有216bp的dna片段，则结果为阴性，待测罗汉果不感染或候选不感染小西葫芦黄化花叶病毒。若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。对比例1用于评价本发明检测结果的假阳性概率对比例1参考朱英芝等发表的文章“罗汉果种子传播小西葫芦黄化花叶病毒的检测”，引物使用其文中提及的序列，扩增阶段并参考其pcr的参数，其他条件相同，具体如下：1)检测引物的设计根据genbank中zymv外壳蛋白基因核苷酸序列保守区设计检测引物，zymvcp(-)：gactacggcactcctggaccac，zymvcp(+)：ggggagcggagacaagtgaactg，预期特异性产物的长度为1074bp。2)总rna提取称取0.1g叶片置于研钵中，液氮下研磨至粉末状，迅速转移到预冷的1.5mlep管中；加入600μltrizol裂解液，迅速混匀，室温静置10min；加入200μl氯仿，迅速混匀，置于室温中10mim；4℃10000rpm，15min；将上清转移到一个新的无rnase的ep管内，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置15min；4℃下，12000rpm，离心10min；弃上清，75％乙醇洗2次；室温中晾置10min，加入20μldepc处理水，轻轻敲打，溶解总rna。获得的罗汉果叶片总rna置于-80℃中保存。3)pcr反应第一链cdna合成体系参考revertaidfirststrandcdnasynthesiskit所提供的方法。pcr体系为25μl，其中ddh2o17μl，10×pcrbuffer2.5μl，模板(合成的第一链cdna)1μl，dntp1μl，正向引物zymvcp(+)1μl，反向引物zymvcp(-)1μl，extaq聚合酶0.2μl。反应的参数为：反应的参数为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min共30个循环；最后72℃延伸10min。4)pcr产物的电泳将步骤3)的pcr扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，每个泳道上样量为5μl，电压为70v，并以感染小西葫芦黄化花叶病毒的罗汉果叶片作为阳性对照样品。5)病毒感染的判断若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有1074bp的dna片段，则结果为阳性，待测罗汉果感染小西葫芦黄化花叶病毒。若阳性对照样品的扩增产物含有1074bp的dna片段，而检测样品的扩增产物不含有1074bp的dna片段，则结果为阴性，待测罗汉果不感染或候选不感染小西葫芦黄化花叶病毒。若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。结果与分析将实施例1～5检测的结果，使用其他引物交叉验证，基因芯片技术、分子杂交技术复查，同时结合感染后期植株表现出来的表观病症来判断，统计其假阳性、假阴性概率，结果见下表：实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5样品数1510202015符合率(％)100100100100100假阳性率(％)0％0％0％0％0％假阴性率(％)0％0％0％0％0％由上表可以看出，根据本发明选择的zymv病毒基因组最保守区而设计的引物对可以特异性扩增病毒dna，能够灵敏地检测出罗汉果幼苗的病毒感染情况。如图2所示的，本发明提供的5个引物对可以从zymv感染的罗汉果幼苗扩增得到相应大小的病毒dna片段，而在无病毒感染幼苗没有扩增得到dna条带。表明这些引物对用于罗汉果zymv病毒的检测特异性好。如图3所示，利用引物zv1和zv2对来自10个罗汉果种苗的cdna样品进行pcr检测。除了样品5外，其它9个样品都扩增出一条222bp的dna条带，表明对应于样品5的罗汉果种苗为无毒苗；对应于另外这9个样品的罗汉果种苗感染了zymv病毒，需要通过脱病毒处理得到无毒种苗才可以进行扩繁和移栽大田种植。同时，为了防止漏检，在对阴性的样品采用elisa法及cdna分子探针法进行复查，发现检测结果与5个引物对的检测相符，假阴性的概率为零；因此，本发明的精确度高。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>桂林莱茵生物科技股份有限公司<120>一种快速检测罗汉果小西葫芦黄化花叶病毒的方法<130>2019<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>人工系列(人工序列)<400>1catgccgaggtatggtttgcttcg24<210>2<211>24<212>dna<213>人工系列(人工序列)<400>2acatcacgtgcagtgtgccgttca24<210>3<211>27<212>dna<213>人工系列(人工序列)<400>3atacatgccgaggtatggtttgcttcg27<210>4<211>24<212>dna<213>人工系列(人工序列)<400>4gcagtgtgccgttcagtgtcttcg24<210>5<211>23<212>dna<213>人工系列(人工序列)<400>5catgccgaggtatggtttgcttc23<210>6<211>23<212>dna<213>人工系列(人工序列)<400>6gcagtgtgccgttcagtgtcttc23<210>7<211>26<212>dna<213>人工系列(人工序列)<400>7atacatgccgaggtatggtttgcttc26<210>8<211>26<212>dna<213>人工系列(人工序列)<400>8cgtgcagtgtgccgttcagtgtcttc26<210>9<211>26<212>dna<213>人工系列(人工序列)<400>9gcagtgtgccgttcagtgtcttcgct26当前第1页12