一种维生素k2(MK-7型)的发酵方法与流程

技术领域：
：本发明属于微生物发酵
技术领域：
，尤其涉及一种维生素k2(mk-7型)的发酵方法。
背景技术：
：k族维生素是人体必需的四种脂溶性维生素之一，按照来源不同可以分为k1和k2两种，其中，k1主要来源于植物，也称叶绿醌，k2主要来源于微生物也称甲萘醌。因其在食品中量极少。素有“铂金维生素”之称，在骨质疏松症的预防和治疗方面具有显著的效果，被科为“第四代抗骨质疏检产品”；还可防止肝硬化肝纤推化转化为肝癌，促进肝细胞再生；同时在预贴和治疗的金森在方面也其行定的疗效。天然维生素k2，为mk-7型，仅能通过微生物发酵法获得，相比通过化学合成的维生素k2，天然维生素k2活性更高。为满足天然维生素k2不断增长的市场需求、克服化学法来源维生素k2的缺点，市场上急需通过微生物发酵规模化生产天然维生素k2。目前，利用微生物发酵生产维生素k2主要包括利用纳豆芽孢杆菌、黄杆菌、乳酸菌等，本发明所采用的菌种为纳豆芽孢杆菌，属于枯草牙孢杆菌(bacillussubtilis)，该菌为美国fda公布的40种益生菌之一，食用安全，是维生素k2生产的优良菌种。但是，采用纳豆芽孢杆菌发酵发酵水平不高，cn201410472873.2，cn104328064a采用新型供氧策略优化菌种发酵工艺，并进行发酵罐放大，最终维生素k2产量达到60.54mg/l。此外，维生素k2产业化难度较大，目前报道较少。技术实现要素：针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种维生素k2(mk-7型)的发酵方法。本发明的一种维生素k2(mk-7型)的发酵方法，使用的菌种为纳豆芽孢杆菌，包括以下步骤：(1)将保存在甘油管的菌株接入固体培养基中进行菌种活化，37℃培养箱中培养，20～28h，连续活化两代，固体培养基配方为：葡萄糖3％l，蛋白胨2％，nacl0.5％，酵母膏0.5％，琼脂2％，溶剂为水；(2)利用灭菌后的生理盐水将斜面上的菌洗下，接入装有种子培养基的种子罐中，种量0.1％(v/v)，通气量0.5～1.0vvm，搅拌转速200～400rpm，罐温35～37℃，培养18～24h，获得种子液，种子培养基配方为葡萄糖1-5％，蛋白胨2-8％，k2hpo40.1-0.2％，lkh2po40.01-0.1％nacl0.2-0.4％，mgso4·7h2o0.01-0.1％，溶剂为水；(3)将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量5～10％(v/v)，发酵过程中温度35～37℃，起始通气量0.5～2.0vvm，罐压0.04～0.07mpa，培养72-120h，发酵生产维生素k2，发酵培养基配方为葡萄糖4-6.0％，甘油1-4.0％，酵母粉0.5-1.5％，大豆蛋白胨0.5-1.5％，nacl0.2-0.35％，kh2po40.05-0.1％，mgso4·7h2o0.05-0.15％，溶剂为水；所述发酵方法采用浓配方高密度发酵，该方法的发酵条件为：s1、发酵培养基配方:葡萄糖4-6.0％，甘油1-4.0％，酵母粉0.5-1.5％，大豆蛋白胨0.5-1.5％，nacl0.2-0.35％，kh2po40.05-0.1％，mgso4·7h2o0.05-0.15％，溶剂为水；s2、发酵过程中温度35～37℃，起始通气量0.5～0.8vvm，起始罐压0.04～0.06mpa，起始搅拌转速100～250rpm；s3、分阶段溶氧控制：发酵培养基灭菌至121℃保压时，校正溶氧0％，移种后刚开始发酵培养时校正溶氧100％，发酵过程中逐渐调高通气量、转速与罐压使溶氧在0-10h不低于30％，在11-24h控件控制5-15％，在25-60h控制20～40％，在61h后控制40～60％之间，转速最高转速最高650rpm，通气量最大2.0vvm，最小0.5vvm，罐压最高0.07mpa、最小0.04mpa；s4、分阶段严格控制ph：发酵0-10h，开始补加氨水，控制ph6.5～6.8，发酵10-24h，补加磷酸或氨水，控制ph7.0～7.2，发酵24-60h，补加磷酸或氨水，控制ph7.5～7.8，发酵60h后，补加磷酸或氨水，控制ph8.0～8.5；s5、发酵24h后，开始流加葡萄糖，使发酵液总糖浓度控制在0.3-0.7％，直到发酵结束；s6、发酵培养期72-120h后放罐。优选的，所述发酵培养基优选配方为葡萄糖6.0％，甘油3.0％，酵母粉1.2％，大豆蛋白胨1.2％，nacl0.28％，kh2po40.05％，mgso4·7h2o0.05％，溶剂为水，ph7.0～7.2。本发明有益效果：本发明提供一种维生素k2(mk-7型)的发酵方法，在该方法中使用的菌种为纳豆芽孢杆菌，本发明培养基采用浓配方，发酵过程中流加葡萄糖，能够有效补充菌体生长所需的营养；发酵过程中补加磷酸、氨水，分阶段分阶段严格控制ph，能有效保障菌体生长代谢最适ph；发酵过程中，通过调节转速、空气流量、罐压分阶段控制溶氧，能有效提高氧的利用率减少氧对菌体细胞损伤。流加葡萄糖后，发酵液总糖浓度控制在0.3-0.7％左右，在这个范围内菌丝的正常生长且代谢稳定，过低和过高都影响正常代谢。现有维生素k2(mk-7型)的发酵技术中，维生素k2(mk-7型)的发酵单位约为60mg/l左右，本发明发酵方法可将发酵单位提高至80mg/l。因此，本发明既能显著提高维生素k2(mk-7型)的发酵单位，又为维生素k2(mk-7型)的发酵产业化提供一个良好的方法。附图说明：图1为本发明的工艺流程图。具体实施方式：为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过具体实施例来描述本发明。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。本实施例的一种一种维生素k2(mk-7型)的发酵方法，使用的菌种为纳豆芽孢杆菌，包括以下步骤：(1)将保存在甘油管的菌株接入固体培养基中进行菌种活化，37℃培养箱中培养，20～28h，连续活化两代，固体培养基配方为：葡萄糖3％l，蛋白胨2％，nacl0.5％，酵母膏0.5％，琼脂2％，溶剂为水；(2)利用灭菌后的生理盐水将斜面上的菌洗下，接入装有种子培养基的种子罐中，种量0.1％(v/v)，通气量0.5～1.0vvm，搅拌转速200～400rpm，罐温35～37℃，培养18～24h，获得种子液，种子培养基配方为葡萄糖1-5％，蛋白胨2-8％，k2hpo40.1-0.2％，lkh2po40.01-0.1％nacl0.2-0.4％，mgso4·7h2o0.01-0.1％，溶剂为水；(3)将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量5～10％(v/v)，发酵过程中温度35～37℃，起始通气量0.5～2.0vvm，罐压0.04～0.07mpa，培养72-120h，发酵生产维生素k2，发酵培养基配方为葡萄糖4-6.0％，甘油1-4.0％，酵母粉0.5-1.5％，大豆蛋白胨0.5-1.5％，nacl0.2-0.35％，kh2po40.05-0.1％，mgso4·7h2o0.05-0.15％，溶剂为水；所述发酵方法采用浓配方高密度发酵，该方法的发酵条件为：s1、发酵培养基配方:葡萄糖4-6.0％，甘油1-4.0％，酵母粉0.5-1.5％，大豆蛋白胨0.5-1.5％，nacl0.2-0.35％，kh2po40.05-0.1％，mgso4·7h2o0.05-0.15％，溶剂为水；s2、发酵过程中温度35～37℃，起始通气量0.5～0.8vvm，起始罐压0.04～0.06mpa，起始搅拌转速100～250rpm；s3、分阶段溶氧控制：发酵培养基灭菌至121℃保压时，校正溶氧0％，移种后刚开始发酵培养时校正溶氧100％，发酵过程中逐渐调高通气量、转速与罐压使溶氧在0-10h不低于30％，在11-24h控件控制5-15％，在25-60h控制20～40％，在61h后控制40～60％之间，转速最高转速最高650rpm，通气量最大2.0vvm，最小0.5vvm，罐压最高0.07mpa、最小0.04mpa；s4、分阶段严格控制ph：发酵0-10h，开始补加氨水，控制ph6.5～6.8，发酵10-24h，补加磷酸或氨水，控制ph7.0～7.2，发酵24-60h，补加磷酸或氨水，控制ph7.5～7.8，发酵60h后，补加磷酸或氨水，控制ph8.0～8.5；s5、发酵24h后，开始流加葡萄糖，使发酵液总糖浓度控制在0.3-0.7％，直到发酵结束；s6、发酵培养期72-120h后放罐。具体地，所述发酵培养基优选配方为葡萄糖6.0％，甘油3.0％，酵母粉1.2％，大豆蛋白胨1.2％，nacl0.28％，kh2po40.05％，mgso4·7h2o0.05％，溶剂为水，ph7.0～7.2。实施例1：不同发酵培养基对维生素k2(mk-7型)的发酵单位的影响：发酵条件如下:(1)发酵培养基1：葡萄糖4.0％，甘油1％，酵母粉0.5％，大豆蛋白胨0.5％，nacl0.2％，kh2po40.05％，mgso4·7h2o0.05％，溶剂为水，ph7.0～7.2。发酵培养基2：葡萄糖6.0％，甘油4.0％，酵母粉1.5％，大豆蛋白胨1.5％，nacl0.35％，kh2po40.1％，mgso4·7h2o0.15％，溶剂为水，ph7.0～7.2。发酵培养基3：葡萄糖5.0％，甘油3.0％，酵母粉1.0％，大豆蛋白胨1.0％，nacl0.3％，kh2po40.75％，mgso4·7h2o0.10％，溶剂为水，ph7.0～7.2。发酵培养基4：葡萄糖6.0％，甘油3.0％，酵母粉1.2％，大豆蛋白胨1.2％，nacl0.28％，kh2po40.05％，mgso4·7h2o0.05％，溶剂为水，ph7.0～7.2。(2)发酵过程中温度35～37℃，起始通气量0.5～0.8vvm，起始罐压0.04～0.06mpa，起始搅拌转速100～250rpm。(3)分阶段溶氧控制：发酵培养基灭菌至121℃保压时，校正溶氧0％，移种后刚开始发酵培养时校正溶氧100％；发酵过程中逐渐调高通气量、转速与罐压使溶氧在0-10h不低于30％，在11-24h控件控制5-15％，在25-60h控制20～-40％，在61h后控制40～60％之间；转速最高转速最高650rpm，通气量最大2.0vvm、最小0.5vvm，罐压最高0.07mpa、最小0.04mpa。(4)分阶段严格控制ph：发酵0-10h，开始补加氨水，控制ph6.5～6.8；发酵10-24h，补加磷酸或氨水，控制ph7.0～7.2；发酵24-60h，补加磷酸或氨水，控制ph7.5～7.8；发酵60h后，补加磷酸或氨水，控制ph8.0～8.5。(5)发酵24h后，开始流加葡萄糖，使发酵液总糖浓度控制在0.3-0.7％，直到发酵结束。(6)发酵培养期72-120h后放罐。实验结果如下表1：表1：维生素k2(mk-7型)发酵结果：表1的实验结果表明：采用发酵培养基配方为葡萄糖4-6.0％；甘油1-4.0％，酵母粉0.5-1.5％，大豆蛋白胨0.5-1.5％，nacl0.2-0.35％，kh2po40.05-0.1％，mgso4·7h2o0.05-0.15％，溶剂为水，能显著提高维生素k2(mk-7型)的发酵单位。其中，发酵培养基优选配方为：葡萄糖6.0％，甘油3.0％，酵母粉1.2％，大豆蛋白胨1.2％，nacl0.28％，kh2po40.05％，mgso4·7h2o0.05％，溶剂为水。实施例2：不同溶氧控制条件对维生素k2(mk-7型)的发酵单位的影响：发酵条件如下:(1)发酵培养基：葡萄糖6.0％，甘油3.0％，酵母粉1.2％，大豆蛋白胨1.2％，nacl0.28％，kh2po40.05％，mgso4·7h2o0.05％，溶剂为水，ph7.0～7.2。(2)发酵过程中温度35～37℃，起始通气量0.5～0.8vvm，起始罐压0.04～0.06mpa，起始搅拌转速100～250rpm。(3)实验1分阶段溶氧控制：发酵培养基灭菌至121℃保压时，校正溶氧0％，移种后刚开始发酵培养时校正溶氧100％；发酵过程中通过调控通气量、转速与罐压使溶氧在0-10h不低于30％，在11-24h控件控制5-15％，在25-60h控制20～-40％，在61h后控制40～60％之间；转速最高转速最高650rpm，通气量最大2.0vvm、最小0.5vvm，罐压最高0.07mpa、最小0.04mpa。实验2分阶段溶氧控制：发酵培养基灭菌至121℃保压时，校正溶氧0％，移种后刚开始发酵培养时校正溶氧100％；发酵过程中通过调控通气量、转速与罐压使溶氧在0-10h不低于30％，在11-24h控件控制0-5％，在25-60h控制20～-40％，在61h后控制40～60％之间；转速最高转速最高650rpm，通气量最大2.0vvm、最小0.5vvm，罐压最高0.07mpa、最小0.04mpa。实验3分阶段溶氧控制：发酵培养基灭菌至121℃保压时，校正溶氧0％，移种后刚开始发酵培养时校正溶氧100％；发酵过程中通过调控通气量、转速与罐压使溶氧在0-10h不低于30％，在11-24h控件控制5-15％，在25-60h控制5～-15％，在61h后控制40～60％之间；转速最高转速最高650rpm，通气量最大2.0vvm、最小0.5vvm，罐压最高0.07mpa、最小0.04mpa。实验4分阶段溶氧控制：发酵培养基灭菌至121℃保压时，校正溶氧0％，移种后刚开始发酵培养时校正溶氧100％；发酵过程中通过调控通气量、转速与罐压使溶氧在0-10h不低于30％，在11-24h控件控制5-15％，在25-60h控制20～-40％，在61h后控制20～40％之间；转速最高转速最高650rpm，通气量最大2.0vvm、最小0.5vvm，罐压最高0.07mpa、最小0.04mpa。(4)分阶段严格控制ph：发酵0-10h，开始补加氨水，控制ph6.5～6.8；发酵10-24h，补加磷酸或氨水，控制ph7.0～7.2；发酵24-60h，补加磷酸或氨水，控制ph7.5～7.8；发酵60h后，补加磷酸或氨水，控制ph8.0～8.5。(5)发酵24h后，开始流加葡萄糖，使发酵液总糖浓度控制在0.3-0.7％，直到发酵结束。(6)发酵培养期72-120h后放罐。实验结果如下表2：表2：维生素k2(mk-7型)发酵结果：表2的实验结果表明：分阶段溶氧控制能显著提高维生素k2(mk-7型)的发酵单位，分阶段溶氧控制最优选方法为：发酵培养基灭菌至121℃保压时，校正溶氧0％，移种后刚开始发酵培养时校正溶氧100％；发酵过程中通过调控通气量、转速与罐压使溶氧在0-10h不低于30％，在11-24h控件控制5-15％，在25-60h控制20～-40％，在61h后控制40～60％之间；转速最高转速最高650rpm，通气量最大2.0vvm、最小0.5vvm，罐压最高0.07mpa、最小0.04mpa。实施例3：不同ph控制条件对维生素k2(mk-7型)的发酵单位的影响：发酵条件如下:(1)发酵培养基：葡萄糖6.0％，甘油3.0％，酵母粉1.2％，大豆蛋白胨1.2％，nacl0.28％，kh2po40.05％，mgso4·7h2o0.05％，溶剂为水，ph7.0～7.2。(2)发酵过程中温度35～37℃，起始通气量0.5～0.8vvm，起始罐压0.04～0.06mpa，起始搅拌转速100～250rpm。(3)分阶段溶氧控制：发酵培养基灭菌至121℃保压时，校正溶氧0％，移种后刚开始发酵培养时校正溶氧100％；发酵过程中逐渐调高通气量、转速与罐压使溶氧在0-10h不低于30％，在11-24h控件控制5-15％，在25-60h控制20～-40％，在61h后控制40～60％之间；转速最高转速最高650rpm，通气量最大2.0vvm、最小0.5vvm，罐压最高0.07mpa、最小0.04mpa。(4)实验5分阶段严格控制ph：发酵过程全程不控ph。实验6分阶段严格控制ph：发酵0-10h，开始不补加氨水，不控ph；发酵10-24h，补加磷酸或氨水，控制ph7.0～7.2；发酵24-60h，补加磷酸或氨水，控制ph7.5～7.8；发酵60h后，补加磷酸或氨水，控制ph8.0～8.5。实验7分阶段严格控制ph：发酵0-10h，开始补加氨水，控制ph6.5～6.8；发酵10-60h，补加磷酸或氨水，控制ph7.5～7.8；发酵60h后，补加磷酸或氨水，控制ph8.0～8.5。实验8分阶段严格控制ph：发酵0-10h，开始补加氨水，控制ph7.0～7.2；发酵10-24h，补加磷酸或氨水，控制ph7.0～7.2；发酵24-60h，补加磷酸或氨水，控制ph7.5～7.8；发酵60h后，补加磷酸或氨水，控制ph8.0～8.5。(5)发酵24h后，开始流加葡萄糖，使发酵液总糖浓度控制在0.3-0.7％，直到发酵结束。(6)发酵培养期72-120h后放罐。实验结果如下表3：表3：维生素k2(mk-7型)发酵结果：项目批次发酵单位g/l体积l产量g实验1480.836.12.92实验5468.636.22.48实验6475.436.02.71实验7476.936.02.77实验8475.435.92.70表3的实验结果表明：分阶段严格控制ph能显著提高维生素k2(mk-7型)的发酵单位，分阶段严格控制ph最优选方法为：发酵0-10h，开始补加氨水，控制ph6.5～6.8；发酵10-24h，补加磷酸或氨水，控制ph7.0～7.2；发酵24-60h，补加磷酸或氨水，控制ph7.5～7.8；发酵60h后，补加磷酸或氨水，控制ph8.0～8.5。实施例4：不同发酵总糖浓度对维生素k2(mk-7型)的发酵单位的影响：发酵条件如下:(1)发酵培养基：葡萄糖6.0％，甘油3.0％，酵母粉1.2％，大豆蛋白胨1.2％，nacl0.28％，kh2po40.05％，mgso4·7h2o0.05％，溶剂为水，ph7.0～7.2。(2)发酵过程中温度35～37℃，起始通气量0.5～0.8vvm，起始罐压0.04～0.06mpa，起始搅拌转速100～250rpm。(3)分阶段溶氧控制：发酵培养基灭菌至121℃保压时，校正溶氧0％，移种后刚开始发酵培养时校正溶氧100％；发酵过程中逐渐调高通气量、转速与罐压使溶氧在0-10h不低于30％，在11-24h控件控制5-15％，在25-60h控制20～-40％，在61h后控制40～60％之间；转速最高转速最高650rpm，通气量最大2.0vvm、最小0.5vvm，罐压最高0.07mpa、最小0.04mpa。(4)分阶段严格控制ph：发酵0-10h，开始补加氨水，控制ph6.5～6.8；发酵10-24h，补加磷酸或氨水，控制ph7.0～7.2；发酵24-60h，补加磷酸或氨水，控制ph7.5～7.8；发酵60h后，补加磷酸或氨水，控制ph8.0～8.5。(5)发酵24h后，开始流加葡萄糖，使发酵液总糖浓度控制在x％，直到发酵结束。(6)发酵培养期72-120h后放罐。实验结果如下表4：表4：维生素k2(mk-7型)发酵结果：x批次发酵单位g/l体积l产量g0.2472.436.12.610.3479.936.22.890.4480.436.02.890.5481.536.02.930.6480.735.92.890.7480.336.02.89表4的实验结果表明：发酵24h后，开始流加葡萄糖，使发酵液总糖浓度控制在0.3-0.7％，直到发酵结束，能显著提高维生素k2(mk-7型)的发酵单位。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12