肌醇六磷酸酶的制作方法

本申请是中国专利申请201480014287.1的分案申请，原申请的申请日是2014年3月10日，发明名称是“肌醇六磷酸酶”。序列表此申请通过usptoefs-web服务器电子提交，如在mpep§502.05中授权并提出，并且此电子申请包括电子提交的序列表；此序列表的全部内容在此通过引用并入此申请的说明书。在电子提交的ascii(.txt)文档文件上确定序列表如下：文件名称创建日期大小sequence_listing_veren067wo_d2500_1wo2014年3月5日19.6kb发明领域提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽和编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸序列。具体而言，序列提供了具有高比活性、高热稳定性、高耐热性的肌醇六磷酸酶增加水平的表达，和肌醇六磷酸酶的各种工业用途。附图说明图1：以纯化的蛋白在肌醇六磷酸(ph5.5)上测定比活性(u/mg)。毕赤酵母表达的肌醇六磷酸酶：seqidno:8(由seqidno:7编码)、seqidno:3(由seqidno:2编码)和seqidno:6(由seqidno:5编码)，和假单胞菌表达的肌醇六磷酸酶：seqidno:3(由seqidno:1编码)和seqidno:6(由seqidno:4编码)。图2：在100mm的柠檬酸盐ph5.5+10％的山梨醇-10％的nacl中肌醇六磷酸酶seqidno:3(由seqidno:1编码)的dsc色谱图。图3：肌醇六磷酸酶在有和没有10％的山梨醇-10％的nacl的100mm柠檬酸盐ph5.5中的dsctm值(℃)。seqidno:3(由seqidno:1编码)和seqidno:6(由seqidno:4编码)为假单胞菌表达的。seqidno:3(由seqidno:2编码)、seqidno:6(由seqidno:5编码)和seqidno:8(由seqidno:7编码)为毕赤酵母表达的。图4：在4mm的肌醇六磷酸上使用britton-robinson“通用”缓冲液，肌醇六磷酸酶的ph曲线。seqidno:3(由seqidno:1编码)和seqidno:6(由seqidno:4编码)为假单胞菌表达的。seqidno:3(由seqidno:2编码)和seqidno:6(由seqidno:5编码)为毕赤酵母表达的。图5：受到sgf+胃蛋白酶处理的肌醇六磷酸酶的sds-page。seqidno:3(由seqidno:1编码)和seqidno:6(由seqidno:4编码)为假单胞菌表达的。seqidno:3(由seqidno:2表达)、seqidno:6(由seqidno:5表达)和seqidno:8(由seqidno:7表达)为毕赤酵母表达的。图6：经过sgf处理的热稳定的肌醇六磷酸酶的活性。观察到热稳定的肌醇六磷酸酶活性最小或无损失。在加入肌醇六磷酸酶之前使用ph11的缓冲液预淬灭t0样品。图7：肌醇六磷酸酶发酵(30l)的假单胞菌(p.f.)表达水平。具体实施方式肌醇六磷酸酶是磷的单酯水解酶，其催化肌醇六磷酸(肌醇六磷酸盐)水解为磷和肌醇。根据国际生物化学和分子生物学联盟(iubmb)命名委员会和bairocha.的“2000年的enzyme数据库”，nucleicacidsres28:304-305(2000)的介绍，肌醇六磷酸酶被分类为酶学委员会(ec)编号ec3.1.3.8，并且还被称为:1-肌醇六磷酸酶；肌醇六磷酸盐3-磷酸水解酶；肌醇六磷酸1-磷酸酶；肌醇六磷酸3-磷酸酶；或肌醇六磷酸6-磷酸酶。肌醇六磷酸酶还被分类为ec3.1.3.26，其也被称为:4-肌醇六磷酸酶；6-肌醇六磷酸酶(基于1l-编号系统而不是1d-编号命名)；或肌醇六磷酸6-磷酸酶。肌醇六磷酸酶还被分类为ec3.1.3.72，其也被称为5-肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶还被称为组氨酸磷酸酶(hap)；β-螺旋桨肌醇六磷酸酶；紫色酸性磷酸酶(pap)；以及蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)。肌醇六磷酸酶的替代名称对本领域技术人员将是已知的。肌醇六磷酸酶是可在动物饲料颗粒中具有作为补充物功效的酶的实例。肌醇六磷酸酶使肌醇六磷酸降解为肌醇核和一个或多个游离的磷酸盐分子。肌醇六磷酸由肌醇核组成，六个磷酸盐基团共价结合至该肌醇核。肌醇六磷酸是植物材料诸如大豆种子的成分，其用于产生用于动物的饲料颗粒，诸如非反刍动物，例如家禽、肉鸡、鸟类、鸡、蛋鸡、火鸡、鸭、鹅和飞禽(fowl)；反刍动物，例如母牛、家畜、马和羊；家猪(pig)、猪(swine)、小猪、生长猪和母猪；宠物包括但不限于：猫、狗、啮齿动物和兔子；鱼包括但不限于大马哈鱼、鲑鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类动物包括但不限于河虾和明虾。因为这些动物不能消化肌醇六磷酸，所以肌醇六磷酸具有许多有害的影响。它螯合二价阳离子，诸如钙和镁，并且它的磷酸盐对于被饲养的动物是生物学上不可利用的形式，导致需要用这些营养物补充动物饮食，尽管它们在原料中是丰富的。而且，因为这些营养物经过动物而未经消化，所以它们对于能够降解肌醇六磷酸的食物链更加向下的分解者是可以利用的，例如，导致与动物流出物接触的地表水中的藻类水华。非反刍动物，诸如鸡、家猪和鱼，不能够从食物中获取快速生长所需的充足的磷，由于它们不能自然地产生从食物中发现的肌醇六磷酸释放磷所必需的肌醇六磷酸酶。因为大部分的磷以肌醇六磷酸的磷酸基团(肌醇六磷酸盐)的形式存在，所以仅少量来自基于植物的食品和种子的磷被利用。因此，为了增加它们的生长，存在为动物提供磷的需要。一种方案是向动物饲料添加无机磷补充物；然而，使用无机磷补充物导致由动物排泄并进入环境的磷酸盐的量增加，这导致水源的污染。另一种方案是为动物提供肌醇六磷酸酶补充物或添加肌醇六磷酸酶至动物饲料。商业上可得到的肌醇六磷酸酶产品的实例包括但不限于：phyzyme(dupont、danisco、genencor)；quantum和finase(abvista、abenzymes)；natuphos(basf)；ronozyme(dsm)；biofeed肌醇六磷酸酶(novonordisk)；allzyme肌醇六磷酸酶(alltech)；optiphos(enzyvia、phytex、cornell)；rovabio(adisseo)；phytout(uswaters)。这些肌醇六磷酸酶产品中的每个至少在生产水平、生产时间、高温稳定性、低ph稳定性、比活性和剂量要求中具有限制。因此，对于肌醇六磷酸酶存在需要，例如，在较少时间内以较高产率生产的肌醇六磷酸酶、在高温下保持更多活性的肌醇六磷酸酶、在低ph下保持更多活性的肌醇六磷酸酶或具有较高比活性的肌醇六磷酸酶，较高比活性的肌醇六磷酸酶使得使用者能够减少剂量水平并减少为动物饲料生产和提供肌醇六磷酸酶的成本。肌醇六磷酸酶是由核酸序列编码的蛋白质。核酸序列或dna被克隆进入宿主有机体，其能够表达或生产肌醇六磷酸酶。本领域中存在可用于生产蛋白质的多种已知的蛋白质表达系统。蛋白质表达系统的实例包括有机体诸如：细菌、酵母菌、霉菌、哺乳类、植物或昆虫。各种因素影响表达系统的选择，诸如被表达的蛋白的类型和生产的蛋白质产品的量。demain,(2009)“productionofrecombinantproteinsbymicrobesandhigherorganisms”,biotechnologyadvances，第27卷，第297-306页公开了多种蛋白表达系统的各种优点和缺点。商业上肌醇六磷酸酶从多种宿主有机体细胞外生产，宿主有机体包括但不限于：黑曲霉、米曲霉、绳状青霉、肌醇六磷酸酶油菜(甘蓝型油菜)、毕赤酵母和粟酒裂殖酵母，参见pariza,“determiningthesafetyofenzymesusedinanimalfeed”,regulatorytoxicologyandpharmacology56(2010)332-342。肌醇六磷酸酶的工业规模生产需要以低成本在少量时间内产生高水平的酶的表达系统。因此，对提供满足或超出工业规模制造肌醇六磷酸酶的生产需求的基因存在需要。本发明的一个实施方式是提供编码在革兰氏阴性细菌表达系统中以高水平生产的肌醇六磷酸酶的基因。另一个实施方式是提供编码经由细胞内表达以高水平生产的肌醇六磷酸酶的基因。另一个实施方式是在革兰氏阴性细菌表达系统中经由细胞内表达生产肌醇六磷酸酶，其中宿主有机体是假单胞菌。另一个实施方式是在荧光假单胞菌中生产肌醇六磷酸酶。表达系统可以为本领域已知的任何荧光假单胞菌表达系统，例如，从dowglobaltechnologiesinc.商业上可得的荧光假单胞菌表达系统，菌株dc454(美国专利公开申请号20050130160和美国专利公开申请号20050186666)。将编码肌醇六磷酸酶或多肽的核酸序列插入pmyc载体(dowglobaltechnologiesinc.，美国专利公开申请20050130160)或pdow1169载体(dowglobaltechnologiesinc.，美国专利公开申请号20080058262)的任何一个中，然后通过电穿孔将其引入荧光假单胞菌宿主。本领域技术人员将知道可用作本发明的实施方式的可选载体。在另一个实施方式中，编码肌醇六磷酸酶的dna可被引入例如任意数目的革兰氏阴性细菌系统的质粒上或被稳定地转化为例如任意数目的革兰氏阴性细菌系统的基因组，革兰氏阴性细菌系统诸如大肠杆菌、假单胞菌种类诸如荧光、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、雷尔氏种类(ralstoniaspecies)或柄细菌种类。类似地，肌醇六磷酸酶可被引入任意数目的革兰氏阳性细菌表达系统，诸如，杆菌种类诸如枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，或短杆菌乳球菌种类诸如乳酸乳球菌、乳酸杆菌种类，或链霉菌种类诸如变铅青链霉菌。其它革兰氏阴性、革兰氏阳性或非相关的真菌的或古细菌的表达系统可被用于表达肌醇六磷酸酶。在另一个实施方式中，编码肌醇六磷酸酶的dna可被引入质粒以指导其表达。包含编码肌醇六磷酸酶的dna的质粒可包括，例如pqe、pet和pask家族的大肠杆菌表达载体；pcn51lt8、rsf1010、pwz112t和pmyc家族的假单胞菌表达载体；pbax、pht01和phis1525家族的杆菌表达载体；pij6021和pij2460家族的链霉菌表达载体；和pnz9530和pnz8148家族的乳酸菌表达载体，例如。这些实例是为了说明性目的，并不代表在其中可表达seqidno:1的多核苷酸序列的完整的载体组。在另一个实施方式中，可以至少7.0g/l、8.0g/l、9.0g/l、10.0g/l、11.0g/l、12.0g/l、13.0g/l、14.0g/l、15.0g/l、16.0g/l、17.0g/l、18.0g/l、19.0g/l、20.0g/l、21.0g/l、22.0g/l、23.0g/l、24.0g/l、25.0g/l、26.0g/l、27.0g/l、28.0g/l、29.0g/l、30.0g/l、31.0g/l、32.0g/l、33.0g/l、34.0g/l、35.0g/l、36.0g/l、37.0g/l、38.0g/l、39.0g/l、或至少40.0g/l或大于40.0g/l的水平通过细胞内表达生产编码肌醇六磷酸酶的分离的、重组的或合成的核酸序列。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶的发酵生产时间为小于150小时、145小时、140小时、135小时、130小时、125小时、120小时、115小时、110小时、105小时、100小时、95小时、90小时、85小时、80小时、75小时、70小时、65小时、60小时、55小时、50小时、49小时、48小时、47小时、46小时、45小时、44小时、43小时、42小时、41小时、40小时、39小时、38小时、37小时、36小时、35小时、34小时、33小时、32小时、31小时、30小时、29小时、28小时、27小时、26小时、25小时、24小时、23小时、22小时、21小时、20小时或小于20小时。在另一个实施方式中，以下列或以上的体积执行发酵：10l、100l、200l、500l、1000l、2000l、5000l、10,000l、25,000l、50,000l、55,000l、60,000l、65,000l、70,000l、75,000l、80,000l、85,000l、90,000l、95,000l、100,000l、110,000l、120,000l、130,000l、140,000l、150,000l、160,000l、170,000l、180,000l、190,000l、200,000g/l或大于200,000l。在一个实施方式中，细胞内表达系统为革兰氏阴性细菌。在另一个实施方式中，革兰氏阴性细菌为假单胞菌。在另一个实施方式中，假单胞菌为荧光假单胞菌。在一个实施方式中，以大约35.0g/l生产具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。在另一个实施方式中，以大于7.0g/l生产具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。在另一个实施方式中，将在小于144小时内表达肌醇六磷酸酶。在另一个实施方式中，将在小于84小时、74小时、64小时、54小时、44小时、34小时或24小时内生产肌醇六磷酸酶。在一个实施方式中，通过细胞内表达生产的编码肌醇六磷酸酶的核酸源自下列或是源自下列的核酸的改性形式：大肠杆菌、杆菌属、哈夫尼菌属(hafniasp.)、perniophoralycii、布丘氏菌属(buttiauxellasp.)、柠檬酸杆菌属或黑曲霉。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶为在pct公开号wo1999/008539、wo2000/071728、wo2001/090333、wo2002/095003、wo2006/028684、wo2008/036916或wo2010/135588中公开的任意肌醇六磷酸酶。在另一个实施方式中，核酸为分离的、合成的或重组的核酸。在另一个实施方式中，分离的、重组的或合成的核酸序列编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。在另一个实施方式中，核酸序列选自：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4、seqidno:5和seqidno:7的核酸序列。在一个实施方式中，编码具有肌醇六磷酸酶活性的核酸为seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4、seqidno:5或seqidno:7的变体，其中该变体至少70％、71％、72％、73％，74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或完全(100％)与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4、seqidno:5和/或seqidno:7或其片段同一，其中该变体编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。在另一个实施方式中，分离的、合成的或重组的核酸序列编码选自下列的多肽：seqidno:3、seqidno:6和seqidno:8。在另一个实施方式中，seqidno:1的核酸或seqidno:1的变体编码seqidno:3的多肽。在另一个实施方式中，seqidno:2的核酸或seqidno:2的变体编码seqidno:3的多肽。在另一个实施方式中，seqidno:4的核酸或seqidno:4的变体编码seqidno:6的多肽。在另一个实施方式中，seqidno:5的核酸或seqidno:5的变体编码seqidno:6的多肽。在另一个实施方式中，seqidno:7的核酸或seqidno:7的变体编码seqidno:8的多肽。在一个实施方式中，核酸序列与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:7或其变体的全长序列互补。在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶是分离的、重组的或合成的具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其中该多肽选自：seqidno:3、seqidno:6和seqidno:8的氨基酸序列。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶为seqidno:3、seqidno:6、或seqidno:8的变体，其中该变体至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或完全(100％)与seqidno:3、seqidno:6或seqidno:8或其酶活性片段同一，其中该变体具有肌醇六磷酸酶活性。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶为由包含seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4、seqidno:5和/或seqidno:7的核酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶为缺少信号序列、原蛋白(proprotein)序列、启动子序列或其组合的氨基酸序列。在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶是进一步包含选自下列的异源序列的氨基酸序列：信号序列、标记物、表位、交配因子、调节序列、启动子序列、n端延伸、c端延伸和其任意组合。在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶具有在从大约1000u/mg至大约1，600u/mg范围内的任何值的比活性。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶具有1000u/mg、1100u/mg、1200u/mg、1300u/mg、1400u/mg、1500u/mg或1600u/mg的比活性。在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶在从大约ph1.0至大约ph9.0范围内的任何ph下是活性的。在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶在1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或更碱性条件的ph下是活性的。在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶在从大约50℃至大约100℃的范围内的任何温度下是活性的。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶在从大于37℃至大约95℃、或大约55℃至大约85℃之间、或大约70℃至大约75℃之间，或大约70℃至大约95℃之间、大约90℃至大约95℃之间、大约95℃至大约105℃之间、或大约95℃至大约110℃之间的范围内的温度下是活性的。在一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶包含在组合物中。在另一个实施方式中，组合物为制剂。在另一个实施方式中，组合物为包含肌醇六磷酸酶的食品、饲料、补充物、动物饲料添加物、或膳食助剂。在另一个实施方式中，组合物为包含肌醇六磷酸酶的药品。本文中所使用的“克隆”是用于形成dna片段、细胞或有机体的复制品的方法，其中dna被引入生产重组dna的复制品的宿主有机体。本文中所使用的“克隆载体”为诸如细菌质粒或噬菌体的载体，其用于将基因序列，诸如脱氧核糖核酸(dna)片段或完整的基因插入宿主细胞以便外来基因材料能够被复制。本文中所使用的“混合物(cocktail)”为包含本发明的肌醇六磷酸酶结合一种或多种另外的酶的组合物。一种或多种另外的酶可以为任何酶，例如，乳糖酶、脂肪酶、蛋白酶、过氧化氢酶、木聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、酰胺酶、环氧化物酶、酯酶、磷脂酶、转氨酶、胺氧化酶、纤维二糖水解酶、脱氨酶或其任意组合。“密码子”是指定待被加入蛋白质的氨基酸的种类(identity)的三个多核苷酸序列。本文中所使用的“互补dna或cdna”为在由逆转录酶和dna聚合酶催化的反应中由信使rna模板合成的dna。本文中所使用的“培养”包括使用改性为适于在包含编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸的宿主细胞内激活启动子、选择转化体或扩增基因的常规的营养培养基。培养条件，诸如温度、ph等，是与选择的用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对普通技术人员将是明显的。本文所使用的“宿主细胞”是包含编码肌醇六磷酸酶的核酸序列，或包含本发明的表达盒、载体、克隆媒介(vehicle)、表达载体、克隆载体的转化细胞。宿主细胞可以是为本领域技术人员所熟悉的任何宿主细胞，包括原核细胞或真核细胞，诸如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。选择适合的宿主在本领域技术人员的能力范围内。可以以常规方式使用宿主细胞以生产由重组的序列编码的基因产品。取决于重组生产过程中采用的宿主，由宿主细胞生产的多肽可为糖基化的或可为非糖基化的。本发明的多肽还可能包括或可不包括初始甲硫氨酸氨基酸残基。本文中所使用的“同一的”为序列同一性(同源性)的程度，其可使用本领域已知的任何计算机程序和相关参数，诸如具有缺省参数的blast2.2.2.或fasta版本3.0t78来测定。蛋白和/或核酸序列同一性(同源性)可使用任何一种本领域已知的多种序列比较算法和程序估计。这种算法和程序包括但不限于blast程序(nationalcenterforbiologicalinformation的基本局部比对搜索工具，诸如blast、blast2、blastn和blastx)、tblastn、blastp、fasta、tfasta和clustalw(pearson和lipman,proc.natl.acad.sci.usa85(8):2444-2448,1988；altschul等人，j.mol.biol.215(3):403-410,1990；thompson等人，nucleicacidsres.22(2):4673-4680,1994；higgins等人，methodsenzymol.266:383-402,1996；altschul等人，j.mol.biol.215(3):403-410,1990；altschul等人，naturegenetics3:266-272,1993。blast、blast2.0和blast2.2.2算法还被用于实践本发明。它们被描述在例如altschul(1977)nuc.acidsres.25:3389-3402；altschul(1990)j.mol.biol.215:403-410中。用于执行blast分析的软件是通过nationalcenterforbiologicalinformation公开地可获得的。在两个或更多个核酸或多肽的情况下，术语“同源性”和“同一性”指的是相同的两个或更多个序列或子序列，或当与在比较窗口或使用任意数目的序列比较算法或通过人工比对和视觉检查测量的指定区域上的最大对应比较或对齐时具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列。对于序列比较，一个序列可作为与测试序列比较的参比序列(本发明的示例性序列)。当使用序列比较算法时测试和参比序列被输入计算机，指定子序列坐标，如果需要，并且指定序列算法程序的参数。可使用缺省程序参数或可指定可选的参数。然后序列比较算法基于程序参数计算相对于参比序列测试序列的百分比序列同一性。本文中所使用的“核酸”指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或指任意这些中的核酸片段。核酸可以为基因组或合成的起源的基因组dna、cdna、合成dna或rna(例如，mrna、rrna、trna)——可以为单链的或双链的并可表示有义链或反义链——至肽核酸(pna)，或至以天然或合成起源的任意dna类或rna类材料——包括例如irna，核糖核蛋白(如irnp)。该术语包括核酸，例如寡核苷酸，包含已知天然核苷酸的类似物。该术语还包括具有合成主链的核酸类结构，参见例如mata(1997)toxicol.appl.pharmacol.144:189-197；strauss-soukup(1997)biochemistry36:8692-8698；samstag(1996)antisensenucleicaciddrugdev6:153-156。用于实践本发明的核酸，无论rna、irna、反义核酸、cdna、基因组dna、载体、病毒或其杂种，可以从基因工程的、扩增的和/或重组表达/生成的多种来源分离。从这些核酸生成的重组多肽可以单独地分离或克隆并测试期望的活性。在一个实施方式中，核酸可以在重组的表达系统中，包括细菌、哺乳动物、酵母菌、昆虫或植物细胞表达系统。操纵核酸的技术，诸如，例如亚克隆、标记探针(例如，使用klenow聚合酶、切口平移、扩增的随机引物标记)、序列测定、杂交等，在科技和专利文献中被很好地描述，参见，例如sambrook,ed.,molecularcloning:alaboratorymanual(第二版)，第1-3卷，coldspringharborlaboratory,(1989)；currentprotocolsinmolecularbiology,ausubel,ed.johnwiley&sons,inc.,newyork(1997)；laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology:hybridizationwithnucleicacidprobes,parti.theoryandnucleicacidpreparation,tijssen,ed.elsevier,n.y.(1993)。本发明提供有效地连接至表达(例如，转录的或翻译的)控制序列(一个或多个)，例如，启动子或增强子以指导或调变rna合成/表达的本发明核酸(例如，dna)序列。表达控制序列可以在表达载体中。本发明提供用于表达和过表达本发明的多肽的表达系统，例如，包含例如编码本发明的肌醇六磷酸酶的本发明的核酸的表达盒、载体、克隆媒介等。本发明的核酸序列的最佳表达也指核酸的指导的或随机的诱变，以影响编码的蛋白质的增加的表达。本发明的核酸的诱变可直接地或间接地提供表达的蛋白质的增加的产率。作为非限制性实例，本文中描述的诱变技术可被利用来影响核酸的5'非翻译区、3'非翻译区或编码区的突变，其突变可导致rna或蛋白质水平的增加的稳定性，由此导致蛋白质的增加的产率。在一些实施方式中，在感兴趣的蛋白质中待被作出的突变由各种因素确定，包括分析感兴趣的可读框(orf)或基因的预测的mrna结构的5’原始末端(5primeend)的二维和三维结构，以及宿主的优选的密码子，以选择可增强感兴趣的蛋白质的表达的突变。例如，在一些实施方式中，突变既不仅仅在宿主的优选密码子的基础上选择，即，密码子优化，也非密码子优化程序。“突变”是相比于参比的核苷酸序列或氨基酸中的变化。“沉默突变”是不导致不同氨基酸的特化的密码子中的突变。“核苷酸”指包括dna序列的四种碱基——腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、鸟嘌呤(guanidine)(g)和胞嘧啶(c)。在一个方面，本发明的表达盒包括本发明的序列和核苷酸序列，其能够影响在与这种序列相容的宿主中结构基因(即，蛋白质编码序列，诸如本发明的肌醇六磷酸酶)的表达。表达盒至少包括有效地与多肽编码序列；和可选地与其它序列例如转录终止信号连接的启动子。还可使用影响表达所需或有用的另外的因素，如增强子。大量的合适的载体对本领域技术人员是已知的，并且是商业上可得的。示例性载体包括：细菌：pqe载体(qiagen)、pbluescript质粒、pnh载体、(λ-zap载体(stratagene)；ptrc99a、pkk223-3、pdr540、prit2t(pharmacia)；真核的：pxt1、psg5(stratagene)、psvk3、pbpv、pmsg、psvlsv40(pharmacia)。然而，可使用任何其它质粒或其他载体，只要它们在宿主中是可复制的且可生存的。在重组的微生物或细胞培养物被描述为寄宿“表达载体”处，这包括染色体外环状和线状dna和已经被并入宿主染色体(一个或多个)的dna两者。当载体由宿主细胞维持，载体在有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳定复制，或者被并入宿主的基因组内。表达载体可包括启动子、翻译开始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可包括用于扩增表达的适合的序列。本发明提供用于扩增编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸或其子序列的扩增引物序列对。本领域技术人员可设计这些序列的任意部分或全长的扩增引物序列对。本领域内扩增方法也是众所周知的，并且包括，例如，聚合酶链反应pcr；转录扩增；自动维持序列复制；qβ复制酶扩增；和其它rna聚合酶介导技术。本文中所使用的“多肽”包括“氨基酸”或为寡肽、肽、多肽的“氨基酸序列”或蛋白质序列，或可选地，为任意这些中的片段、部分或亚单元，并且涉及天然出现的或合成的分子。在一个方面，本发明的多肽和肽具有肌醇六磷酸酶活性。在可选的方面，它们还可被用作例如标记探针、抗原、耐受原、模体、肌醇六磷酸酶活性位点。本发明的多肽和肽可以为分离的、合成的或重组的。可以在体外或体内重组地表达肽和蛋白质。本发明的肽和多肽可使用本领域内任何已知的方法制作和分离。还可以使用本领域内众所周知的化学方法全部或部分合成本发明的多肽和肽。例如，可以在标准的重组表达系统中生产(如本文中所描述)、化学合成、或从它们在其中自然表达的有机体中纯化肌醇六磷酸酶多肽。在可选的方面，本发明的“重组”多肽或蛋白包括(指的是)通过重组dna技术生产的多肽或蛋白；例如，通过由编码期望的多肽或蛋白的外源dna结构转化的细胞来生产。在可选的方面，本发明的肽和多肽为糖基化的。可以化学地或通过细胞生物合成机制后翻译地添加糖基化，其中后者包括使用已知糖基化模体，其可以来自于序列或可作为肽被加入或在核酸编码序列中加入。糖基化可以是o-连接的或n-连接的或其组合。在可选的方面，如上面所限定，本发明的肽和多肽部分或完全地包括“模拟物”和“肽模拟物”形式。在一个方面，术语“模拟物”和“肽模拟物”指的是合成的化合物，其基本上具有本发明的多肽的相同结构和/或功能特征。模拟物可以完全由氨基酸的合成的、非天然的类似物组成，或可以为部分天然的肽氨基酸和氨基酸的部分非天然的模拟物的嵌合分子。模拟物还可以包括任意量的天然氨基酸保守置换，只要这种置换也基本上不改变模拟物的结构和/或活性。对于本发明的多肽，其是保守变体，常规实验将确定模拟物是否在本发明的范围内，即，其确定其结构和/或功能基本上没有被改变。因此，在一个方面，如果模拟组合物具有肌醇六磷酸酶活性，其在本发明的范围内。在可选的方面，保守置换是用相似特征的另外的氨基酸替代多肽中给定的氨基酸。在可选的方面，保守置换是下面的替换：脂肪族氨基酸，诸如ala、val、leu和ile，被另外的脂肪族氨基酸替换；ser被thr替换或反之亦然；酸性残基，诸如asp和glu，被另外的酸性残基替换；带有酰胺基的残基，诸如asn和gln，被带有酰胺基的另外的残基替换；碱性残基，诸如lys和arg，与另外的碱性残基交换；和芳香残基，诸如phe、tyr，被另外的芳香残基替换。置换一种疏水氨基酸，诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，为另一种，或置换一种极性氨基酸为另一种，诸如，置换精氨酸为赖氨酸，置换谷氨酸为天冬氨酸，或置换谷氨酰胺为天冬酰胺。在一个方面，例如，可以从本发明的肌醇六磷酸酶多肽中缺失一种或多种氨基酸，以产生多肽的结构的改变而没有显著地改变其生物活性，或可选的，故意显著地改变其生物活性。例如，可以移除和/或添加肌醇六磷酸酶生物活性需要的或可选地不需要的氨基或羧基末端氨基酸。可通过许多方法测定本发明的改性多肽序列的肌醇六磷酸酶生物活性，包括使改性的多肽序列与肌醇六磷酸酶底物接触，和确定改性的多肽是否降低了试验中具体底物的量或增加了功能肌醇六磷酸酶多肽与底物的酶促反应的生物产物。在一个方面，本发明的肽和多肽具有本发明的“基本上同一的”氨基酸序列的序列，即，通过一种或多种保守或非保守氨基酸置换、缺失或插入不同的序列，特别是当这种置换发生在分子的非活性位点的位点的时候，条件是多肽基本上保留其功能性质。在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶选自：具有seqidno:3(由seqidno:1或seqidno:2的多核苷酸编码)的氨基酸序列的多肽；具有seqidno:3(由seqidno:4或seqidno:5的多核苷酸编码)的氨基酸序列的多肽；和具有seqidno:8(由seqidno:7的多核苷酸编码)的氨基酸序列的多肽。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶为seqidno:3、seqidno:6或seqidno:8的多肽变体，其中多肽变体具有与seqidno:3、seqidno:6或seqidno:8的多肽或其酶活性片段具有至少大约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或完全(100％)同一性的氨基酸序列，其中多肽变体具有肌醇六磷酸酶活性。本发明提供不具有信号序列或具有改性信号序列(也称为信号肽(sps)，或前导肽)或异源信号序列的肌醇六磷酸酶。本发明的多肽也可没有前域(preprodomain)和/或催化域(cds)或具有改性的或异源前域(preprodomain)和/或催化域(cds)。并入本发明的多肽的改性的或异源sps、前域和/或cds可以为融合蛋白的部分，例如，作为嵌合蛋白中的异源域，或通过化学连接剂添加。例如，本发明的酶可包括载体中的异源sp和/或前域，如ppic系列载体(lifetechnologies,carlsbad,ca)。此外，本发明的多肽可进一步包括异源序列，来自其它肌醇六磷酸酶或来自非肌醇六磷酸酶来源的序列，或完全合成的序列。因此，在一个方面，本发明的核酸包括内源的编码序列、改性的或异源信号序列(sp)、前域和/或催化域(cd)和异源序列(即，非天然地与发明的信号序列(sp)，前域和/或催化域(cd)相关联的序列)。异源序列可以在3’末端、5’末端上和/或在sp、前域和/或cd编码序列的两端上。本发明的固定化酶和固相支持体为肌醇六磷酸酶或其片段，并且编码酶和片段的核酸可被固定至固相支持体。在工业过程中肌醇六磷酸酶的使用中，这通常是经济的和有效率的。例如，用于具体化学反应的肌醇六磷酸酶(或其活性片段)的聚生体或混合物可被连接至固相支持体并被浸泡在处理瓮(processvat)中。可发生酶促反应。然后可将固相支持体连同固定至其的酶拿出瓮外，用于重复使用。在本发明的一个实施方式中，本发明的分离的核酸被固定至固相支持体。在本发明的另一个实施方式中，固相支持体选自凝胶、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极和/或其任意组合。存在本领域技术人员将是知道的许多方法，用于将酶或其片段，或核酸固定至固相支持体上。这种方法的一些实例包括，例如，静电液滴生成、电化学装置、经由吸附、经由共价结合、经由交联、经由化学反应或过程、经由包囊作用、经由包载、经由藻酸钙或经由聚(甲基丙烯酸-2-羟乙基酯)。在由s.p.colowick和n.o.kaplan编辑的methodsinenzymology,immobilizedenzymesandcells,partc.1987.academicpress.，第136卷和由g.f.bickerstaff编辑的immobilizationofenzymesandcells.1997.humanapress、由j.m.walker编辑的系列：methodsinbiotechnology中公开了相似的方法。本文中所使用的“变体”包括这些多肽的衍生物或类似物。具体而言，通过可以以任何组合存在的一种或多种置换、添加、缺失、融合和平截，变体可在氨基酸序列方面与本发明的多肽和与多肽基本上同一的序列存在不同。产生本发明的核酸的变体的方法，例如编码肌醇六磷酸酶的那些，在本领域内是众所周知的。这些方法可被重复或以各种组合使用以产生与由模板核酸编码的肌醇六磷酸酶相比具有改变的或不同的活性或改变的或不同的稳定性的肌醇六磷酸酶。这些方法也可被重复或以各种组合使用，例如，产生基因/信息表达、信息翻译或信息稳定性的变化。在另一方面，通过例如离体同源基因细胞改性，然后其再次插入进入细胞，改变细胞的基因组合物。本发明还提供通过诱变和其它方法改变本发明的肌醇六磷酸酶的特征的方法，包括例如，由vereniumcorporation(以前的diversacorporation，sandiego，ca)开发的专利方法，例如基因重组(参见例如，美国专利号6,537,776)；基因位点饱和诱变(gssm)(参见例如，美国专利号6,171,820和6,764,835)，定向进化中外切酶-介导基因装配(参见例如，美国专利号6,361,974和6,352,842)，定向进化中末端选择(参见例如，美国专利号6,358,709和6,238,884)，基于重组的合成改组(参见例如，美国专利号5,965,408和6,440,668以及澳大利亚专利号au724521)，嗜热酶的定向进化(参见例如，美国专利号5,830,696和6,335,179)，以及定制多位点组合装配(参见，例如wo2009/018449)。可使用分子生物学中已知的各种技术，例如，随机pcr诱变，参见例如，rice(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:5467-5471；或组合多盒式诱变，参见例如，crameri(1995)biotechniques18:194-196。可选地，核酸，例如基因，可在随意(random)，或“随机(stochastic)”，片段化之后被重新装配，参见例如，美国专利号6,291,242；6,287,862；6,287,861；5,955,358；5,830,721；5,824,514；5,811,238；5,605,793。在可选的方面，通过下列引入改性、添加或缺失：易错pcr、改组、寡核苷酸-定向诱变、装配pcr、性pcr诱变、体内诱变、盒式诱变、循环系综诱变、指数系综诱变、位点特异性诱变、基因重装配、基因位点饱和诱变(gssm)、合成连接重装配(slr)、重组、循环序列重组、硫代磷酸(phosphothioate)改性的dna诱变、含尿嘧啶模板诱变、缺口双链体诱变、点错误匹配修复诱变、修复缺失宿主菌株诱变、化学诱变、放射产生的诱变、缺失诱变、选择限制诱变、纯化限制诱变、人工基因合成、系综诱变、嵌合核酸多聚体制造和或这些的组合和其它方法。本文中所使用的“转基因植物和种子”包括本发明的核酸、多肽、表达盒、克隆机制或载体，或本发明的转染或转化细胞。本发明还提供植物产品，例如，包括本发明的核酸和/或多肽的油、种子、叶子、提取物等。转基因植物可以为双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。本发明还提供制造和使用这些转基因植物和种子的方法。表达本发明的多肽的转基因植物或植物细胞可根据本领域已知的任意方法构建。参见，例如美国专利号6,309,872。在一些实施方式中，为了实现肌醇六磷酸酶的细胞外表达，本发明的表达构建利用分泌信号序列。虽然也可以使用同源于(来自于)植物宿主种类的信号序列、异源信号序列，即，源自其它植物种类或微生物起源的那些，但这种信号序列对本领域技术人员是已知的。在blobel等人，1979；vonheijne，1986；garcia等人，1987；sijmons等人，1990；ng等人，1994；和powers等人，1996中公开了在本发明的背景中可使用的适合的信号序列。本文中所使用的“转基因非人类动物”为本发明的核酸、多肽、表达盒或载体或转染的或转化的细胞。转基因非人类动物可以为，例如包括本发明的核酸的山羊、兔子、羊、猪、牛、鼠和小鼠。可以使用这些动物，例如作为体内模型以研究肌醇六磷酸酶活性或作为模型以在体内筛查肌醇六磷酸酶活性的调谐子。可以设计转基因非人类动物中待表达的多肽的编码序列组成型，或在组织特异性、发育特异性或可诱导转录调节因子的控制下。可使用本领域内已知的任何方法设计或产生转基因非人类动物。在一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶被用作动物饲料的添加物。添加肌醇六磷酸酶的一些益处包括但不限于：增加饲料中包含的总磷，减少通过排泄释放进入环境的磷，和增加其它矿物和氨基酸的可消化性。在另一个实施方式中，包含本发明的肌醇六磷酸酶的动物饲料或补充物可被给至任何动物。肌醇六磷酸酶通常被包含在家禽诸如鸡、肉鸡、或产蛋鸡；火鸡；鸭；猪(swine)诸如家猪、小猪或母猪；牛(bovine)诸如牛(cattle)的动物饲料中；和鱼诸如鳟鱼、大马哈鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲈鱼的水产养殖饲料中。在另一个实施方式中，包含本发明的肌醇六磷酸酶的动物饲料可以以本领域技术人员已知的任何制剂提供给动物。动物饲料制剂的实例包括但不限于：递送基质、颗粒、片剂、凝胶、液体、喷雾、粗磨粒(groundgrain)或粉末。在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶被用于治疗易罹患骨丢失的个体，诸如骨质疏松症、恶病质，和医学治疗，诸如化学疗法，其可损害营养物的适当摄取和利用。本发明的一个方面是提供包含肌醇六磷酸酶的药物或膳食制剂。对接受运动训练、强烈体能训练、医院饮食、微量营养素差的谷物和豆科植物饮食、学校午餐项目或任何其它营养项目的个体使用此发明的肌醇六磷酸酶在本领域内也是常见的。在一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶被用在生物燃料和生物质转化的工业生产中。例如，肌醇六磷酸酶被用在发酵或醇生产过程中。在一个实施方式中，醇为乙醇，其可用于燃料用途或是适合饮用的乙醇。在一个实施方式中，发酵过程可利用淀粉或非淀粉植物材料，诸如木质纤维素材料，诸如纤维素、半纤维素和/或木质素。在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶被用于处理干酒糟可溶物(dds)；干酒糟谷物(ddg)；浓缩的酒糟可溶物(cds)；湿酒糟谷物(dwg)；和干酒糟谷物及可溶物(ddgs)。乙醇发酵过程的这些副产品可被用作动物饲料的成分。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶被用于减少结垢和增加乙醇产率。在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶被用于将藻类、初榨植物油、废植物油、污水转化为燃料。实施例实施例1：肌醇六磷酸酶比活性测定在假单胞菌和毕赤酵母中表达的肌醇六磷酸酶的比活性(如下面所描述)。肌醇六磷酸酶分子的比活性不受两种分析的表达系统中表达的影响(参见图1)。通过离心从发酵液中移除毕赤酵母细胞，以及上层清液为dnase处理和与ph8.0的100mmtris进行缓冲液交换。使用微射流机(microfluidizer)溶解和离心分离表达肌醇六磷酸酶的假单胞菌细胞。上层清液为dnase处理和与ph8.0的100mmtris进行缓冲液交换。然后将样品装载至离子交换柱(fplc)上并收集馏分。测试洗脱的馏分的活性并在sds-page上运行；合并纯净的馏分。通过分光光度法测定蛋白浓度(在280nm处的吸收)。使用基于肽的软件计算机，vectornti(lifetechnologies，carlsbad，ca)测定特定蛋白质吸收系数(280nm)。测定基于肽序列的肌醇六磷酸酶分子的280nm系数为od2801.0＝0.875mg/ml(seqidno:6(由seqidno:4编码)，seqidno:6(由seqidno:5编码)，seqidno:3(由seqidno:1)和seqidno:3(由seqidno:2编码)和0.897mg/ml(seqidno:8，由seqidno:7编码)。基于吸光度比值(260/280nm)测定dna在可测量的值以下。使用比色试验测定肌醇六磷酸酶比活性，其探测来自肌醇六磷酸的脱磷酸作用的游离磷酸盐。将纯化的肌醇六磷酸酶的50μl等分试样加入预先加热的(37℃)950μl的底物混合物(4mm的肌醇六磷酸十二钠，100mm醋酸钠ph5.5)。每分钟取出50μl的等分试样并在50μl的颜色/定影液(钼酸盐-钒酸盐)中淬灭。10分钟之后，当已经完全显影为黄色时，使用spectramaxplus吸光度读数装置测量od415。通过下面所图解的计算式确定活性。一个单位被定义为每分钟由酶释放的磷酸盐的微摩尔数。实施例2：高温下肌醇六磷酸酶活性(dsctm)为了测定肌醇六磷酸酶的热稳定性，perkin-elmerpyris1差示扫描量热计(dsc)被用于测定肌醇六磷酸酶变体的熔化温度(tm)。使用100mm柠檬酸盐作为缓冲液在ph5.5(类似于水性饲料提取物)下执行tm分析。以具有10％山梨醇-10％nacl或没有10％山梨醇-10％nacl运行dsc运转。dsc分析指示10％山梨醇-10％nacl提高了肌醇六磷酸酶的热稳定性。在液体形式中，可以获得大于98℃的tm(图2)。单独在缓冲溶液中，假单胞菌表达的肌醇六磷酸酶显示了比毕赤酵母表达的肌醇六磷酸酶低1-2℃的tm，然而当加入10％山梨醇-10％nacl时，没有观察到温度降低(图3)。实施例3：ph曲线当在毕赤酵母或假单胞菌中表达时(图4)，肌醇六磷酸酶的ph最优测定为ph3.5-ph4.5。为了移除起因于转换缓冲液以覆盖ph1.0-ph5.5的测试范围的混杂变量，使用britton-robinson缓冲液测定不同ph点处肌醇六磷酸底物上肌醇六磷酸酶的活性。将不同ph处的活性归一化为4的ph最优。实施例4：低ph(人工胃液(sgf))条件下肌醇六磷酸酶活性，以及ph曲线通过在ph1.2的人工胃液(sgf)中在60分钟的时间进程内处理肌醇六磷酸酶分子来评估胃的稳定性。以每μg肌醇六磷酸酶10胃蛋白酶单位将胃蛋白酶加入sgf。在10、30和60分钟处，移除sgf-肌醇六磷酸酶混合物的等分试样并在200mm的ph11.0的碳酸钠缓冲液中淬灭。然后通过sds-page分析样品以测定蛋白质消化的程度。sds-page(图5)结果证明了seqidno:8(由seqidno:7编码)的肌醇六磷酸酶条带分子在10分钟的sgf+胃蛋白酶处理内降解。60分钟后，在毕赤酵母(seqidno:3(由seqidno:2编码)和seqidno:6(由seqidno:5编码))和假单胞菌(seqidno:3(由seqidno:1编码)和seqidno:6(由seqidno:4编码))中表达的其它肌醇六磷酸酶分子显示了最低的降解。基于在先的报道，大肠杆菌wtappa肌醇六磷酸酶证明了2.4分钟的sgf半衰期(garrett等人，2004)。seqidno:8(由seqidno:7编码)的肌醇六磷酸酶在10分钟后实际上不具有活性，并且其它肌醇六磷酸酶(seqidno:3(由seqidno:2编码)、seqidno:6(由seqidno:5编码)，(seqidno:3(由seqidno:1编码)，和seqidno:6(由seqidno:4编码))在60分钟后保持完整的蛋白质(图5)和活性(图6)。实施例5：肌醇六磷酸酶表达毕赤酵母表达系统利用由rct许可的毕赤酵母gs115菌株和甲醇可诱导启动子(aox)。分泌肌醇六磷酸酶进入发酵液。在30l发酵罐中测试在毕赤酵母中表达的seqidno:3(由seqidno:2编码)的肌醇六磷酸酶并在120小时后获得7.0g/l。肌醇六磷酸酶seqidno:6(由seqidno:5编码)的发酵结果小于7.0g/l。来自dow的假单胞菌表达系统利用具有插入至pdow1169(由iptg可诱导)的肌醇六磷酸酶序列的菌株(dc454)。肌醇六磷酸酶在细胞内表达并且其需要肌醇六磷酸酶恢复的细胞溶解(参见图7)。在假单胞菌中细胞内肌醇六磷酸酶(seqidno:3(由seqidno:1编码)和seqidno:6(由seqidno:4编码))表达的一式三份的结果在从大约5g/l至大约35.0g/l的范围内。序列表<110>巴斯夫酶有限责任公司<120>肌醇六磷酸酶<130>veren.067wo/d2500-1wo<140>随其提交<141>随其提交<150>us61/777,139<151>2013-03-12<150>gb1308828.1<151>2013-05-16<160>8<170>patentin版本3.5<210>1<211>1239<212>dna<213>人工序列<220><223>合成产生的多核苷酸<400>1atgcagagcgagccggagctgaagctggaaagcgtggtgattgtcagccgtcatggtgtg60cgtgctccaaccaaggctacgcaactgatgcaggatgtcaccccagacgcatggccaacc120tggccggtaaaactgggtgagctgacaccgcgcggtggtgagctaatcgcctatctcgga180cattactggcgtcagcgtctggtagccgacggattgctgcctaaagaaggctgcccgcag240tctggtcaggtcgcgattattgctgatgtcgacgagcgtacccgtaaaacaggcgaagcc300ttcgccgccgggctggcacctgactgtgcaataaccgtacatcatcaggcagatacgtcc360agtcccgatccgttatttaatcctctaaaaactggcgtttgccaactggatgtcgcgaac420gtgagacgggcgatcctcagaagggcaggagggtcaattgctgactttacccggcattat480caaacggcgtttcgcgaactggaacgggtgcttaattttccgcaatcaaacttgtgcctt540aaacgtgagaaacaggacgaaagctgttcattaacgcaggcattaccatcggaactcaag600gtgagcgccgacgatgtctcattaaccggtgcggttagcctcgcatcaatgctgacggag660atatttctcctgcaacaagcacagggaatgccggagccggggtggggaaggatcaccgat720tcacaccagtggaacaccttgctaagtttgcataacgcggtgtttgatttgctacaacgc780acgccagaggttgcccgcagccgcgccaccccgttattagatttgatcaagacagcgttg840acgccccatccaccgcaaaaacaggcgtatggtgtgacattacccacttcagtgctgttt900atcgccggacacgatactaatctggcaaatctcggcggcgcactggagctcaactggacg960cttcccggtcagccggataactatccgccaggtggtgaactggtgtttgaacgctggcgt1020cggctaagcgataacagccagtggattcaggtttcgctggtcttccagactttacagcag1080atgcgtgataaaacgccgctgtcattaaatacgccgcccggagaggtgaaactgaccctg1140gcaggatgtgaagagcgaaatgcgcagggcatgtgttcgttggcaggttttacgcaaatc1200gtgaatgaagcacgcataccggcgtgcagtttgtgatga1239<210>2<211>1230<212>dna<213>人工序列<220><223>合成产生的多核苷酸<400>2cagagtgagccggagctgaagctggaaagtgtggtgattgtcagtcgtcatggtgtgcgt60gctccaaccaaggctacgcaactgatgcaggatgtcaccccagacgcatggccaacctgg120ccggtaaaactgggtgagctgacaccgcgcggtggtgagctaatcgcctatctcggacat180tactggcgtcagcgtctggtagccgacggattgctgcctaaagaaggctgcccgcagtct240ggtcaggtcgcgattattgctgatgtcgacgagcgtacccgtaaaacaggcgaagccttc300gccgccgggctggcacctgactgtgcaataaccgtacatcatcaggcagatacgtccagt360cccgatccgttatttaatcctctaaaaactggcgtttgccaactggatgtcgcgaacgtg420agacgggcgatcctcagaagggcaggagggtcaattgctgactttacccggcattatcaa480acggcgtttcgcgaactggaacgggtgcttaattttccgcaatcaaacttgtgccttaaa540cgtgagaaacaggacgaaagctgttcattaacgcaggcattaccatcggaactcaaggtg600agcgccgacgatgtctcattaaccggtgcggttagcctcgcatcaatgctgacggagata660tttctcctgcaacaagcacagggaatgccggagccggggtggggaaggatcaccgattca720caccagtggaacaccttgctaagtttgcataacgcggtgtttgatttgctacaacgcacg780ccagaggttgcccgcagccgcgccaccccgttattagatttgatcaagacagcgttgacg840ccccatccaccgcaaaaacaggcgtatggtgtgacattacccacttcagtgctgtttatc900gccggacacgatactaatctggcaaatctcggcggcgcactggagctcaactggacgctt960cccggtcagccggataactatccgccaggtggtgaactggtgtttgaacgctggcgtcgg1020ctaagcgataacagccagtggattcaggtttcgctggtcttccagactttacagcagatg1080cgtgataaaacgccgctgtcattaaatacgccgcccggagaggtgaaactgaccctggca1140ggatgtgaagagcgaaatgcgcagggcatgtgttcgttggcaggttttacgcaaatcgtg1200aatgaagcacgcataccggcgtgcagtttg1230<210>3<211>411<212>prt<213>人工序列<220><223>合成产生的多肽<400>3metglnsergluprogluleulysleugluservalvalilevalser151015arghisglyvalargalaprothrlysalathrglnleumetglnasp202530valthrproaspalatrpprothrtrpprovallysleuglygluleu354045thrproargglyglygluleuilealatyrleuglyhistyrtrparg505560glnargleuvalalaaspglyleuleuprolysgluglycysprogln65707580serglyglnvalalaileilealaaspvalaspgluargthrarglys859095thrglyglualaphealaalaglyleualaproaspcysalailethr100105110valhishisglnalaaspthrserserproaspproleupheasnpro115120125leulysthrglyvalcysglnleuaspvalalaasnvalargargala130135140ileleuargargalaglyglyserilealaaspphethrarghistyr145150155160glnthralaphearggluleugluargvalleuasnpheproglnser165170175asnleucysleulysargglulysglnaspglusercysserleuthr180185190glnalaleuprosergluleulysvalseralaaspaspvalserleu195200205thrglyalavalserleualasermetleuthrgluilepheleuleu210215220glnglnalaglnglymetprogluproglytrpglyargilethrasp225230235240serhisglntrpasnthrleuleuserleuhisasnalavalpheasp245250255leuleuglnargthrprogluvalalaargserargalathrproleu260265270leuaspleuilelysthralaleuthrprohisproproglnlysgln275280285alatyrglyvalthrleuprothrservalleupheilealaglyhis290295300aspthrasnleualaasnleuglyglyalaleugluleuasntrpthr305310315320leuproglyglnproaspasntyrproproglyglygluleuvalphe325330335gluargtrpargargleuseraspasnserglntrpileglnvalser340345350leuvalpheglnthrleuglnglnmetargasplysthrproleuser355360365leuasnthrproproglygluvallysleuthrleualaglycysglu370375380gluargasnalaglnglymetcysserleualaglyphethrglnile385390395400valasnglualaargileproalacysserleu405410<210>4<211>1266<212>dna<213>人工序列<220><223>合成产生的多核苷酸<400>4atgcagagcgagccggagctgaagctggaaagcgtggtgattgtcagtcgtcatggtgtg60cgtgctccaaccaaggctacgcaactgatgcaggatgtcaccccagacgcatggccaacc120tggccggtaaaactgggtgagctgacaccgcgcggtggtgagctaatcgcctatctcgga180cattactggcgtcagcgtctggtagccgacggattgctgcctaaagaaggctgcccgcag240tctggtcaggtcgcgattattgctgatgtcgacgagcgtacccgtaaaacaggcgaagcc300ttcgccgccgggctggcacctgactgtgcaataaccgtacatcatcaggcagatacgtcc360agtcccgatccgttatttaatcctctaaaaactggcgtttgccaactggatgtcgcgaac420gtgactcgggcgatcctcagaagggcaggagggtcaattgctgactttacccggcattat480caaacggcgtttcgcgaactggaacgggtgcttaattttccgcaatcaaacttgtgcctt540aaacgtgagaaacaggacgaaagctgttcattaacgcaggcattaccatcggaactcaag600gtgagcgccgacgatgtctcattaaccggtgcggttagcctcgcatcaatgctgacggag660atatttctcctgcaacaagcacagggaatgccggagccggggtggggaaggatcaccgat720tcacaccagtggaacaccttgctaagtttgcataacgcggtgtttgatttgctacaacgc780acgccagaggttgcccgcagccgcgccaccccgttattagatttgatcaagacagcgttg840acgccccatccaccgcaaaaacaggcgtatggtgtgacattacccacttcagtgctgttt900atcgccggacacgatactaatctggcaaatctcggcggcgcactggagctcaactggacg960cttcccggtcagccggataactatccgccaggtggtgaactggtgtttgaacgctggcgt1020cggctaagcgataacagccagtggattcaggtttcgctggtcttccagactttacagcag1080atgcgtgataaaacgccgctgtcattaaatacgccgcccggagaggtgaaactgaccctg1140gcaggatgtgaagagcgaaatgcgcagggcatgtgttcgttggcaggttttacgcaaatc1200gtgaatgaagcacgcataccggcgtgcagtttgtgatgactcgagcccaaaacgaaaggc1260tcagtc1266<210>5<211>1230<212>dna<213>人工序列<220><223>合成产生的多核苷酸<400>5cagagtgagccggagctgaagctggaaagtgtggtgattgtcagtcgtcatggtgtgcgt60gctccaaccaaggctacgcaactgatgcaggatgtcaccccagacgcatggccaacctgg120ccggtaaaactgggtgagctgacaccgcgcggtggtgagctaatcgcctatctcggacat180tactggcgtcagcgtctggtagccgacggattgctgcctaaagaaggctgcccgcagtct240ggtcaggtcgcgattattgctgatgtcgacgagcgtacccgtaaaacaggcgaagccttc300gccgccgggctggcacctgactgtgcaataaccgtacatcatcaggcagatacgtccagt360cccgatccgttatttaatcctctaaaaactggcgtttgccaactggatgtcgcgaacgtg420actcgggcgatcctcagaagggcaggagggtcaattgctgactttacccggcattatcaa480acggcgtttcgcgaactggaacgggtgcttaattttccgcaatcaaacttgtgccttaaa540cgtgagaaacaggacgaaagctgttcattaacgcaggcattaccatcggaactcaaggtg600agcgccgacgatgtctcattaaccggtgcggttagcctcgcatcaatgctgacggagata660tttctcctgcaacaagcacagggaatgccggagccggggtggggaaggatcaccgattca720caccagtggaacaccttgctaagtttgcataacgcggtgtttgatttgctacaacgcacg780ccagaggttgcccgcagccgcgccaccccgttattagatttgatcaagacagcgttgacg840ccccatccaccgcaaaaacaggcgtatggtgtgacattacccacttcagtgctgtttatc900gccggacacgatactaatctggcaaatctcggcggcgcactggagctcaactggacgctt960cccggtcagccggataactatccgccaggtggtgaactggtgtttgaacgctggcgtcgg1020ctaagcgataacagccagtggattcaggtttcgctggtcttccagactttacagcagatg1080cgtgataaaacgccgctgtcattaaatacgccgcccggagaggtgaaactgaccctggca1140ggatgtgaagagcgaaatgcgcagggcatgtgttcgttggcaggttttacgcaaatcgtg1200aatgaagcacgcataccggcgtgcagtttg1230<210>6<211>411<212>prt<213>人工序列<220><223>合成产生的多肽<400>6metglnsergluprogluleulysleugluservalvalilevalser151015arghisglyvalargalaprothrlysalathrglnleumetglnasp202530valthrproaspalatrpprothrtrpprovallysleuglygluleu354045thrproargglyglygluleuilealatyrleuglyhistyrtrparg505560glnargleuvalalaaspglyleuleuprolysgluglycysprogln65707580serglyglnvalalaileilealaaspvalaspgluargthrarglys859095thrglyglualaphealaalaglyleualaproaspcysalailethr100105110valhishisglnalaaspthrserserproaspproleupheasnpro115120125leulysthrglyvalcysglnleuaspvalalaasnvalthrargala130135140ileleuargargalaglyglyserilealaaspphethrarghistyr145150155160glnthralaphearggluleugluargvalleuasnpheproglnser165170175asnleucysleulysargglulysglnaspglusercysserleuthr180185190glnalaleuprosergluleulysvalseralaaspaspvalserleu195200205thrglyalavalserleualasermetleuthrgluilepheleuleu210215220glnglnalaglnglymetprogluproglytrpglyargilethrasp225230235240serhisglntrpasnthrleuleuserleuhisasnalavalpheasp245250255leuleuglnargthrprogluvalalaargserargalathrproleu260265270leuaspleuilelysthralaleuthrprohisproproglnlysgln275280285alatyrglyvalthrleuprothrservalleupheilealaglyhis290295300aspthrasnleualaasnleuglyglyalaleugluleuasntrpthr305310315320leuproglyglnproaspasntyrproproglyglygluleuvalphe325330335gluargtrpargargleuseraspasnserglntrpileglnvalser340345350leuvalpheglnthrleuglnglnmetargasplysthrproleuser355360365leuasnthrproproglygluvallysleuthrleualaglycysglu370375380gluargasnalaglnglymetcysserleualaglyphethrglnile385390395400valasnglualaargileproalacysserleu405410<210>7<211>1230<212>dna<213>人工序列<220><223>合成产生的多核苷酸<400>7cagagtgagccggagctgaagctggaaagtgtggtgattgtcagtcgtcatggtgtgcgt60gctccaaccaaggccatgcaactgatgcaggatgtcaccccagacgcatggccaacctgg120ccggtaaaactgggtgagctgacaccgcgcggtggtgagctaatcgcccatctcggacat180tactggcgtcagcgtctggtagccgacggattgctgcctaaatgtggctgcccgcagtct240ggtcaggtcgcgattattgctgatgtcgacgagcgtacccgtaaaacaggcgaagccttc300gccgccgggctggcacctgactgtgcaataaccgtacatacccaggcagatacgtccagt360cccgatccgttatttaatcctctaaaaactggcgtttgccaactggatgtggcgaacgtg420agacgtgcgatcctcgagagggcaggagggtcaattgctgactttaccgggcattatcaa480acggcgtttcgcgaactggaacgggtgcttaattttccgcaatcaaacttgtgccttaaa540cgtgagaaacaggacgaaagctgttcattaacgcaggcattaccatcggaactcaaggtg600agcgccgactgtgtctcattaaccggtgcggtaagcctcgcatcaatgctgacggagata660tttctcctgcaacatgcacagggaatgccggagccggggtggggaaggatcaccgattca720caccagtggaacaccttgctaagtttgcataacgcggtgtttgatttgctacaacgcacg780ccagaggttgcccgcagccgcgccaccccgttattagatttgatcaagacagcgttgacg840ccccatccaccgcaaaaacaggcgtatggtgtgacattacccacttcagtgctgtttatc900gccggacacgatactaatctggcaaatctcggcggcgcactggagctcgaatggacgctt960cccggtcagccggataactatccgccaggtggtgaactggtgtttgaacgctggcgtcgg1020ctaagcgataacagccagtggattcaggtttcgctggtcttccagactttacagcagatg1080cgtgataaaacgccgctgtcattaaatacgccgcccggagaggtgaaactgaccctggca1140ggatgtgaagagcgaaatgcgcagggcatgtgttcgttggcaggttttacgcaaatcgtg1200aatgaagcacgcataccggcgtgcagtttg1230<210>8<211>411<212>prt<213>人工序列<220><223>合成产生的多肽<400>8metglnsergluprogluleulysleugluservalvalilevalser151015arghisglyvalargalaprothrlysalametglnleumetglnasp202530valthrproaspalatrpprothrtrpprovallysleuglygluleu354045thrproargglyglygluleuilealahisleuglyhistyrtrparg505560glnargleuvalalaaspglyleuleuprolyscysglycysprogln65707580serglyglnvalalaileilealaaspvalaspgluargthrarglys859095thrglyglualaphealaalaglyleualaproaspcysalailethr100105110valhisthrglnalaaspthrserserproaspproleupheasnpro115120125leulysthrglyvalcysglnleuaspvalalaasnvalargargala130135140ileleugluargalaglyglyserilealaaspphethrglyhistyr145150155160glnthralaphearggluleugluargvalleuasnpheproglnser165170175asnleucysleulysargglulysglnaspglusercysserleuthr180185190glnalaleuprosergluleulysvalseralaaspcysvalserleu195200205thrglyalavalserleualasermetleuthrgluilepheleuleu210215220glnhisalaglnglymetprogluproglytrpglyargilethrasp225230235240serhisglntrpasnthrleuleuserleuhisasnalavalpheasp245250255leuleuglnargthrprogluvalalaargserargalathrproleu260265270leuaspleuilelysthralaleuthrprohisproproglnlysgln275280285alatyrglyvalthrleuprothrservalleupheilealaglyhis290295300aspthrasnleualaasnleuglyglyalaleugluleuglutrpthr305310315320leuproglyglnproaspasntyrproproglyglygluleuvalphe325330335gluargtrpargargleuseraspasnserglntrpileglnvalser340345350leuvalpheglnthrleuglnglnmetargasplysthrproleuser355360365leuasnthrproproglygluvallysleuthrleualaglycysglu370375380gluargasnalaglnglymetcysserleualaglyphethrglnile385390395400valasnglualaargileproalacysserleu405410当前第1页12