本发明属于人类辅助生殖领域，具体涉及一种囊胚培养液及其制备方法，其是主要用于卵裂胚至卵囊胚期间胚胎培养，为胚胎体外培养提供发育环境及所需的营养物质。
背景技术：
：囊胚培养液是辅助生殖技术中必不可少的试剂产品，应用于卵裂胚至卵囊胚期间胚胎培养，在辅助生殖医学技术中应用为该时期培养体外培养提供必需的环境和营养。囊胚培养液的用途：在辅助生殖中心胚胎实验室的二氧化碳培养箱环境下对人的卵裂胚至卵囊胚期间胚胎培养。目前，国内辅助生殖用液依赖进口，而国内暂无对这类产品进行自主生产，缺乏议价空间，价格高昂从而患者的医疗成本较高，增加了经济负担。进口产品往往需要通过长途运输，长途运输过程中因存储条件无法得到保证，运输时间较长，使得培养液使用效果下降，无法对临床的胚胎培养提高最佳效果，直接影响胚胎的发育，造成不良后果。在国内生产人类辅助生殖医学技术培养液，避免了国外进口产品因长途运输带来的不明因素，减轻患者的经济负担。目前，临床使用的常规囊胚培养液的所提供的能量物质并不能很好地贴合该时期胚胎对物质能量的需求，不能为该时期胚胎的培养提供最佳的能量需求，有效促进胚胎体外生长发育。本发明在对该时期物质需求研究基础上，在培养液中提供高浓度的葡萄糖，低浓度的丙酮酸钠及乳酸钠，以便更好地贴合该时期胚胎能量物质的需求，促进该时期胚胎细胞生长发育。此外，常规囊胚培养液通常添加无明显浓度差异水平的非必需氨基酸及必需氨基酸，并没有充分考虑卵裂胚至囊胚期间胚胎对两类氨基酸的需求的差异，会导致培养后期营养物质供给失衡及氨基酸降解的氨对胚胎产生毒性作用，胚胎发育受到抑制。常规囊胚培养液往往存在抗氧化能力不足的现象，抗氧化性低会导致氧化物对胚胎产生毒害作用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种能量物质配比适宜、满足胚胎发育特殊营养需求及抗氧化性强的囊胚培养液，不仅能为卵裂胚至囊胚期间胚胎体外培养提供充足的物质营养需求，提高囊胚率，也为胚胎体外培育提供良好的发育环境，降低培养过程中环境中过自身产生的氧化物对胚胎的毒害作用，为胚胎体外培养提供理想的环境。为实现上述目标，本发明所提供的技术方案是：一种囊胚培养液，包括水、无机盐、能量物质、氨基酸，维生素、抗氧化剂、抗菌剂、大分子物质、指示剂，缓冲系统，其特征在于，所述的能量物质包括葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠，其中葡萄糖4.1~6.0mmol/l，乳酸钠2.5~4.5mmol/l，丙酮酸0.65~0.95mmol/l。所述的氨基酸包括丙氨酰谷氨酰胺、非必需氨基酸和必需氨基酸，其中丙氨酰谷氨酰胺1.52~2.14mmol/l，非必需氨基酸0.002~0.011g/l，必需氨基酸0.008~0.165g/l。优选，柠檬酸钠的浓度为1.05~3.40mmol/l、谷胱甘肽的浓度范围为1.05~3.40mmol/l。优选，所述无机盐包括氯化钠85.0~110.0mmol/l、硫酸镁0.10~0.90mmol/l、磷酸二氢钾0.42~0.78mmol/l、氯化钾4.3~8.1mmol/l和氯化钙1.6~4.2mmol/l。优选，所述维生素浓度为0.001~0.003g/l。优选，所述抗菌剂为庆大霉素，浓度为9.5~12.0mg/l；所述大分子物质为人血清白蛋白按9.5~11.0mg/ml的浓度添加至溶液中，或不添加人血清白蛋白，但在临床使用时按9.5~11.0mg/ml的浓度添加人血清白蛋白；还有缓冲物质碳酸氢钠，浓度24.5~28.6mmol/l；所述指示剂为酚红，最佳浓度为0.009mmol/l。优选，所述的囊胚培养液包括碳酸氢钠27.3mmol/l、氯化钙2.3mmol/l、氯化钾6.1mmol/l、氯化钠98.5mmol/l、硫酸镁0.38mmol/l、磷酸二氢钾0.61mmol/l、酚红0.009mmol/l、丙氨酰谷氨酰胺1.82mmol/l、葡萄糖5.4mmol/l、丙酮酸钠为0.72mmol/l、乳酸钠为3.13mmol/l、庆大霉素10mg/l、非必需氨基酸0.0051g/l、必需氨基酸0.1118g/l、维生素0.0026g/l（mem维生素溶液·(100×)sigma:m6895，实施例也是用这个维生素溶液）、柠檬酸钠1.87mmol/l、谷胱甘肽2.31mmol/l和人血清白蛋白10.8mg/ml，溶剂为水。本发明的第二个目的是提供一种囊胚培养液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将各成分混合均匀形成囊胚培养液，所述的能量物质包括葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠，其中葡萄糖4.1~6.0mmol/l，乳酸钠2.5~4.5mmol/l，丙酮酸0.65~0.95mmol/l。优选，配方：所述的囊胚培养液包括碳酸氢钠27.3mmol/l、氯化钙2.3mmol/l、氯化钾6.1mmol/l、氯化钠98.5mmol/l、硫酸镁0.38mmol/l、磷酸二氢钾0.61mmol/l、酚红0.009mmol/l、丙氨酰谷氨酰胺1.82mmol/l、葡萄糖5.4mmol/l、丙酮酸钠为0.72mmol/l、乳酸钠为3.13mmol/l、庆大霉素10mg/l、非必需氨基酸0.0051g/l、必需氨基酸0.1118g/l、维生素0.0026g/l、柠檬酸钠1.87mmol/l、谷胱甘肽2.31mmol/l和人血清白蛋白10.8mg/ml，溶剂为水；将氯化钙、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠按先固体后液体的顺序溶入注射用水中；然后将丙氨酰谷氨酰胺、非必需氨基酸和必需氨基酸，柠檬酸钠、谷胱甘肽、庆大霉素、维生素、酚红加入，持续搅拌使其充分溶解，并通入5%~6%的co2气体，然后将人血清白蛋白按比例添加或在临床使用时添加人血清白蛋白，过滤除菌，由此得到囊胚培养液。（2）检测步骤（1）所得溶液的渗透压和ph值，记录最终渗透压和ph值；所述渗透压保持在260~290mosm/kg，所述ph值维持在7.1~7.5；（3）将步骤（2）检验合格后的溶液经0.1μm过滤器过滤到无菌密封罐中，由此得到囊胚培养液；（4）将步骤（3）无菌密封罐转移至百级层流系统中进行无菌灌装，贴标，包装，并至于2~8℃下贮存；（5）随机抽取包装好的囊胚培养液成品进行检测，检测项目及其参数：ph值：7.1~7.5渗透压：260~290mosm/kg内毒素：＜0.05eu/ml无菌检查：合格鼠胚试验：1-细胞鼠胚试验96小时内扩张囊胚率≥80%也可以等步骤（2）所得溶液渗透压和ph值，并记录最终数据后，按照所配制溶液的量，将人血清白蛋白添加至溶液中。或步骤（2）完成后不添加人血清白蛋白，但在临床使用时添加人血清白蛋白。有益效果本发明所述的囊胚培养液具有高葡萄糖，低丙酮酸钠及乳酸钠的特点，匹配卵裂胚至囊胚期间胚胎对能力物质利用特点的，有效促进胚胎的发育。此外，针对性地必需氨基酸的比例，降低非必需氨基酸的比例，为该时期胚胎发育所需的特殊营养物质，满足该时期对营养物质的需求，同时避免加入过多非必需氨基酸造成降解成分对胚胎产生毒性作用。丙酮酸钠及乳酸钠作为能量物质的同时，与柠檬酸钠及谷胱甘肽联合作为抗氧化剂，四种抗氧化剂联合发挥作用能有效减低环境及自身产生的氧化物对胚胎的毒害，为胚胎体外发育营造良好的发育环境。具体实施方式下面结合具体实施方式对本说明做进一步说明。实施例1配方1、配方2、配方3、配方4、配方5成分如表1所示，水为溶剂，表1组分名称配方1配方2配方3配方4配方5碳酸氢钠mmol/l27.327.327.327.327.3氯化钙mmol/l2.32.32.32.32.3氯化钾mmol/l6.16.16.16.16.1氯化钠mmol/l98.598.598.598.598.5硫酸镁mmol/l0.380.380.380.380.38磷酸二氢钾mmol/l0.610.610.610.610.61酚红mmol/l0.0090.0090.0090.0090.009丙氨酰谷氨酰胺mmol/l1.821.821.821.821.82葡萄糖mmol/l3.15.44.16.07.3丙酮酸钠mmol/l0.720.720.720.720.72乳酸钠mmol/l3.133.133.133.133.13庆大霉素mg/l1010101010非必需氨基酸（g/l）0.00510.00510.00510.00510.0051必需氨基酸（g/l）0.11180.11180.11180.11180.1118维生素（g/l）0.00260.00260.00260.00260.0026柠檬酸钠mmol/l1.871.871.871.871.87谷胱甘肽mmol/l2.312.312.312.312.31人血清白蛋白（mg/ml）10.810.810.810.810.8（1）按照配方表称量好所有组分，备用；按表1的成分表，将氯化钙、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠按先固体后液体的顺序溶入注射用水中；然后将丙氨酰谷氨酰胺、非必需氨基酸和必需氨基酸，柠檬酸钠、谷胱甘肽、庆大霉素、维生素、酚红加入，持续搅拌使其充分溶解，并通入5%~6%的co2气体，然后加入人血清白蛋白，补足注射用水，过滤除菌，由此得到溶液。（2）检测步骤（1）所得溶液的渗透压和ph值，记录最终渗透压和ph值；所述渗透压保持在260~290mosm/kg，所述ph值维持在7.1~7.5；（3）将步骤（2）检验合格后的溶液经0.1μm过滤器过滤到无菌密封罐中，由此得到囊胚培养液，取样测试；测试参数：ph值：7.1~7.5渗透压：260~290mosm/kg内毒素：＜0.05eu/ml无菌检查：合格鼠胚试验：1-细胞鼠胚试验96小时内扩张囊胚率≥80%（4）将步骤（3）无菌密封罐转移至百级层流系统中进行无菌灌装，贴标、包装，并至于2~8℃下贮存。所述配方1、配方2、配方3、配方4、配方5主要是葡萄糖浓度不同，其他组分含量均一致，配方1葡萄糖含量与常规囊胚培养液含量相当。使用配方1~配方5配制的囊胚培养液分别对100个小鼠卵裂胚胚胎进行体外培养至囊胚。将100个卵裂胚胚胎均分为10组，每组10个，且每组均加入相同体积的培养液，培养至第3天后在显微镜下观察统计囊胚率，结果如表2：表2组别配方1配方2配方3配方4配方5葡萄糖mmol/l3.15.44.16.07.3卵裂胚胚胎数（个）100100100100100囊胚数量（个）7696898673囊胚率（%）7696898673p值—0.00340.0090.0130.189数据结果表明，配方1葡萄糖浓度为3.1mmol/l时，囊胚率只有76%，当葡萄糖浓度提高到4.1mmol/l时，囊胚率提高至89%，葡萄糖浓度为5.4mmol/l时，囊胚率最高达到96%，当葡萄糖浓度达到6.0mmol/l时，囊胚率会较配方2稍微降低，但仍明显高于常规囊胚培养液配方1的低葡萄糖浓度的效果。但当葡萄糖浓度升高至7.3mmol/l时，囊胚率又会显著降低，只有73%。配方2~5数据分别与配方1数据进行差异性分析，配方2~4与配方1之间p值均小于0.05具有显著性差异。而配方5与配方1进行比较p值大于0.05，两个配方的培养液培养效果不具有显著性差异。因此，适当提高囊胚培养液葡萄糖浓度可以有效提高囊胚率，但过高浓度的葡萄糖也会抑制胚胎生长过程，囊胚培养液葡萄糖浓度在4.1~6.0mmol/l能取得最佳的受精效果，有效提高体外培养的囊胚率。实施例2根据配方a、配方b、配方c、配方d、配方e成分表（表3），称取相应物料按照以下制备方法配制囊胚培养液。表3组分名称配方a配方b配方c配方d配方e碳酸氢钠mmol/l27.327.327.327.327.3氯化钙mmol/l2.32.32.32.32.3氯化钾mmol/l6.16.16.16.16.1氯化钠mmol/l98.598.598.598.598.5硫酸镁mmol/l0.380.380.380.380.38磷酸二氢钾mmol/l0.610.610.610.610.61酚红mmol/l0.0090.0090.0090.0090.009丙氨酰谷氨酰胺mmol/l1.821.821.821.821.82葡萄糖mmol/l5.45.45.45.45.4丙酮酸钠mmol/l0.720.720.720.720.72乳酸钠mmol/l3.133.133.133.133.13庆大霉素mg/l1010101010非必需氨基酸（g/l）00.01570.00510.00510.0121必需氨基酸（g/l）0.11180.00430.11180.20890.1118维生素（g/l）0.00260.00260.00260.00260.0026柠檬酸钠mmol/l1.871.871.871.871.87谷胱甘肽mmol/l2.312.312.312.312.31人血清白蛋白（mg/ml）10.810.810.810.810.8（1）按照配方表称量好所有组分，备用；按表3的成分表，将氯化钙、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠按先固体后液体的顺序溶入注射用水中；然后将丙氨酰谷氨酰胺、非必需氨基酸和必需氨基酸，柠檬酸钠、谷胱甘肽、庆大霉素、维生素、酚红加入，持续搅拌使其充分溶解，并通入5%~6%的co2气体，然后加入人血清白蛋白，补足注射用水，过滤除菌，由此得到溶液。（2）检测步骤（1）所得溶液的渗透压和ph值，记录最终渗透压和ph值；所述渗透压保持在260~290mosm/kg，所述ph值维持在7.1~7.5；（3）将步骤（2）检验合格后的溶液经0.1μm过滤器过滤到无菌密封罐中，由此得到囊胚培养液，取样测试；测试参数：ph值：7.1~7.5渗透压：260~290mosm/kg内毒素：＜0.05eu/ml无菌检查：合格（4）将步骤（3）无菌密封罐转移至百级层流系统中进行无菌灌装，贴标。所述配方a、配方b、配方c、配方d、配方e主要是非必需氨基酸和必需氨基酸比例不同，其他组分含量均一致，配方b非必需氨基酸和必需氨基酸与常规囊胚培养液含量相当。使用配方a~配方e配制的培养液分别培养100个小鼠卵裂胚胚胎进行体外培养至囊胚。将100个卵裂胚胚胎平均分为10组，每组10个，且每组均加入相同体积的培养液，培养至第3天后在显微镜下观察统计囊胚率，检测培养后培养液中氨的含量，结果如下（表4）：表4组别配方a配方b配方c配方d配方e非必需氨基酸（g/l）00.01570.00510.00510.0121必需氨基酸（g/l）0.11180.00430.11180.20890.1118卵裂胚胚胎数量（个）100100100100100囊胚率（%）4972968678氨的含量（mol/l）0.090.440.180.210.32数据结果表明，当培养液中只添加必需氨基酸不添加非必需氨基酸时，取得的囊胚率较低，只有49%，但检测到培养后的氨含量较低为0.09mol/l。配方b为常规囊胚培养液氨基酸的添加比例，非必需氨基酸的添加量相对较高，必需氨基酸添加量相对较低，该配方取得的囊胚率为72%，与配方a相比有所提高，但低于80%。通过配方a与配方b氨含量的比较，配方b氨含量显著提高，达到0.44mol/l。配方c降低非必需氨基酸的比例，提高必需氨基酸的比例，取得最佳培养效果，亦是本发明的最佳方案，囊胚率达到96%且氨的含量相对配方b也明显降低。配方d在配方c的基础上保持非必需氨基酸比例不变，提高必需氨基酸的含量，其囊胚率较配方c略有降低且氨含量稍有上升，但效果优于配方b。配方e在配方c的基础上保持必需氨基酸含量不变，提高非必需氨基酸的比例，其囊胚率低于80%且氨含量上升。因此，囊胚培养液中不添加非必需氨基酸或添加较高浓度的氨基酸均不利于胚胎细胞的生长，氨基酸的比例增加培养过程中氨含量会升高，氨对胚胎细胞有毒性，会影响囊胚形成。本发明最优方案为非必需氨基酸添加量为0.0051g/l，必需氨基酸0.1118g/l。实施例3根据配方i、配方ii、配方iii、配方iv、配方v成分表（表5），称取相应物料按照下述制备方法配制囊胚培养液。表5组分名称配方i配方ii配方iii配方iv配方v碳酸氢钠mmol/l27.327.327.327.327.3氯化钙mmol/l2.32.32.32.32.3氯化钾mmol/l6.16.16.16.16.1氯化钠mmol/l98.598.598.598.598.5硫酸镁mmol/l0.380.380.380.380.38磷酸二氢钾mmol/l0.610.610.610.610.61酚红mmol/l0.0090.0090.0090.0090.009丙氨酰谷氨酰胺mmol/l1.821.821.821.821.82葡萄糖mmol/l5.45.45.45.45.4丙酮酸钠mmol/l0.720.720.720.720.72乳酸钠mmol/l3.133.133.133.133.13庆大霉素mg/l1010101010非必需氨基酸（g/l）0.00510.00510.00510.00510.0051必需氨基酸（g/l）0.11180.11180.11180.11180.1118维生素（g/l）0.00260.00260.00260.00260.0026柠檬酸钠mmol/l—4.18—1.871.34谷胱甘肽mmol/l——4.182.312.84人血清白蛋白（mg/ml）10.810.810.810.810.8注：配方表中“—”代表不添加该组分。（1）按照配方表称量好所有组分，备用；按表5的成分表，将氯化钙、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠按先固体后液体的顺序溶入注射用水中；然后将丙氨酰谷氨酰胺、非必需氨基酸和必需氨基酸，柠檬酸钠、谷胱甘肽、庆大霉素、维生素、酚红加入，持续搅拌使其充分溶解，并通入5%~6%的co2气体，然后加入人血清白蛋白，补足注射用水，过滤除菌，由此得到溶液。（2）检测步骤（1）所得溶液的渗透压和ph值，记录最终渗透压和ph值；所述渗透压保持在260~290mosm/kg，所述ph值维持在7.1~7.5；（3）将步骤（2）检验合格后的溶液经0.1μm过滤器过滤到无菌密封罐中，由此得到囊胚培养液，取样测试；测试参数：ph值：7.1~7.5渗透压：260~290mosm/kg内毒素：＜0.05eu/ml无菌检查：合格（4）将步骤（3）无菌密封罐转移至百级层流系统中进行无菌灌装，贴标。所述配方i、配方ii、配方iii、配方iv、配方v主要是抗氧化剂柠檬酸钠、谷胱甘肽浓度不同，其他组分含量均一致。使用配方i~配方v配制的培养液分别培养100个小鼠卵裂胚胚胎体外培养至囊胚。将100个卵裂期胚胎随机分为10组，每组10个，且每组均加入相同体积的培养液，培养至第3天后在显微镜下观察统计囊胚率。将配方i~iii、v卵裂胚数据分别与配方iv囊胚数据进行差异性比较，结果如下（表6）：表6组别配方i配方ii配方iii配方iv配方v柠檬酸钠mmol/l—4.18—1.871.34谷胱甘肽mmol/l——4.182.312.84卵裂胚胚胎数量（个）100100100100100囊胚率（%）6671769689p值0.00080.00130.0042—0.062数据结果表明，配方i~iii中不添加或只添加柠檬酸钠和谷胱甘肽其中一种的囊胚胚培养液，囊胚率均低于80%，当培养液中同时添加柠檬酸钠和谷胱甘肽时，囊胚率明显提高，囊胚率≥89%，配方iv当添加的柠檬酸钠1.87mmol/l、谷胱甘肽2.31mmol/l时，取得的胚胎培养效果最佳，囊胚率可达96%，为本发明最优方案。配方i~iii、v与配方iv进行差异分析数据显示，配方i~iii与配方iv的p值小于0.05，具有显著性差异，而添加了两种抗氧化剂的配方v与配方iv之间p值大于0.05，不具有显著性差异，因此可知，在丙酮酸钠、乳酸钠的基础上，同时添加抗氧化剂柠檬酸钠和谷胱甘肽能有效促进胚胎生长发育。虽然培养液中含有另外两种抗氧化剂丙酮酸钠、乳酸钠但缺乏柠檬酸钠和谷胱甘肽或其中一种时，胚胎发育受到阻滞，丙酮酸钠、乳酸钠主要降低胚胎细胞内的过氧化氢水平，柠檬酸钠和谷胱甘肽主要用于降低环境中过氧化物对胚胎细胞的毒性作用，四种成分联合是使用方可取得最优的培育效果。以上是实施例仅用以说明本发明的技术方案并非限制，对于本领域的普通技术人员来说，对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明原理的基础上，其均应涵盖在本发明权利要求范围内。实施例4：本实施例的囊培养液包括碳酸氢钠28.6mmol/l、氯化钙4.2mmol/l、氯化钾8.1mmol/l、氯化钠110mmol/l、硫酸镁0.9mmol/l、磷酸二氢钾0.78mmol/l、酚红0.009mmol/l、丙氨酰谷氨酰胺2.14mmol/l、葡萄糖6mmol/l、丙酮酸钠为0.95mmol/l、乳酸钠为4.5mmol/l、庆大霉素12mg/l、非必需氨基酸0.011g/l、必需氨基酸0.165g/l、维生素0.003g/l、柠檬酸钠3.4mmol/l、谷胱甘肽3.4mmol/l和人血清白蛋白11mg/ml，溶剂为水。其制备方法同实施例1，由此得到囊胚培养液。实施例5：本实施例的囊胚培养液包括碳酸氢钠24.5mmol/l、氯化钙1.6mmol/l、氯化钾4.3mmol/l、氯化钠85mmol/l、硫酸镁0.1mmol/l、磷酸二氢钾0.42mmol/l、酚红0.009mmol/l、丙氨酰谷氨酰胺1.52mmol/l、葡萄糖4.1mmol/l、丙酮酸钠为0.65mmol/l、乳酸钠为2.5mmol/l、庆大霉素9.5mg/l、非必需氨基酸0.002g/l、必需氨基酸0.008g/l、维生素0.001g/l、柠檬酸钠1.05mmol/l、谷胱甘肽1.05mmol/l和人血清白蛋白9.5mg/ml，溶剂为水。其制备方法同实施例1，由此得到囊胚培养液。以上是实施例仅用以说明本发明的技术方案并非限制，对于本领域的普通技术人员来说，对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明原理的基础上，其均应涵盖在本发明权利要求范围内。当前第1页1 2 3