一种蓝藻抗病毒蛋白N的制备方法及应用与流程

本发明涉及基因工程领域，具体涉及重组蓝藻抗病毒蛋白n的分离纯化。

背景技术：

蓝藻抗病毒蛋白n(cyanovirin-n，cv-n)是一种从蓝藻中分离得到的一种水溶性糖蛋白，能够有效的抑制多种病毒的生长。cv-n包含101个氨基酸的独特序列。bewley等人利用高分辨率核磁共振技术对溶解态cv-n的结构进行了研究，发现其大部分具有细长结构且内部为2倍假对称性的β片层的三级结构。[o’keefebr，smeedf，turpinja，etal.potentanti-influenzaactivityofcyanovirin-nandinteractionswithviralhemagglutinin[j].antimicrobialagents&chemotherapy，2003，47(8)：2518.]研究发现其对多种病毒都具有有效的抗性。cv-n与在许多不同病毒表面上的甘露糖残基，包括人免疫缺陷病毒(hiv)的包膜糖蛋白gp120存在相互作用。另外有研究表明cv-n在抗病毒生物合成上也有重要作用，例如cv-n抗hsv-1作用靶位主要在于抑制感染细胞内病毒的生物合成。[刘宗涛，于红，尹延梅.重组蓝藻抗病毒蛋白n的纯化复性及其抗单纯疱疹病毒1型活性的研究[j].中国海洋药物(3)：4-8.]。

早在cv-n发现之初，boyd等利用人工合成的方法由cv-n序列和一段8肽的引导序列(asptyrlysaspaspaspasplys)连接而成的基因片段，经pcr扩增后克隆于pflag质粒上，构建成分泌型表达载体，并在e.coli中诱导表达成功，以flag-cv-n融合蛋白的形式表达cv-n，但并未得到良好的可溶性表达[boydmr，gustafsonkr，mcmahonjb，etal.discoveryofcyanovirin-n，anovelhumanimmunodeficiencyvirus-inactivatingproteinthatbindsviralsurfaceenvelopeglycoproteingp120：potentialapplicationstomicrobicidedevelopment[j].antimicrobagentschemother，1997，41(7)：1521-1530.]。此后的几年中，研究的方向转向cv-n在真核细胞中的表达和纯化。

在应用基因工程技术进行cv-n的重组及其在原核，真核中表达时他们发现，由于cv-n特殊的折叠方式，与其内部由半胱氨酸残基形成的两个二硫键和其表面潜的疏水结构，一方面保证了其稳定性，另一方面也致使其在克隆表达中大多存在包涵体，或者表达量低等问题[yangf，bewleyca，louisjm，etal.crystalstructureofcyanovirin-n，apotenthiv-inactivatingprotein，showsunexpecteddomainswapping.[j].journalofmolecularbiology，1999，288(3)：403-412.]。

origamib(de3)菌株包含突变的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxinreductase)(trxb)和谷胱甘肽还原酶(glutathionereductase)(gor)基因，表达主要还原途径的两个关键酶，有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性[chantarangseem，tanthanuchw，fujimurat，etal.molecularcharacterizationofβ-galactosidasesfromgerminatingrice(oryzasativa)[j].plantscience，2007，173(2)：118-134.]。该菌株染色体整合了λ噬菌体de3区(de3区含有t7噬菌体rna聚合酶)，可同时表达t7rna聚合酶和大肠杆菌rna聚合酶，可用于pet系列，pgex，pmal等质粒的蛋白表达，具有卡那霉素和四环素抗性。利用origamib(de3)菌株作为表达的寄主细胞，帮助蛋白正确折叠。能够有效提高蛋白的表达量，减少包涵体的生成等优点。

技术实现要素：

为了克服现有的表达产量不高，容易形成包涵体等问题，本发明旨在提供一种能够高效表达可溶性重组蓝藻抗病毒蛋白n的菌株。

本发明的另一目的是利用上述菌株建立高效表达重组蓝藻抗病毒蛋白n的方法。

本发明的最后目的是利用上述菌株/蛋白应用于制备抗病毒药物。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下。

本发明首先基于人工合成的cv-n基因序列，利用pcr扩增技术得到cv-n基因。

本发明其次通过pgex-4t-1表达系统，构建含有cv-n的表达载体。pgex-4t-1表达系统在目的蛋白前会添加一段gst标签。

本发明进一步提供了包含其表达载体的宿主细胞origamib(de3)得到了高纯度的重组蛋白。

通过对gst标签的巧妙应用得到纯化的gst-cv-n。并且利用凝血酶对gst标签的特异性切割，得到纯化的蓝藻抗病毒蛋白n。

有益效果

gst标签的特异性吸附，简化了下游纯化步骤，并且在特异性蛋白酶的帮助下得到不带标签的cv-n。凝血酶相对于其他标签酶价格低廉。

重组可溶性表达蛋白gst-cv-n占总蛋白比例较高达到45％，较已有的方法而言大大的提高了可溶性蛋白的比例。经分离纯化和gst标签切除后1l的发酵产物可以得到12.4±0.5mgcv-n。

附图说明

图1是pcr反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳的结果。

其中m：dnamarker15000，1：cv-n基因。

图2是pgex-4t-1-cv-n质粒的结构示意图。

图3是重组质粒pgex-4t-1-cv-n质粒通用引物鉴定的结果。

其中m：dnamarker15000，1：重组质粒pgex-4t-1-cv-n作为模板，2：pgex-4t-1作为模板。

图4为重组质粒t-cv-n测序鉴定图。

图5是重组质粒pgex-4t-1-cv-n测序鉴定图。

图6是cv-n诱导表达纯化图。

m：蛋白marker，1：对空载pgex-4t-1的诱导。2：重组蛋白的诱导前，3：gst-cv-n诱导后上清，4：gst-cv-n诱导后沉淀，5：gst-cv-n蛋白上清纯化后。

图7是利用免疫印迹技术鉴定融合蛋白gst-cv-n。

图8gst-cv-n标签的切割，得到不带有标签的蓝藻抗病毒蛋白n。

m：蛋白marker，1：纯化后的gst-cv-n，2：gst-cv-n.用凝血酶切割后，3：cv-n蛋白纯化后。

图9高效液相色谱鉴定cv-n纯度。

图10cv-n对hepg2.215细胞毒性鉴定。

图11通过对hbv的pgrna的测定检测重组cv-n的抗病毒活性。

具体实施方法

本发明主要材料如下：携带cv-n基因的puc质粒、引物均由上海生工合成：宿主菌origamib(de3)、dh5α、质粒pgex-4t-1、细胞hepg2.215由本实验室保存，限制性内切酶bamhi、sali、t4dna连接酶、t载体、各种dnamaker等购自takara公司，srtsec-150a(7.8mm×300mm，5μm)色谱柱购自sepax公司，牛凝血酶购自北京博尔西科技有限公司，谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4b购自solarbio公司，pcrtaqplusmastermi购自abm公司，氨苄青霉素、卡那霉素购自biosharp公司，胰蛋白胨和酵母浸出粉oxoid公司，琼脂粉购自武汉华顺生物技术有限公司，bugbusterproteinextractionreagent购自merck公司，琼脂糖凝胶dna回收试剂盒购自comiike公司，质粒小量提取试剂盒购自bioflux公司。dmem培养基、胎牛血清购自gibco公司，gst抗体购自联科生物，qrtsupermixforqpcr购自上海天为生物科技有限公司，其他试剂均为分析纯试剂。cv-n全序列

根据大肠杆菌的密码子的偏爱性，对cv-n进行优化并送至生工公司合成

蓝藻抗病毒蛋白n：

实施例1质粒pgex-4t-1-cv-n质粒的构建

根据pgex-4t-1载体序列和cv-n序列的的特点，选择合适的酶切位点，并且按照引物设计的一般原则，设计引物。下列引物为本发明所需引物：

pcr扩增目的序列，反应体系为puc质粒2μl(约1ng)、cv-nr/cv-nf各1μl、pcrmix25μl、水21μl、合计50μl，pcr扩增条件为94℃预变性10min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环数，最后再72℃5min。cv-n基因全长为303bp，反应产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定符合预期大小(图1)。

胶回收得到cv-n全长序列，将胶回收产物与t载体进行连接，连接比例按照说明书，总体系10μl混合均匀，16摄氏度连接过夜，得到重组质粒t-cv-n。将t-cv-n转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，37℃培养过夜，挑取重组子扩大培养并进行测序。结果表明序列完全正确(图4)

将质粒t-cv-n和pgex-4t-1分别用bamhi和sali进行双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物，利用t4连接酶，按照试剂盒说明书设置连接比例，总体系15μl，混合均匀，16℃连接过夜。得到的重组质粒pgex-4t-1-cv-n转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养过夜。挑取重组子利用通用引物(表2)进行pcr鉴定，并进行测序。测序结果表明序列完全正确(图5)

实施例2重组蛋白的表达纯化鉴定

1、表达菌株的筛选及诱导表达

挑取测序正确的重组子，扩大培养后提取质粒转化至表达宿主origamib(de3)中，用含有氨苄和卡那的lb筛选出转化子，挑取单菌落至含有50μg/ml氨苄，10μg/ml卡那的200mllb液体培养基中37℃，220r/min扩大培养。在od值到达0.6时取1ml未诱导对照，离心收集菌体沉淀，加入1*sds上样缓冲液，煮沸后备用。其余加入iptg使其终浓度为0.1mol/l。30℃，200r/min，诱导表达3小时。

2、表达产物的纯化

离心收集菌体，加入3mlbugbusterproteinextractionreagent重悬100ml细菌培养物，将其混匀。在室温静止25min。裂解细菌，12000r/min离心10min分别收集上清和沉淀。取上清和沉淀各150μl，加入5*sds上样缓冲液，煮沸后备用。

取上清加入已经处理好的谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，于室温轻轻摇动1小时，将混合物500g离心5min，小心去掉上清并留样500μl电泳，沉淀中加入10倍床体积的的冷的pbs，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白，重复以上步骤两次，沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min，洗脱树脂上结合的蛋白。4℃以500g离心5分钟，上清(含洗脱的融合蛋白)移至新管中。重复两次，合并3次上清。在洗脱的蛋白上清中加入32μl凝血酶(1u/μl)，于37℃之间切割10h。重复以上纯化步骤，回收目的蛋白。

经sds-page检测发现在上清的37kd处存在一条特异性蛋白条带，并且已知cv-n蛋白大小为11kd，所以gst-cv-n的理论相对分子质量为37kd，表达结果与预期大小相符。说明cv-n蛋白在origamib(de3)中表达成功，并且蛋白为可溶性表达(图6)。对图6泳道3和泳道4经灰度分析可知可溶性表达的目的蛋白gst-cv-n占总表达的gst-cv-n的69.9％，对泳道3分析可知可溶性表达的目的蛋白占上清中总蛋白的45％。

利用western-blot技术分析gst-cv-n，孵育gst抗体在37kd处存在特异性条带(图6)，可以证明在37kd处确实为重组蛋白gst-cv-n。利用tricine-sds-page对切除gst标签并纯化的蛋白进行分析，11kda处可见清晰单一条带(图8)，可知得到纯化的蛋白cv-n。

实施例3色谱分析蓝藻抗病毒蛋白n纯度

色谱柱为sepaxsrtsec-150a(7.8mm×300mm，5μm)，取cv-n适量，使其溶于pbs中使其终浓度达到1mg/ml，作为供试品溶液。以5mm乙酸铵∶甲醇＝100∶1溶液为流动相，等度洗脱，流速为0.6ml/min，柱温为30℃。以dad检测器检测280nm下的吸光值。经电脑记录并绘图，由图11可以看到得到单一洗脱峰。

实施例4蓝藻抗病毒蛋白n活性测定

hepg2.215细胞是美国mountsinai医学中心在hepg2细胞株基础上建立的，其在hbv相关研究领域内细胞培养中最常用的细胞模型之一[sellsma，chenml，acsg.productionofhepatitisbvirusparticlesinhepg2cellstransfectedwithclonedhepatitisbvirusdna[j].procnatlacadsciusa，1987，84(4)：1005-1009.]。它将含有hbv基因组的重组载体质粒转染hepg2细胞，经g418筛选得到，得到的hepg2.215细胞克隆能稳定分泌hbsag、hbeag及dane颗粒，可在培养细胞的上清液内检测到hbvdna和rna。

在传统的乙肝病毒的抗病毒测定中通常检测dna或者hbsag，但是就目前的治疗水平来说几乎不能达到乙肝完全治愈，长期抗病毒治疗理想的停药终点是hbsag消失，但因为hbsag既可由hbv共价闭合环状dna(cccdna)转录表达，又可由hbv整合dna转录表达，患者经过长期抗病毒治疗，血清hbsag消失可能需要36～52年的时间。所以经研究发现在hbv病毒中存在一种3.5kb的rna叫做pgrna。它是cccdna以自身为模板转录而来。pgrna可以作为逆转录的模板生成dna的负链，而dna的负链既可以生成cccdna又可以以自身为模板生成合成正链进而生成新的乙肝病毒。所以pgrna至关重要它既可以作为一种治疗终止的指标。也可以作为在传统治疗以外的新手段[wangj，shent，huangx，etal.serumhepatitisbvirusrnaisencapsidatedpregenomernathatmaybeassociatedwithpersistenceofviralinfectionandrebound[j].journalofhepatology，2016.]。

测定抗病毒活性分两方面，首先测定抗病毒蛋白的对hepg2.215细胞的细胞毒性，从液氮中取出冻存的hepg2.215细胞，复苏。在dmem培养基，10％胎牛血清37℃，co25％的条件下培养48小时以后传代，待细胞密度达到80％时铺板，铺板时使细胞密度达到10％，铺板28h后给纯化的cv-n，0μg/ml，tris，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，，100μg/ml给药72小时后利用mtt测定细胞存活率。

每孔加入11μl噻唑蓝使其终浓度达到10％，继续在细胞培养箱中放置4小时，弃去孔中的液体加入150μldmso，在摇床上震荡10min后通过酶标仪测定其在570nm下的吸光值。graphpad绘制柱状图，并通过单因素方差对其显著性进行检验，由图10可知cv-n对hepg2.215细胞无细胞毒性。

测定抗病毒蛋白n的抗乙肝病毒活性，从液氮中取出冻存的hepg2.215细胞，复苏。在dmem培养基，10％胎牛血清37℃，co25％。培养48小时以后传代，待细胞密度达到80％时铺板，铺板时使细胞密度达到10％，48h后给纯化的cv-n0μg/ml，3.125μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，同时给予10μm的拉夫米定作为阳性药。给药72小时后提取rna。

逆转录合成cdna，逆转录体系为rnasefreeddh2oto10μl，5*qrtsupermix2μl，模板rnatotal1pg-1μg。

以cdna为模板做qpcr，qpcr反应体系为2*chamquniversalsybrqpcrmastermix10μl，分别以pgrnar/pgrnaf，gapdhr/gapdhf1μl为引物，cdnaxμl，加水至20μl。qpcr反应分为三个阶段，首先预变性90℃，30s，其次是循环反应95℃10s，60℃30s，95℃15s，共40个循环，最后是溶解曲线60℃60s，95℃15s。

得到的结果利用amountoftarget＝2^-δδct进行分析，并用graphpad进行绘图，(图11)再利用单因素方差分析对其显著性进行检验。通过单因素方差检验得知在cv-n终浓度为12.5μg/ml时对hbv病毒的pgrna存在显著性抑制。

综上所述，本发明构建了pgex-4t-1-cv-n重组表达质粒，在大肠杆菌origamib(de3)中表达成功。gst-cv-n经过谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化后利用凝血酶在37℃下切割8小时，进一步纯化可得到高纯度的cv-n。经过tricine-sds-page电泳发现其分子量大小与文献报道完全相同。在hepg2.215细胞模型中对其抗hbv病毒活性测定发现。重组蛋白cv-n具有良好的抗病毒活性。本实验结果表明在大肠杆菌origamib(de3)宿主菌中表达的cv-n，克服了其他表达产量低，易形成包涵体，或者纯化困难，成本较高等特点。

上述实验方案为本实验的较佳实验方案，但本实验并不仅仅局限于上述实验条件，其他简化，修改或者替换都应在本专利保护范围以内。