本发明涉及微藻生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种促进微藻虾青素酯化的方法。
背景技术：
虾青素(3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’-胡萝卜素)是一种天然红色的酮基类胡萝卜素，通常存在于甲壳动物、植物和包括微藻在内的微生物中；
其中，天然虾青素来源于虾蟹和红法夫酵母，这些来源的虾青素含量只在0.15％到0.4％之间，不能满足市场高效利用的需求。微生物是天然虾青素的最佳来源，尤其是某些微藻，如雨生红球藻(haematococcuspluvialis)，细胞内虾青素含量最高可达藻细胞干重的4.0％，而且虾青素全为左旋(3s-3”s)结构，活性强于其他来源的虾青素，所以微藻是天然虾青素的最佳来源。
由于虾青素分子两端的羟基很不稳定，在自然环境中游离虾青素容易被氧化。为了保持虾青素分子的稳定性，在三文鱼肌肉和龙虾外骨骼中，虾青素和蛋白结合存在。在雨生红球藻中部分的虾青素分子以虾青素酯的形式存在，这些虾青素和微藻体内的酸酯化后存储在细胞油滴中。
虾青素酯化在微藻合成虾青素过程中是一个重要的步奏，酯化过程可以调控促进虾青素的形成和积累，所以开发促进微藻虾青素酯化的工艺对于微藻生产制备虾青素和进一步商业化开发利用具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种促进微藻虾青素酯化的方法，其操作方便，原料简单，不采用卤素、金属盐等作为诱导剂，而是添加外源脂肪酸进行诱导，使得微藻体内的游离虾青素迅速转化为酯化虾青素，使得微藻生成虾青素的反应正向进行，大大提高了微藻的虾青素产率，防止了因游离虾青素累积抑制微藻生产虾青素导致微藻生产虾青素的效率过低的问题。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种促进微藻虾青素酯化的方法，包括：
在微藻处于胁迫期时，向其中加入外源脂肪酸。
优选的是，所述外源脂肪酸包括：亚油酸、亚麻酸、反亚油酸中的一种或多种组合。
优选的是，具体步骤为：
s1、将微藻接种于培养基中进行第一次培养，直至到达微藻的对数生长期末期，获得大量藻种；
s2、将s1中获得的大量藻种转移至缺氮培养基中，转移后藻种的细胞浓度为2×105个/ml～10×105个/ml，微藻处于胁迫期，添加外源脂肪酸，进行第二次培养；
s3、当s2中微藻的藻体细胞完全变红后，收集藻细胞。
优选的是，所述微藻为雨生红球藻、小球藻、空星藻中的一种。
优选的是，s1中所述培养基为bbm培养基，bg11培养基，se培养基中的一种，s2中缺氮培养基为s1中所述培养基去除氮源成分。
优选的是，第一次培养的条件为：环境温度22～28℃，光照强度30～100μmol/m2/s。
优选的是，第二次培养的条件为：环境温度22～30℃，光照强度为150～300μmol/m2/s。
优选的是，添加的外源脂肪酸的浓度为30μmol/l～90μmol/l。
优选的是，所述外源脂肪酸溶解在缓冲液中再进行添加，所述缓冲液ph为8且含有0.1g/ml的牛血清白蛋白。
优选的是，所述缓冲溶液为100mmol/l的tris/hcl缓冲溶液。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过采用向胁迫期的微藻中添加外源脂肪酸，使得微藻体内的游离虾青素向酯化虾青素转化，防止游离虾青素在微藻体内累积抑制微藻进一步生成虾青素，使得微藻内的虾青素和游离虾青素的量减少，进而促进微藻生成更多的虾青素，达到增加微藻体内总虾青素的效果；
本发明的发明人通过对不同虾青素含量的各类微藻体内的组成及成分含量进行分析研究，对比不同虾青素含量的各类微藻体内的酯化虾青素的种类和含量，发现添加部分不饱和脂肪酸，特别是亚油酸对促进微藻体内的游离虾青素的酯化具有显著的效果，该技术方案操作简单，能耗低，可有效地降低虾青素的生产成本。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明所用雨生红球藻购于日本筑波国家环境研究所，小球藻和星空藻来自源于中国科学院天津工业生物技术研究所的实验室筛选。
<实施例1>
一种促进微藻虾青素酯化的方法
(1)在bg11培养基中接入雨生红球藻，在25℃，50μmol/m2/s光照下对其进行培养，直至对数生长期结束，获得大量藻种；
(2)将雨生红球藻接种于缺氮bg11培养基，接种后初始细胞密度为5×105/ml，添加70μmol/l的亚油酸，在28℃，200μmol/m2/s光照下对其进行诱导培养；
其中，添加的亚油酸溶解在100mmol/ltris/hcl缓冲液中，该缓冲液ph为8且含有0.1g/ml的牛血清白蛋白，通过将亚油酸溶解至缓冲溶液中并添加牛血清白蛋白，能够促进微藻细胞对亚油酸的吸收和利用；
(3)培养细胞完全变红后，收集藻细胞并测定胞内的虾青素、游离虾青素和酯化虾青素。
<实施例2>
一种促进微藻虾青素酯化的方法
(1)在bbm培养基中接入小球藻，在23℃，80μmol/m2/s光照下对其进行培养，直至对数生长期结束，获得大量藻种；
(2)将小球藻接种于缺氮bbm培养基，接种后初始细胞密度为7×105/ml，添加90μmol/l的亚油酸，在26℃，300μmol/m2/s光照下对其进行诱导培养；
其中，添加的亚油酸溶解在100mmol/ltris/hcl缓冲液中，该缓冲液ph为8且含有0.1g/ml的牛血清白蛋白；
(3)培养细胞变红后，收集藻细胞并测定胞内的虾青素、游离虾青素和酯化虾青素。
<实施例3>
一种促进微藻虾青素酯化的方法
(1)在se培养基中接入空星藻，在28℃，100μmol/m2/s光照下对其进行培养，直至对数生长期结束，获得大量藻种；
(2)将空星藻接种于缺氮se培养基，接种后初始细胞密度为10×105/ml，添加30μmol/l的亚油酸，在30℃，250μmol/m2/s光照下对其进行诱导培养；
其中，添加的亚油酸溶解在100mmol/ltris/hcl缓冲液中，该缓冲液ph为8且含有0.1g/ml的牛血清白蛋白；
(3)培养细胞完全变红后，收集藻细胞并测定胞内的虾青素、游离虾青素和酯化虾青素。
<实施例4>
一种促进微藻虾青素酯化的方法
(1)在bbm培养基中接入小球藻，在23℃，80μmol/m2/s光照下对其进行培养，直至对数生长期结束，获得大量藻种；
(2)将小球藻接种于缺氮bbm培养基，接种后初始细胞密度为7×105/ml，添加90μmol/l的亚麻酸，在26℃，300μmol/m2/s光照下对其进行诱导培养；
(3)培养细胞变红后，收集藻细胞并测定胞内的虾青素、游离虾青素和酯化虾青素。
<实施例5>
(1)在bg11培养基中接入空星藻，在22℃，30μmol/m2/s光照下对其进行培养，直至对数生长期结束，获得大量藻种；
(2)将空星藻接种于缺氮bg11培养基，接种后初始细胞密度为2×105/ml，添加50μmol/l的反亚油酸，在22℃，150μmol/m2/s光照下对其进行诱导培养；
(3)培养细胞完全变红后，收集藻细胞并测定胞内的虾青素、游离虾青素和酯化虾青素。
<对比例1>
温度与光照以及培养条件与实施例1相同，不同之处在于不添加外源脂肪酸。
<对比例2>
温度与光照以及培养条件与实施例2相同，不同之处在于不添加外源脂肪酸。
<对比例3>
温度与光照以及培养条件与实施例3相同，不同之处在于不添加外源脂肪酸。
<对比例4>
温度与光照以及培养条件与实施例4相同，不同之处在于不添加外源脂肪酸。
<对比例5>
温度与光照以及培养条件与实施例5相同，不同之处在于不添加外源脂肪酸。
实验例
将上述实施例1～6与其相对应的对比例得到的藻细胞进行收集，并检测藻细胞内的虾青素、游离虾青素和酯化虾青素；
藻细胞内酯化虾青素和总虾青素的检测方法：
藻细胞内的虾青素、游离虾青素和酯化虾青素采用的具体测定方法参照国家标准gb/t31520-2015；其中，皂化后使用高效液相色谱检测得到虾青素含量为总虾青素量，未皂化测得含量为游离虾青素含量，总虾青素含量和游离虾青素含量差值为酯化虾青素含量，具体数据见表1；
表1
其中，n.d为未检测到，其含量低于检出限；
由上表可知，对比实施例和相应的对比例，可以明显发现，微藻体内的总虾青素含量有明显增加，游离虾青素的含量明显减少，酯化虾青素的含量有明显上升，因此说明添加外源脂肪酸能够明显促进微藻体内的有力虾青素的酯化，进而解除游离虾青素的堆积造成的微藻生产虾青素的抑制作用，使得微藻生产虾青素的产量上升进而进一步促进微藻生产虾青素的效率，使得微藻生产虾青素的量得到明显提升。
另外，由于实施例1、实施例2、实施例3采用的藻种不同，不同的藻种中，游离虾青素、酯化虾青素以及总虾青素的含量的差别很大，添加外源脂肪酸后，游离虾青素、酯化虾青素以及总虾青素的含量的增长率也会有较大的不同，在培养温度、光照条件以及培养基差别不大的情况下，实施例3中采用的是星空藻，星空藻中酯化虾青素的含量原本就极低，因此仅加入少量的外源脂肪酸即30μmol/l的亚油酸，酯化虾青素的含量就有显著的变化，进而总虾青素的含量的增量也会更加的明显，相较于实施例1采用的雨生红球藻而言，即使外源脂肪酸亚油酸的添加量在70μmol/l，由于雨生红球藻原本体内的酯化虾青素含量就很高，尽管外源脂肪酸的添加量为实施3的外源脂肪酸添加量的2倍以上，总虾青素和酯化虾青素的增加量也不显著，但是其也是有明显增加量的，对应的增长量为其对比例的40.83％和43.97％；
通过对照实施例2和实施例4，可以发现在藻种均为小球藻的情况下，亚油酸相较于亚麻酸对促进小球藻内的游离虾青素的酯化具有更优异的效果；
综上，可以说明，通过在微藻的胁迫期添加外源脂肪酸，对微藻内的游离虾青素转化成酯化虾青素均有较好的效果，通过将微藻体内的游离虾青素转化为酯化虾青素后，解除了因游离虾青素累积造成的微藻生产虾青素的功能抑制，使得微藻生产虾青素的量得到明显增加，而且采用的藻种不同，增加的程度不同，该效果在酯化虾青素原始含量少的藻种上体现的异常显著，见表1实施例3的检测结果。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。