一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株的制作方法

本发明涉及一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株，属于微生物基因工程领域。

背景技术：

母乳通常被认为是提供婴儿营养的最重要的来源。作为母乳中的含量第三的固体组分，对于婴幼儿肠道菌群的发育以及预防病原菌与上皮细胞的粘附，人乳寡糖的合成发挥着重要的作用。岩藻糖基化乳糖，包括2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、乳酰-n-岩藻五糖等，能选择性地刺激双歧杆菌的生长并形成致病菌受体的类似物，从而保护婴儿防止肠道病原体的感染，如肠道病原体，大肠杆菌、霍乱弧菌和沙门氏菌。2’-岩藻糖基乳糖作为人乳寡糖中含量最高的成分，受到广泛关注，具备应用于婴幼儿产品的广泛前景。

相比于酶法和化学法，以微生物发酵法合成2’-岩藻糖基乳糖更加高效和安全。目前微生物发酵法发酵法生产2’-岩藻糖基乳糖主要有两个代谢通路，分别是从头合成途径和补救途径。从头合成途径主要是通过将磷酸甘露糖变位酶(manb)，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(manc)，gdp-甘露糖-6-脱氢酶(gmd),gdp-岩藻糖合成酶(wcag)中的一个或多个基因在大肠杆菌中过表达，或者通过补救合成途径，过表达l-岩藻糖1-激酶/gdp-岩藻糖焦磷酸化酶(fkp)和2’-岩藻糖基乳糖合成酶(fuct2)；lee等将从头合成途径的manb、manc、gmd、wcag以及fuct2共表达于失去β-半乳糖糖苷酶活性的e.colijm109，提高了乳糖利用率，2’-岩藻糖基乳糖的摇瓶发酵产量最终达到了1.25g/l。但e.colijm109菌株在发酵过程中形成的生物膜可带来很多严重的后果，难以应用于高密度发酵。还有报道通过基因整合的方式将gdp-岩藻糖从头合成途径的关键基因以及fuct2整合到e.colijm109染色体组上，避免了抗生素的食品安全问题，在无抗生素的13l补料发酵中，得到了20.28g/l的产量。但相对与传统的质粒表达，基因整合的过程较为复杂，基因的表达水平较低。

此外，chin等构建了2’-岩藻糖基乳糖生产的补救途径，敲除大肠杆菌中代谢乳糖的lacz基因，2’-岩藻糖基乳糖的产率提高了4.3倍；同时又敲除代谢岩藻糖的fucik基因簇，使2’-岩藻糖基乳糖的产量得到进一步提高，摇瓶发酵产量达到2.1g/l。尽管2’-岩藻糖基乳糖的产量得到显著提高，但用于其生产的l-岩藻糖价格昂贵,2’-岩藻糖基乳糖的产率也较低(67.7％)，较难应用于大规模的发酵生产。

技术实现要素：

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌及其构建方法。

本发明的第一个目的是提供一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌组合调控磷酸甘露糖变位酶manb，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manc，gdp-甘露糖-6-脱氢酶gmd，gdp-岩藻糖合成酶wcag、l-岩藻糖1-激酶/gdp-岩藻糖焦磷酸化酶fkp以及2-岩藻糖基乳糖合成酶fuct2的表达。

在本发明的一种实施例中，所述大肠杆菌工程菌还敲除了β-半乳糖苷酶lacz、udp-葡萄糖脂质载体转移酶wcaj、岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶fuci-fuck基因簇。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌的宿主菌为大肠杆菌bl21(de3)，表达载体为petuet-1和pcdfduet-1。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌以pcdfduet-1表达manc-manb和gmd-wacg，以petuet-1表达fkp和fuct2。

在本发明的一种实施方式中，manb、manc、gmd、wcag的基因来源于大肠杆菌k-12(escherichiacolik-12)，核苷酸序列依次如seqidno.1～4所示。

在本发明的一种实施方式中，fkp和fuct2的基因分别来源于脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)9343和幽门螺杆菌(helicobacterpylori)，核苷酸序列依次为seqidno.5、seqidno.6所示。

本发明的第二个目的是提供一种提高大肠杆菌产2’-岩藻糖基乳糖能力的方法，其特征在于，组合调控manb、manc、gmd、wcag、fkp以及fuct2的表达。所述调控表达是采用中拷贝表达元件调控manb、manc、gmd、wcag的表达，采用高拷贝表达元件调控fkp和fuct2的表达。

本发明的第三个目的是提供一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)采用crispr/cas9基因编辑系统分别构建敲除了wacj基因、wacj和lacz基因、wacj，lacz和fucik基因的大肠杆菌bl21(de3)工程菌；

(2)分别以petduet-1，pcdfduet-1和pacycduet-1为表达载体，构建过表达manb-manc-gmd-wcag和fkp-fuct2的重组表达载体；

(3)将pacycduet-1-manb-manc-gmd-wcag和petduet-1-fkp-fuct2同时转化敲除了wacj基因、wacj和lacz基因、wacj，lacz和fucik基因的大肠杆菌bl21(de3)工程菌，筛选出具有最高2’-岩藻糖基乳糖产量的敲除基因宿主菌株；

(4)以筛选出的具有最高2’-岩藻糖基乳糖产量的，敲除了wacj，lacz和fucik基因的大肠杆菌bl21(de3)为宿主，将步骤(2)中构建的重组表达载体导入宿主菌中，筛选出具有最高2’-岩藻糖基乳糖产量的重组质粒组合。

本发明的第四个目的是提供一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌的发酵方法，是以所述基因工程菌为发酵微生物，以乳糖和l-岩藻糖为底物，以甘油或葡萄糖作为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖。

本发明还要求保护所述工程菌在制备2’-岩藻糖基乳糖及其衍生产品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过敲除大肠杆菌宿主2’-岩藻糖基乳糖合成途径中lacz、wcaj和fucik的表达，并组合调控2’-岩藻糖基乳糖头合成途径中manb、manc、gmd、wcag、fkp和fuct2的表达，从而精确调控代谢通路的碳通量，缓解代谢压力，提高2’-岩藻糖基乳糖的产量，将大肠杆菌生产2’-岩藻糖基乳糖的能力由0.22g/l提升至3.81g/l，与现有技术中2.1g/l的2’-岩藻糖基乳糖产量相比，本发明2’-岩藻糖基乳糖的产量提高至现有技术的1.81倍，具备工业应用的前景。

附图说明

图1为2’-岩藻糖基乳糖生产的从头合成途径和补救途径；

图2为敲除lacz基因的pcr验证结果；

图3为petduet-1-manb-manc-gmd-wcag载体构建图；

图4为pcdduet-1-fkp-fuct2过表达载体构建图；

图5为不同敲除菌株发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的产量比较；

图6不同质粒组合的工程菌发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的产量比较；

图7敲除宿主中菌株bwlf12’-岩藻糖基乳糖产量的hplc检测结果

具体实施方式

以下结合实例更加详细说明本发明的内容，以下实例中所使用的质粒、内切酶、pcr酶、柱式dna抽提试剂盒、dna凝胶回收试剂盒等采用商用产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。菌落pcr、核酸琼脂糖凝胶电泳、蛋白质sds-page凝胶电泳、热击转化、电转化、感受态细胞的制备和细菌基因组的提取保存等常规操作方法根据molecularcloning:alaboratorymanual(fourthedition)进行。质粒和dna产物的测序工作交予上海生工生物工程公司完成。

实施例1大肠杆菌bl21wacj、lacz、fucik基因敲除

利用crispr-cas9基因敲除系统敲除大肠杆菌bl21中wacj、lacz、fucik，具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表1)：

(1)以大肠杆菌bl21基因组为模板，使用wcaj-up-f/r和wcaj-down-f/r，lacz-up-f/r和lacz-down-f/r，fucik-up-f/r和fucik-down-f/r通过pcr分别扩增出wacj、lacz、fucik的上下游片段，胶回收。再分别以wacj、lacz、fucik上下游片段为模板，采用wcaj-up-f/wcaj-down-r、lacz-up-f/lacz-down-r和fucik-up-f/fucik-down-r引物通过inversepcr得到完整的wacj、lacz、fucik模板，胶回收dna片段。

(2)以原始ptargetf质粒为模板，wcaj-sg-f/r、lacz-sg-f/r和fucik-sg-f/r为引物，采用pcr扩增将原始质粒上的n20序列分别替换为与wacj、lacz、fucik序列互补的n20序列，得到带有靶向wacj、lacz、fucik的ptargetf质粒。pcr产物采用dpnⅰ去除模板dna，转化大肠杆菌dh5α感受态，涂布lb平板(含壮观霉素)，37℃扩大培养提取质粒并测序。

(3)取pcas质粒及大肠杆菌bl21感受态，冰上放置5min至感受态融化，取5ul质粒加入100ul感受态细胞中，轻轻混匀。冰浴20min，42℃热激90s，立即置于冰上5min。加入1mllb培养基，30℃，180rpm培养1h。取200ul浓缩菌液，均匀涂布于lb平板(含卡那霉素)上，30℃倒置培养过夜成为大肠杆菌bl21/pcas。

(4)挑取大肠杆菌bl21/pcas单菌落于lb培养基中，30℃培养1.0h，加入终浓度为10mm/l的l-阿拉伯糖以诱导pcas-λ-red系统表达。当od600达到0.6-0.8时，制备大肠杆菌bl21/pcas感受态。

(5)将100ngptargetf质粒和400ng的供体dna片段，电转上述大肠杆菌bl21/pcas感受态，涂布于lb平板(卡那霉素和壮观霉素)，30℃培养24h，pcr验证wacj，lacz和fucik敲除效果(敲除验证结果见图2)。

(6)将上述阳性克隆菌落挑至4mllb液体试管，加入终浓度为1mm的iptg和30mg/l卡那霉素，30℃培养8-16h，去除ptargetf质粒。42℃培养12h，去除pcas质粒。最终获得bw(δwacj)、bwl(δwacjδlacz)、bwlf(δwacjδlaczδfucik)三种大肠杆菌bl21敲除菌株。

表1基因敲除引物

实施例2重组表达载体的构建

重组表达载体构建具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表2)：

(1)manc-manb和gmd-wacg基因簇片段的获得：以大肠杆菌k-12(escherichiacoli)的基因组为模板，以mancb-f/r(ncoi)和gw-f/r(ndei)为引物，pcr分别扩增出manc-manb和gmd-wacg基因簇片段，胶回收dna片段；

(2)fkp基因片段的获得：以脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis9343)基因组为模板，以fkp-f/r(ndei)为引物，pcr扩增出fkp基因片段，胶回收dna片段

(4)fuct2基因片段的获得：以幽门螺杆菌(helicobacterpylori)基因组为模板，以fuct2-f/r(ncoi)为引物，pcr扩增出fuct2基因片段，胶回收dna片段

(5)采用ncoi和ndei将manc-manb和gmd-wacg基因簇片段分别进行单酶切处理后，插入到经过相同酶切处理的质粒petduet-1，pcdfduet-1和pacycduet-1中，dna连接酶过夜连接，从而构建pet-bcgw，pcd-bcgw,pac-bcgw表达载体(bcgw即过表达manc-manb和gmd-wacg；载体构建流程参考图2，以pet-bcgw为例)。

(7)采用ndei和ncoi将fkp和fuct2基因片段分别进行单酶切处理后，插入到经过相同酶切处理的质粒petduet-1，pcdfduet-1和pacycduet-1中，dna连接酶过夜连接，从而构建pet-ff,pcd-ff,pac-ff表达载体(ff即过表达fkp和fuct2；载体构建流程参考图3，以pcd-ff为例)。

表2质粒构建引物

实施例3大肠杆菌工程菌株的构建

培养wacj、lacz、fucik基因敲除菌株bwlf并制备感受态细胞，利用化学转化法将抽提后的质粒pet-bcgw和pcd-ff导入菌株，在双抗lb平板(氨苄和链霉素)37℃过夜培养，得到产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌。其他重组基因工程菌的构建如上，具体重组质粒、工程菌及其详细信息见表3。

表3质粒和工程菌详细信息

实施例42-岩藻糖基乳糖发酵过程及检测

luria-bertani(lb)培养基：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l。

发酵培养基：13.5g/l磷酸二氢钾,4.0g/l磷酸铵，1.7g/l柠檬酸，1.4g/l七水合硫酸镁，10ml/l微量金属元素溶液(10g/l氯化铁，2.25g/l七水合硫酸锌，1.0g/l五水合硫酸铜，0.35g/l一水合硫酸锰，0.23g/l十水合硼酸钠，0.11g/l钼酸铵，2.0g/l二水合氯化钙，ph6.8；甘油20g/l。

(1)2-岩藻糖基乳糖发酵过程：将实施例(3)中的菌株接种于lb液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，作为种子液以2％的接种量接入25ml发酵培养基(含20g/l甘油)，37℃，200rpm，培养至0d6000.6，加入终浓度为0.2mmiptg，同时加入10g/l乳糖，5g/ll-岩藻糖，30℃，200rpm诱导培养70h。取5ml发酵液，5000rpm，离心25min，取上清，用于hplc测定；将菌体沉淀用1ml去离子水悬浮，5000rpm，离心25min，去上清。再用1ml超纯水悬浮菌体沉淀，100℃，煮沸5min，5000rpm，离心25min，取上清用于hplc测定。

(3)hplc检测条件：hplc(waterse2695)；色谱柱：carbohydrateanalysiscolumn(rezexroa-organicacidh+(8％)300×7.8mm)；流动相：0.5mmh2so4；流速：0.6ml/min；检测器：示差检测器；柱温60℃；进样量：10μl。

实施例5高效生产2’-岩藻糖基乳糖宿主工程菌的筛选

(1)不同敲除宿主之间的2’-岩藻糖基乳糖的产量差异

由于已有研究表明过表达manc、manb、gmd、wacg或fkp、fuct2可提高2’-岩藻糖基乳糖的产量，因此直接将构建好的重组质粒pac-bcgw和pet-ff同时转化原始bl21(de3)，bw，bwl和bwlf菌株，构建b1、bw1、bwl1、bwlf1工程菌株。按实施例4所述方法发酵生产2’-岩藻糖乳糖。敲除不同基因后2’-岩藻糖基乳糖的产量如图5(hplc检测结果如图7所示，以bwlf1为例)。可以看出，b1、bw1、bwl1、bwlf1菌株中2’-岩藻糖基乳糖的产量分别为0.22g/l、0.35g/l、2.40g/l和2.98g/l，bw1菌株2’-岩藻糖基乳糖产量是原始菌株的1.59倍，表明wcaj基因的敲除，促使细胞内gdp-岩藻糖的积累，提高了2’-岩藻糖基乳糖的产量；bwl1菌株2’-岩藻糖基乳糖产量是原始菌株b1的11倍，是bw1菌株的6.86倍，说明lacz基因的敲除对2’-岩藻糖基乳糖的产量提高有重要作用。bwlf1菌株2-岩藻糖基乳糖的产量相比于bwl1增加了1.24倍，说明fucik基因簇的敲除，使细胞内l-岩藻糖更多流向2’-岩藻糖基乳糖的生产，故确定bwlf菌株为下一步发酵的优选菌株。

(2)不同质粒组合的菌株生产2’-岩藻糖乳糖的差异

质粒petduet-1具有较高的拷贝数，质粒pcdfduet-1有中等的拷贝数，而质粒pacycduet-1具有较低的拷贝数。不同拷贝数的质粒被使用以平衡多酶体系中不同酶的表达量。为了减轻菌体的代谢负担，进一步提高2’-岩藻糖基乳糖的产量，我们在bwlf菌株中构建了不同质粒组合的重组菌株：bwlf1、bwlf2、bwlf3、bwlf4、bwlf5、bwlf6，并按实施例4所述方法发酵生产2’-岩藻糖乳糖，结果如图6所示，bwlf4在构建的6种菌株中bwlf4的产量最低，为0.62g/l；bwlf6的产量次低，为1.58g/l。bwlf3、bwlf1、bwlf5、bwlf2的产量分别为3.52g/l、3.02g/l、2.36g/l、2.28g/l，分别是bwlf4的5.68、4.87、3.81、3.68倍。其中在fkp及fuct2的表达中，bwlf1和bwlf2菌株，选用中拷贝数质粒pcdfduet-1；bwlf3，bwlf4菌株选用高拷贝数质粒petduet-1，而bwlf4，bwlf6选用低拷贝数质粒pacycduet-1，表明当补救合成途径fkp以及fuct2表达选用较高拷贝数质粒时，菌体内积累了较多的gdp-岩藻糖，同时被高效转化为目标产物，故2’-岩藻糖基乳糖的产量得到显著提高；bwlf6菌株的产量1.58g/l，与bwlf4相比，2’-岩藻糖基乳糖的产量提高了2.55倍，表明提高从头合成途径中相关基因的表达量，也能显著改善2’-岩藻糖基乳糖的产量；类似的，bwlf3的产量高于bwlf1，bwlf5的产量高于bwlf2。当fuct2和fkp选用高拷贝数质粒petduet-1表达，同时来自于上游途径的manc，manb，gmd，wcag选择中等拷贝数质粒pcdfduet-1表达时，菌体内积累大量gdp-岩藻糖，同时也被有效转化为终产物，减轻菌体代谢负担，所以菌株bwlf3的2’-岩藻糖基乳糖产量最高，为3.52g/l。因此确定表达中等水平的manc，manb，gmd，wcag和表达较高水平的fuct2、fkp的菌株bwlf3为最优发酵菌株。

实施例6：

具体实施方式同实施例4，区别在于，将诱导温度由30℃改为37℃，以bwlf3菌株为发酵微生物，所得的2’-岩藻糖基乳糖产量为3.81g/l。

对比例1：

具体实施方式同实施例4，区别在于，将20g/l甘油改为20g/l葡萄糖，以bwlf3菌株为发酵微生物，所得的2’-岩藻糖基乳糖产量为0.8g/l。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>江南大学

<120>一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株

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