绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体的制作方法

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及绵羊lrh-1短发夹rna及其干扰载体。
背景技术：
：肝受体同系物-1(liverreceptorhomolog-1,lrh-1)是一种哺乳动物重要的核受体，属于核受体超家族中的nr5a亚家族的第2个成员，也称nr5a2，在动物的心、胃、肺、脑、胆囊、胰腺外分泌部、唾液腺、肠、卵巢、脂肪、膀胱、睾丸、肾上腺、胎盘等多种组织中均有表达。lrh-1主要是以一种转录调控因子执行其功能，通过在不同时期的不同组织中调控多种蛋白的表达，从而影响这些组织的发育及生理生化功能，并在动物胚胎发育、分化、胆固醇代谢、胆汁酸的动态平衡、类固醇激素生成、乳腺癌的细胞转移和侵袭、组织炎症反应等过程中具有重要作用。rna干扰(rnainterference，rnai)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mrna存在同源互补序列的双链rna(doublestrandrna，dsrna)导入细胞后，能特异性地降解该mrna，从而产生相应的功能表型缺失。rna干扰技术的出现使得以特定的方式特异性沉默靶基因成为可能，并逐渐成为治疗疾病和基因功能研究的高效工具。目前，rnai技术开辟了生命科学新的研究领域，成为21世纪国际生命科学的研究热点和前沿。为了反向深入研究绵羊细胞中lrh-1基因功能，需要对lrh-1基因进行干扰、沉默、敲减或敲除，但目前尚未见lrh-1基因的敲除或敲减的报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供绵羊lrh-1短发夹rna及其干扰载体，该短发夹rna能够对目的基因lrh-1产生良好的敲减作用。本发明提供的绵羊lrh-1短发夹rna，其正义链5’→3’包括顺序连接的序列a、茎环序列1、序列b；其中，序列a与序列b反向互补；所述序列a如seqidno:1～3任一项所示。本发明提供的绵羊lrh-1短发夹rna，其反义链5’→3’包括顺序连接的序列a、茎环序列2、序列b；所述茎环序列2与茎环序列1反向互补。本发明提供的绵羊lrh-1短发夹rna中，反义链和正义链中的序列a是一致的，序列b也是一致的。一些具体实施例中，所述序列a为gcacggacttacacctattgt(seqidno:1)，序列b为acaataggtgtaagtccgtgc(seqidno:10)；一些具体实施例中，所述序列a为ggaataagttcgggcccatgt(seqidno:2)，序列b为acatgggcccgaacttattcc(seqidno:11)；一些具体实施例中，所述序列a为gcacaggaattggtggcaaag(seqidno:3)，序列b为ctttgccaccaattcctgtgc(seqidno:12)；本发明提供的绵羊lrh-1短发夹rna的正义链和反义链的5’端皆连接有接头，所述正义链的接头序列为cacc；所述反义链的接头序列为aaaa。本发明提供的绵羊lrh-1短发夹rna中，所述茎环序列1的核酸序列为cgaa。茎环序列2的核酸序列为ttcg。一些实施例中，所述绵羊lrh-1短发夹rna正义链的核酸序列如seqidno:4所示，反义链的核酸序列如seqidno:5所示；或正义链的核酸序列如seqidno:6所示，反义链的核酸序列如seqidno:7所示；或正义链的核酸序列如seqidno:8所示，反义链的核酸序列如seqidno:9所示。本发明还提供了由本发明所述正义链和反义链退火合成的dsoligo。具体的，本发明提供了由seqidno:4所示正义链和seqidno:5所示反义链退火形成的dsoligo。或由seqidno:6所示正义链和seqidno:7所示反义链退火形成的dsoligo。或由seqidno:8所示正义链和seqidno:9所示反义链退火形成的dsoligo。本发明还提供了绵羊lrh-1基因的干扰载体，其包括骨架载体和所述的dsoligo。在本发明实施例中，所述骨架载体为pentr/u6-shrna-gfp。一些具体实施例中，所述dsoligo插入骨架载体的位点为bamhi和ecori。本发明还提供了一种敲减绵羊lrh-1基因的方法，其以本发明所述的干扰载体转染受体。所述转染采用脂质体转染法。所述受体为动物细胞或绵羊的卵巢颗粒细胞。具体为293t细胞或湖羊卵巢颗粒细胞。本发明还提供了一种lrh-1基因被敲减的细胞系，其以本发明所述的干扰载体转染细胞构得。一种敲减绵羊lrh-1基因的试剂盒，其包括所述的短发夹rna、所述的dsoligo或所述的干扰载体。本发明所述的试剂盒中，还包括转染试剂。本发明构建了一种lrh-1短发夹rna，并构建了lrh-1基因的干扰载体，具体而言，本发明根据绵羊lrh-1基因的cdna序列及设计原则筛选出靶序列，根据靶序列设计有短发夹rna结构的单链寡核苷酸，经变性退火为双链寡核苷酸插入融合有绿色荧光的pentr/u6载体，构建pentr/u6-shrna-gfp干扰载体。通过转染到湖羊卵巢颗粒细胞中，利用实时荧光定量pcr方法在mrna水平检测，证实lrh-1-shrna干扰载体可以有效抑制绵羊体细胞中lrh-1基因的表达。这一干扰载体实现了对绵羊体细胞基因组的精确打靶，为深入研究绵羊体细胞中lrh-1基因与其他基因功能间关系，提供了有效地实验研究技术依据。本发明具有以下优点及效果中至少一种：(1)rna(lrh-1-shrna)短发夹干扰载体，可直接用于转染绵羊细胞，特异性抑制lrh-1基因表达，进行rnai实验。(2)rna(lrh-1-shrna)干扰载体融合有gfp标签，可在荧光显微镜下直观监测转染效率。(3)rna(lrh-1-shrna)干扰载体的构建为绵羊lrh-1基因功能的深入研究提供了便利。附图说明图1示本发明设计的shrna；图2示本发明的干扰载体图谱；图3示细胞转染图片；图4示gapdh基因的扩增曲线(a)和溶解曲线(b)；图5示lrh-1基因的扩增曲线(a)和溶解曲线(b)。具体实施方式本发明提供了绵羊lrh-1短发夹rna及其干扰载体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1lrh-1高表达载体构建1.材料：pmd18-tvector、oligodna、感受态细胞dh5α、platinumpfxdnapolymerase、platinumtaqdnapolymerasehighfidelity、快切限制性内切酶：bamhi和ecori、t4dna连接酶。2.方法1)、对所需合成的根据genbank中绵羊lrh-1基因序列(jn662490.1)进行分析，检查基因内部有无特别复杂二级结构和重复序列连接。2)、根据基因序列分析的结果，分别进行单链oligo的设计及合成。3)、利用pcr将合成的oligo拼接成完整的基因序列。4)、将合成好的序列装入pmd18-t载体并转化至感受态细胞dh5α。5)、测序验证重组克隆中插入序列是否与要求相一致。6)、通过重叠pcr将基因序列中突变点修复。7)、将构建好的pmd18t-lrh-1用bamhi和ecori酶切回收约1.5kb片段。酶切体系如表1：表1酶切体系质粒pmd18t-lrh-1(150ng/μl)10μlbamhi1μlecori1μl10×q.cutbuffer5μlddh2o33μl8)、将pcdna3.1(+)用bamhi和ecori酶切回收。酶切体系如表2：表2酶切体系pcdna3.1(+)(约150ng/μl)6μlbamhi1μlecori1μl10×q.cutbuffer5μlddh2o37μl9)、将酶切好的载体pcdna3.1(+)和片段lrh-1用t4dna连接酶连接，然后转化感受态细胞dh5α，挑取若干克隆，小量抽提制备质粒，测序验证。连接体系如表3：表3连接体系10×ligationbuffer1μl酶切dna片段3.0μl酶切载体1.0μlt4dnaligase(10u/μl)0.5μlddh2o4.5μl实施例2干扰载体构建1.材料：shrnaoligos、线性化载体：pentr/u6-shrna-gfp、10×退火反应buffer、t4dnaligase、感受态细胞dh5α2.方法：1)、根据genbank中绵羊lrh-1基因序列(jn662490.1)设计短发夹3条shrnaoligos(图1)。2)、oligo正义链中间的cgaa序列和反义链中间的ttcg序列为短发夹rna茎环结构。正义链模板的5’端cacc和反义链模板的5’端aaaa，为和穿梭质粒连接时的接头设计。3)、将合成的oligos，退火反应合成双链，体系如下：表4退火体系topstranddnaoligo(200μm)5μlbottomstranddnaoligo(200μm)5μl10×oligoannealingbuffer2μldnase/rnase-freewater8μltotalvolume20μl4)、95℃反应4min后，室温放置5～10min；5)、用去离子水将上述反应产物稀释100倍，使双链oligo混合物终浓度为500nm；6)、用oligoannealingbuffer将500nmdsoligo混合物稀释成终浓度为10nm。7)、连接载体和dsoligo，体系如下：表5连接体系8)、16℃连接2h后转化到感受态细胞dh5α；9)、载体(图谱如图2)说明：(1)原核抗性：kan(2)真核筛选抗性：zeocin(3)表达gfp荧光蛋白(4)dsoligo插入在bamhi和ecori酶切位点处。(5)含有图1中no.1组所示dsoligo的质粒载体为sr51、含有图1中no.2组所示dsoligo的质粒载体为sr362、含有图1中no.3组所示dsoligo的质粒载体为sr1159。10)、测序验证干扰载体是否正确。实施例3干扰载体敲减效果评价1.材料：高表达质粒：pcdna3.1(+)-lrh-1、shrna干扰质粒：sr51、sr362、sr1159和阴性对照、293t细胞、dmem高糖培养基、胎牛血清fbs、转染试剂：lipofectamine2000、去内毒素大抽试剂盒、反转录试剂盒、sybrqpcrmix2.方法1)、大抽抽提制备需要转染的缩影质粒(参照去内毒素大抽试剂盒说明书操作)。2)、培养293t细胞，铺6孔板，使第二天细胞密度达到90％左右。3)、转染：用lipofectamine2000共转染高表达质粒和干扰质粒，分组如下：表6转染分组分组高表达质粒lrh-1干扰载体lipofectamine2000sr51组1μglrh-13μgsr5110μlsr362组1μglrh-13μgsr36210μlsr1159组1μglrh-13μgsr115910μlnc组1μglrh-13μgsr-nc10μl空白组0004)、48h后收集细胞，抽提rna，反转录至cdna，qpcr检测目的基因lrh-1表达水平。(反转录和qpcr的详细步骤参照试剂盒步骤)表7qpcr所用引物信息引物名称序列(5’>3’)lrh-fctcaaggtggatgaccaaatga(seqidno:13)lrh-rttgcccagtaaccaggaagat(seqidno:14)gapdh-fagaaggctggggctcatttg(seqidno:15)gapdh-ragggggccatccacagtcttc(seqidno:16)3.结果(1)细胞转染图片如图3(2)qpcr筛选结果：gapdh基因的扩增曲线和溶解曲线如图4、lrh-1基因的扩增曲线和溶解曲线如图5(3)qpcr数据及计算结果如表8：表8qpcr数据及计算结果样品名称2-δδct干扰效率sr51组0.64196722335.80％sr362组2.110930312无sr1159组0.23459008376.54％nc组10从上表可看出，sr51和sr1159均对目的基因lrh-1有一定敲减作用，其中敲减效率最佳的为sr1159，为76.54％，故可选择该干扰质粒用于下游实验。实施例4干扰载体在绵羊体细胞中敲减效果验证4.1绵羊(湖羊)卵巢颗粒细胞采集准备37～38℃的生理盐水，其中加入庆大霉素，青链霉素，放入保温瓶中备用。采取新鲜、完整的湖羊卵巢置于保温瓶中，于3h之内送到实验室。4.2卵巢颗粒细胞采集及培养1)、在超净工作台中，用生理盐水冲洗卵巢5-8遍，去除血污及杂质，剥离卵巢系膜。用10ml注射器中先吸取1ml含有1％血清的dpbs溶液，随后抽吸直径2～5mm的健康卵泡的卵泡液。2)、500×g室温离心5min，弃上清，沉淀用pbs冲洗2次。3)、弃上清，沉淀加入500μl0.3％透明质酸酶消化2min，用移液器吹打使颗粒细胞分散。4)、500×g室温离心3min，弃上清，沉淀用pbs冲洗2次。5)、500×g室温离心3min，弃上清，用预暖的10ml细胞培养液于t75细胞培养瓶中重悬细胞，37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。4.3干扰载体lrh-1-shrna转染颗粒细胞选用转染效果相对最佳的质粒sr1159进行湖羊颗粒细胞转染，实验操作方法同实施例3，实验设三次重复，分别记为lrh-1敲除1、lrh-1敲除2、lrh-1敲除3。4.4颗粒细胞中lrh-1mrna表达检测以步骤4.3制备获得的lrh-1敲除1～3细胞为待测样品，每组细胞重复检测。以gapdh为control进行检测。control细胞设置三组，每组重复检测三次。4.4.1颗粒细胞中rna提取按plusrnapurificationkit(invitrogen货号：12183-555)试剂盒要求操作，然后贮存在-80℃备用。4.4.2逆转录实验(1)试剂：superscripttmiiifirst-strandsynthesissupermixforqrt-pcr(invitrogen货号：11752-050)(2)仪器：恒温金属浴(国产)(3)操作步骤表9：1st-strandcdnasynthesis反应体系及条件4.4.3real-timepcr检测(1)试剂：powergreenpcrmastermix(roche货号：4913914001)(2)仪器：quantstudio多重实时荧光定量pcr仪(美国lifetechnologies公司)(3)实验过程①荧光定量pcr引物设计和合成采用primerpremier6.0和beacondesigner7.8软件进行定量pcr引物设计，然后进行合成，引物序列如下：表10：real-timepcrprimersandconditions②real-timepcr扩增体系和反应条件表11：定量pcr反应体系及条件③real-timepcr基因表达差异统计分析每个样品重复三次，各个基因的相对表达水平以2(ct内参基因-ct目的基因)进行统计分析。4.4.4lrh-1定量结果表12定量结果实验结果表明，构建的lrh-1-shrna干扰载体，可以有效地敲减湖羊体细胞中lrh-1基因的表达。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>江苏农牧科技职业学院<120>绵羊lrh-1短发夹rna及其干扰载体<130>mp1934713<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gcacggacttacacctattgt21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggaataagttcgggcccatgt21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gcacaggaattggtggcaaag21<210>4<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4caccgcacggacttacacctattgtcgaaacaataggtgtaagtccgtgc50<210>5<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aaaagcacggacttacacctattgtttcgacaataggtgtaagtccgtgc50<210>6<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6caccggaataagttcgggcccatgtcgaaacatgggcccgaacttattcc50<210>7<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7aaaaggaataagttcgggcccatgtttcgacatgggcccgaacttattcc50<210>8<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8caccgcacaggaattggtggcaaagcgaactttgccaccaattcctgtgc50<210>9<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9aaaagcacaggaattggtggcaaagttcgctttgccaccaattcctgtgc50<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10acaataggtgtaagtccgtgc21<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11acatgggcccgaacttattcc21<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ctttgccaccaattcctgtgc21<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ctcaaggtggatgaccaaatga22<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14ttgcccagtaaccaggaagat21<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15agaaggctggggctcatttg20<210>16<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16agggggccatccacagtcttc21当前第1页12