用于载体表达的复合多联gRNA和RNAi的表达框架的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一个在真核细胞表达的含有复合、多联的gRNA和RNAi的表达框架及 其构建。
【背景技术】
[0002] CRISPR/Cas系统，是最近几年来发展起来的一种新的可对基因组DNA进行靶向 编辑的工具。该系统原本是存在于细菌中的一种对付病毒等外来DNA的防御系统。在一 些细菌基因组中存在一系列成簇排列的DNA序列，被称作"规律间隔成簇短回文重复序 列"（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR)。这些重 复序列的间隔序列，被发现和很多能够侵入细菌的噬菌体DNA序列相同。并且，这些序列 在被转录成为RNA后，能够与宿主细菌产生的一类称为Cas(CRISPRassociated)的蛋白 质形成复合体，来对Cas蛋白起到导向作用，因此这段RNA也被称为导向RNA(guideRNA， gRNA)。当复合体检测到入侵的DNA和gRNA序列一致时，CRISPR/Cas系统可以识别外源核 酸中的特殊片段，该特殊片段中含有原型间隔序列峨邻基序（即ProtospacerAssociated Motif，PAM)。Cas蛋白由此到达PAM识别序列的特点位点而对外来DNA进行定点、特异的切 害J，达到DNA序列的修饰或者编辑的目的。
[0003] 严格来说，在细菌体内gRNA由两部分组成：一部分为来自于间隔区、 识别入侵DNA的crRNA(CRISPRRNA，crRNA)，另一部分为活化Cas蛋白所需的 tracrRNA(trans-activatingcrRNA,tracrRNA)。在人工构建的CRISPR_Cas9 系统载体中， 这两段RNA可融合为一条，称为导向RNA(guideRNA，gRNA)。
[0004] 细菌中的CRISPR-Cas系统极为多样，而一个来自产脓链球菌（Streptococcus pyogenes)的由Cas9蛋白参与的系统被人们研究的最为透彻。因此人们对它进行了改造， 将编码Cas9蛋白的序列及其附属元件共同制造成为一个单一的载体。在转入宿主细胞后， 产生的人工构建的gRNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列，从而起到基因 编辑的作用。
[0005] 目前为止，单一载体中表达gRNA的结构框架是以一个启动子（promoter)，如hU6 或者T7启动子，连接gRNA序列再连接转录终止子（如polyA序列），S卩：启动子-gRNA-终 止子。一个框架中只能表达一个gRNA，编辑一个特定的DNA区段。其缺点是不能同时编辑多 个位点或者多个基因。但实际应用中，往往需要同一个载体能够同时含有多个gRNA片段。 这样，以一个载体既可以对同一个基因的多位点同步编辑从而加强编辑的有效性和强度， 也可以以一个载体同步编辑多个不同的基因而到达多基因编辑的目的。即所谓多重gRNA 表达框架。
[0006] 为解决该问题，可以将多个单一gRNA表达框架（启动子-gRNA-终止子）插入一个 表达载体中，但其增加载体的有限长度和降低转染能力，且载体组装步骤复杂。故，实际应 用上有一定的局限性。最新的方法是应用多重框架（启动子-gRNAl-Csy4-gRNA2-Csy4-终 止子）结构，优点是解决了 "一个启动子-多个gRNA- -个终止子"的重复表达框架问题， 缺点是在原有的CRISPR/Cas9系统中，又额外地引入了来源于细菌的一个外源核酸酶，且 需要多载体共转染。这样，会导致转染系统操作的复杂性和不稳定性。
[0007] 其次，实际应用中，往往需要对同一个细胞中不同的功能基因在DNA层次（如基因 组DNA、病毒DNA等）和RNA层次（如转录水平等）的编辑；有时需要对不同基因有完全敲 除（knockout)和部分抑制（knockdown)的需求。以上两种方法都不能同时完成这些功能 需求。
[0008] 为了解决上述问题，本发明的复合表达框架位于一个整体中，可用于对真核细胞 的多部位基因敲除和基因表达抑制的应用，如基因治疗、转基因动物、单一或者多个基因的 同步修饰等。一个载体可以同时表达多个gRNA/RNAi，解决了现有单一启动子和转录终止 子表达系统内只能构建一个gRNA的问题，及其导致的多个载体共转染的复杂操作需求。此 外，本发明整合了CRISPR/Cas和RNAi技术，更适于抗病毒治疗（HBV、HIV等等）的开发和 应用。对于乙型肝炎病毒（HBV)，目前主要采用干扰素-a(IFN-a)和核苷（酸）类似物进 行抗病毒治疗，虽然可有效抑制HBVDNA的复制水平，但无法有效清除HBVcccDNA，停药后 往往会出现HBV复制的反弹，引起肝炎复发。采用HBV特异的gRNA和miRNA，可高效破坏 HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)，为慢性HBV感染者的临床治愈带来了希望，具有一定的开 发前景。
【发明内容】
[0009] 为了克服上述现有单一或者多联gRNA表达框架的缺点，达到复合、多联、方便的 基因编辑功能，本发明提供了一种技术方案，为一新的多gRNA和RNAi的表达框架，特点是 在一个CRISPR/Cas9表达载体中的一个启动子和一个终止子之间，有一个或者多个gRNA和 一个或者多个RNAi的"复合、多重基因编辑表达框架"。这一表达框架，既可以对单一基因 的不同区段进行多重基因敲除编辑（如只利用gRNAs的功能），又可对不同基因的不同部 位进行多基因敲除（knockout)编辑，以及以RNAi的功能对单一或者多个基因的部分抑制 (knockdown)功能。
[0010] 本发明的一个目的是提供一种复合多联表达框架，包括：一个启动转录的启动子、 一个或多个gRNA表达框架、一个或多个RNAi表达框架以及一个终止转录的终止子，所述表 达框架具有在DNA水平和mRNA水平修饰靶基因的功能，其中所述gRNA/CRISPR基因修饰表 达框架与所述RNAi表达框架通过间隔序列以交替串联的方式连接。
[0011] 在本发明所提供的复合多联表达框架中，所述启动子为polyll或者polylll。
[0012] 在本发明的一个实施例中，所述间隔序列为pri-miRNA序列中pre-miRNA的侧翼 序列或类似序列。
[0013] 在本发明的一个实施例中，所述间隔序列的长度为21-51nt。优选地，所述间隔序 列的长度为38-40nt。
[0014] 在本发明的一个实施例中，所述表达框架为：
[0015] 1)启动子-gRNAl-间隔序列I-RNAil-间隔序列2-gRNA2-终止子；或者
[0016] 2)启动子-(gRNAl-间隔序列I-RNAil-间隔序列2)n-gRNA(n+l)_终止子，其中n 为大于1的整数。
[0017] 在本发明的复合多联表达框架中，所述gRNA和所述RNAi靶向引起感染性或者非 感染性疾病的DNA和RNA序列。
[0018] 在本发明的一个实施例中，所述感染性疾病为HBV感染疾病或者HIV感染疾病，但 本发明的感染性疾病并不限于此。
[0019] 在本发明的一个实施例中，所述非感染性疾病为癌症，但本发明的非感染性疾病 并不限于此。
[0020] 本发明还提供了所述复合多联表达框架在制备治疗或者预防感染性或者非感染 性疾病的药物中的用途。
[0021] 此外，本发明又提供了所述复合多联表达框架在病毒或者非病毒质粒载体转导或 转染细胞中的应用。
[0022] 在本发明的一个实施例中，所述病毒包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒以及腺相关 病毒。
[0023] 本发明的还一个目的是提供一种包含如权利要求1-9所述的复合多联表达框架 的真核表达载体。
[0024] 本发明的另一个目的是提供一种构建如权利要求1-9所述的复合多联表达框架 的构建方法，该方法包括如下步骤：
[0025] 1)将gRNAl序列通过核酸内切酶1装入到p458M载体中，以形成p458M-gRNAl载 体；
[0026] 2)合成酶切位点1-(间隔序列I-RNAi-间隔序列2-gRNA2)n-酶切位点2的序列 片段；
[0027] 3)将所述序列片段通过识别所述酶切位点1的核酸内切酶2和所述酶切位点2的 核酸内切酶3,装入到p458M-gRNAl载体，以形成本发明的复合多联表达框架。
[0028] 此外，本发明的又一个目的是提供一种构建如权利要求1-9所述的复合多联表达 框架的构建方法，该方法包括如下步骤：
[0029] 1)合成启动子-(gRNAl-间隔序列I-RNAil-间隔序列2)n-gRNA(n+l)_终止子（其 中n为大于1的整数）的序列片段；
[0030] 2)将所述序列片段通过核酸内切酶装入到p458M载体中，以形成本发明的复合多 联表达框架。
[0031] 在本发明的一个实施例中，所述p458M载体通过在p458(pSpCas9(BB)-2A-GFP)载 体中插入酶切位点1和酶切位点2,并将polyT序列去掉而获得。
[0032] 本发明的有益效果
[0033] 本发明解决了一个启动子只能连接一个gRNA和一个转录终止子的现有表达结 构的困局。并且，本发明可