图所示）比较，评价gRNA2-miR-HBV-gRNA3在 抗HBV病毒中的优势。其中，分别将HBV表达载体和gRNA2-gRNA3二联体或不同间隔 序列长度的gRNA3-miR-HBV-gRNA2表达复合体共转至Huh7细胞中，72小时后，收集细胞 上清，采用时间分辨免疫荧光检测试剂盒（新波生物）检测细胞培养上清中HBsAg的表 达水平。结果如图5b所示，不同间隔序列长度的gRNA2-miR-HBV-gRNA3均可高效抑制 HBV复制，且优于gRNA2-gRNA3二联体，且最佳间隔序列长度为38bp。据此，我们构建另 外一套HBV特异的gRNA4-miR-HBV-gRNAl表达复合体（如图3c所示），通过双荧光素酶 活性分析方法来检测gRNA4-miR-HBV-gRNAl表达复合体产生miR-HBV的能力，并如图5c 所示，证实该表达复合体可高效产生miR-HBV。采用时间分辨免疫荧光检测试剂盒（新 波生物）检测gRNA3-miR-HBV-gRNA2和gRNA4-miR-HBV-gRNAl表达复合体对细胞培养 上清和细胞内HBsAg(图5d)和HBeAg(图5e)的表达水平的抑制作用，其结果进一步证 实gRNA2-miR-HBV-gRNA3和gRNA4-miR-HBV-gRNAl表达复合体均可高效抑制上清和细胞 内多种基因型HBV(基因型A、B和OHBsAg和HBeAg的表达水平。并通过MTT实验分析 gRNA2-gRNA3 二联体、gRNA3-miR-HBV-gRNA2 和gRNA4-miR-HBV-gRNAl表达复合体的细胞毒 性，如图5f所示，证实所有gRNA和miR-HBV无明显细胞毒性。（* :p〈0. 05，# :p〈0. 01，#* :p〈0.001，student'st-test)〇
[0106] 3)评价gRNA3-miR-HBV-gRNA2 和gRNA4-miR-HBV-gRNAl表达复合体HBVDNA的 剪切作用。通过两条位于gRNA剪切位点外侧的引物进行PCR扩增的方法，分别将HBV表达 载体分别与gRNA3-miR-HBV-gRNA2 (图 6a)或gRNA4-miR-HBV-gRNAl(图 6b)表达复合体共 转至Huh7细胞中，72小时后，收集细胞沉淀，提取DNA，用鉴定引物进行PCR扩增。结果证 实gRNA3-miR-HBV-gRNA2和gRNA4-miR-HBV-gRNAl表达复合体均可剪切HBVDNA，形成预期 大小的片段。如图6c所示，测序分析gRNA3-miR-HBV-gRNA2表达复合体对HBVDNA的剪切 作用，并如图6d所示，测序分析gRNA4-miR-HBV-gRNAl表达复合体对HBVDNA的剪切作用。 经测序证实切下的片段为两个gRNA剪切位点之间的序列。
[0107] 4)评价gRNA3-miR-HBV-gRNA2 和gRNA4-miR-HBV-gRNAl表达复合体HBVcccDNA 的剪切作用。分别将gRNA3-RNA2二联体和gRNA3-miR-HBV-gRNA2复合体转染至稳定表 达HBV的肝癌细胞系IfepAD38细胞中，由于二者的表达载体均带有绿色荧光蛋白表达 基因，转染成功的细胞会表达绿色荧光蛋白，72小时后，通过流式细胞仪分选出EGFP阳 性的细胞，提取细胞DNA，经PSAD酶切，滚环扩增和定量PCR(SYBRGreen法）检测HBV cccDNA的相对水平，扩增引物位于gRNA3剪切位点的两侧，如图7a所示，引物结果显示 gRNA3-RNA2二联体和gRNA3-miR-HBV-gRNA2复合体均可显著降低HBVcccDNA的水平，而 RNA3-miR-HBV-gRNA2复合体对cccDNA水平的抑制作用显著高于RNA3-RNA2二联体。用 位于gRNA2和gRNA3两侧的引物对滚环产物进行PCR扩增，扩增产物经1. 5 %琼脂糖胶电 泳检测，结果如图7b所示，gRNA3-RNA2二联体和gRNA3-miR-HBV-gRNA2复合体均可剪切 cccDNA，形成小片段，RNA3-miR-HBV-gRNA2复合体对cccDNA的剪切作用比RNA3-RNA2二联 体强，与定量PCR结果一致。究其原因，我们推测miR-HBV增强了gRNA对HBV复制水平的抑 制作用，进而在一定程度上抑制了cccDNA的补充。为了验证上述假设，我们将gRNA3-RNA2 二联体转染至H印AD38细胞，6小时后，进行拉米夫定（3TC)处理，72小时后，经流式细胞仪 分选EGFP阳性的细胞，提取细胞DNA，通过荧光定量PCR方法检测细胞内HBVDNA水平，如 图7c所示，结果发现拉米夫定处理后，细胞内HBVDNA的水平显著降低。此外，将上述细胞 沉淀经PSAD酶切，滚环扩增和定量PCR(SYBRGreen法）检测HBVcccDNA的相对水平，扩 增引物位于gRNA3剪切位点的两侧（* :p〈0. 05, ** :p〈0. 01，student'st-test)，如图7(1所 示，发现可显著增强RNA3-RNA2二联体对HBVcccDNA的抑制作用。这些结果在一定程度上 验证了上述假设。
[0108] 本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具 体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具 体实施方式和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本 申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。
【主权项】
1. 一种复合多联表达框架，包括：一个启动转录的启动子、一个或多个gRNA表达框架、 一个或多个RNAi表达框架以及一个终止转录的终止子，所述表达框架具有在DNA水平和 mRNA水平修饰靶基因的功能， 其中，所述gRNA/CRISPR基因修饰表达框架与所述RNAi表达框架通过间隔序列以交替 串联的方式连接。2. 如权利要求1所述的复合多联表达框架，其中所述启动子为polyll或者polylll。3. 如权利要求1所述的复合多联表达框架，其中所述间隔序列为pri-miRNA序列中 pre-miRNA的侧翼序列或类似序列。4. 如权利要求4所述的复合多联表达框架，其中所述间隔序列的长度为21-51nt。5. 如权利要求5所述的复合多联表达框架，其中所述间隔序列的长度为38-40nt。6. 如权利要求1所述的复合多联表达框架，其中所述表达框架为： 1) 启动子-gRNAl-间隔序列I-RNAil-间隔序列2-gRNA2-终止子；或者 2) 启动子-(gRNAl-间隔序列I-RNAil-间隔序列2)n-gRNA(n+l)_终止子，其中n为大 于1的整数。7. 如权利要求1所述的复合多联表达框架，其中所述gRNA和所述RNAi靶向引起感染 性或者非感染性疾病的DNA和RNA序列。8. 如权利要求7所述的复合多联表达框架，其中所述感染性疾病为HBV感染疾病或者 HIV感染疾病。9. 如权利要求7所述的复合多联表达框架，其中所述非感染性疾病为癌症。10. 如权利要求7所述的复合多联表达框架在制备治疗或者预防感染性或者非感染性 疾病的药物中的用途。11. 如权利要求10所述的用途，其中所述感染性疾病为HBV感染疾病或者HIV感染疾 病。12. 如权利要求10所述的用途，其中所述非感染性疾病为癌症。13. 如权利要求1-9所述的复合多联表达框架在病毒或者非病毒质粒载体转导或转染 细胞中的应用。14. 如权利要求13所述的应用，其中所述病毒包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒以及腺 相关病毒。15. -种包含如权利要求1-9所述的复合多联表达框架的真核表达载体。16. -种构建如权利要求1-9所述的复合多联表达框架的构建方法，该方法包括如下 步骤： 1) 将gRNAl序列通过核酸内切酶1装入到p458M载体中，以形成p458M-gRNAl载体； 2) 合成酶切位点1_(间隔序列I-RNAi-间隔序列2-gRNA2)n-酶切位点2的序列片段； 3) 将所述序列片段通过识别所述酶切位点1的核酸内切酶2和所述酶切位点2的核酸 内切酶3,装入到p458M-gRNAl载体，以形成如权利要求1-9所述的复合多联表达框架。17. 如权利要求16所述的构建方法，其中所述p458M载体通过在 p458 (pSpCas9 (BB) -2A-GFP)载体中插入酶切位点1和酶切位点2,并将poly T序列去掉而 获得。
【专利摘要】用于载体表达的复合多联gRNA和RNAi的表达框架。本发明提供了一种复合多联的gRNA和RNAi的表达框架，可用于真核表达载体系统。该复合多联表达框架包括：一个启动转录的启动子、一个或多个gRNA表达框架、一个或多个RNAi表达框架以及一个终止转录的终止子，所述表达框架具有在DNA水平和mRNA水平修饰靶基因的功能，其中所述gRNA/CRISPR基因修饰表达框架与所述RNAi表达框架通过间隔序列以交替串联的方式连接。本发明解决了一个启动子只能连接一个gRNA和一个转录终止子的现有表达结构的困局。
【IPC分类】A61P35/00, A61P31/20, A61P31/18, A61K48/00, C12N15/85
【公开号】CN105002214
【申请号】CN201510164123
【发明人】许中伟, 鲁凤民, 王杰
【申请人】许中伟, 鲁凤民, 王杰
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年4月8日