基因OsPIL13在提高水稻盐胁迫耐性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及农业科学领域，具体而言，本发明设及通过降低水稻0SPIL13基因的 表达来提高水稻的盐胁迫耐性。
【背景技术】
[0002] 水稻是全球最主要的粮食作物，全球有50%的人口 W稻米为主食。水稻生产对保 障全球粮食安全，减少贫困人口和农村就业发挥着重要的作用。长期W来，水稻是我国播种 面积最大、总产量最多、单产最高的粮食品种，是我国65%左右人口的主食，在粮食生产和 消费中处于主导地位。盐害是水稻生产上最严重的非生物逆境危害因子之一。我国的盐碱 ±地面积达到了一亿公顷，受盐侵害的稻田约占栽培面积的五分之一，并且±壤盐溃化有 日益扩大和加剧的趋势，造成的产量损失已难W估算。随着水稻抗逆机制研究的不断深入， 利用基因工程培育耐盐水稻新品系是解决运一农业问题的最有效途径之一。
[0003]目前用于抗盐基因工程的基因主要包括W下几类。第一，参与渗透保护物质（如 脯氨酸、甘露醇、甜菜碱、海藻糖等）合成的基因。运样能够使植物在水分胁迫下能合成 更多的渗透调节物质，W提高植物的渗透调节能力，从而增强植物的耐盐性。如在水稻中 过量表达脯氨酸生物合成途径上的关键酶基因（P5CS, deltal-pyrroline-S-carbo巧late synthase)提高了转基因植株的抗旱性化ishor et al. 1995 ;Plant Sci，199:41 - 48); 在转基因水稻植株中提高海藻糖的含量能够增强对盐、干旱和低溫的胁迫耐性（Garg et al. 2002)。第二，调控基因。运类基因包括与ABA生物代谢相关的基因（如NC邸和ABAOX)、 ABA信号传导途径相关的基因（如编码bZIP类、Myb类、NAC类、zinc-finger类转录因子的 基因）和ABA非依赖途径的转录因子如DREB家族基因（Kumar et al.，Rice，6:27;Todaka et al. , Rice, 5:6)。
[0004]目前在水稻中已报道的与盐胁迫反应有关的转录因子，部分转录因子已经用于 耐盐基因工程改良中，主要包括W下几类：第一，DREB1/CBF调控子：水稻基因组包括至 少 10 个 DREB1 值ehy化ation-responsive element binding protein 1)型基因，过量 表达OsDREBlA和OsDREBlF的转基因水稻植株对高盐抗性均增强，同时转基因水稻植株 积累了较高含量的渗透调节物质，如脯氨酸和各种可溶性糖（Ito et al.，2006;Wang et al.，2008)。第二，AR邸调控子，ABA是植物非生物胁迫反应中的一个关键信号分子。AR邸基 因编码bZIP-型转录因子，目前有几个bZIP型转录因子在盐胁迫反应中的功能已有报道。 0sABF2基因的T-DNA插入突变体（Os油f2)对高盐的敏感性增强（Hossain et曰1.，2010)。 过量表达0sABI5的转基因水稻对盐胁迫较为敏感狂OU et al.，2008)。0sbZIP23基因 的过表达转基因水稻的耐盐性提高，而该基因的功能缺失突变体对盐的抗性降低。第=， 转录因子包含一个保守的DNA结合结构域（52个氨基酸的肌B结构域）。0SMYB3R-2 过表达增强了拟南芥的盐胁迫耐性值ai et al.，Plant Phyisol，2007, 143:1739-1751)。 过表达0sMYB2基因的水稻植株对盐的耐性增强，但并不影响植株的生长。在该基因过 表达水稻中，其下游基因0sLEA3,0sRabl6A和0SDREB2A表达上调（Yang et al.，J Exp Bot，2012, 63:2541-2556)。运表明，OsMYB2可能是调控水稻胁迫反应的主要开关。第四， NAC型转录因子也是通过ABA依赖途径调控水稻盐胁迫反应。高盐胁迫诱导多个水稻NAC 基因的表达。SNAC1和OsNACe过表达水稻植株的盐胁迫耐性提高化U et al.Proc化tl Acad Sci USA，2006，103:12987 - 12992;Nakashima et al.，Plant J.，2007, 51:617-630)。 第五，锋指转录因子也参与水稻的盐胁迫耐性，如TFIIIA-型的ZFP252基因过表达水稻植 株盐胁迫耐性显著提高狂U et al.阳BS lett, 2008, 582:1037-1043)。
[000引本发明从水稻日本晴中分离克隆到一个编码bHLH结构域的基因。化kamura等人 (2006)在水稻基因组中预测到该基因序列，将其命名为0SPIL13。但是目前该基因功能未 知。
【发明内容】
[0006] 本发明申请人在一个盐胁迫耐性提高的水稻突变体中，利用基因表达图谱鉴定到 一个序列号为AK105637,编码含有bHLH结构域的0SPIL13基因。水稻0SPIL13基因的0RF 区有1233个碱基对，编码410个氨基酸和1个终止密码子。本发明通过PCR方法，扩增出 水稻OsPILlS基因的一段特异序列（372bp)，连接在植物表达载体pANDA上。利用该特异 片段构建RNAi植物表达载体，转化水稻，抑制水稻内源0SPIL13基因的表达水平，得到水稻 0SPIL13基因表达水平降低的转基因水稻植株。在转基因的T4代植株纯合株系中发现，阳 性水稻植株的盐胁迫耐性明显高于对照植株。
[0007] 本发明用于构建0SPIL13基因RNAi植物表达载体的基因0SPIL13的特异序列如 沈Q ID NO :1所示。
[0008] 本发明还设及基因0SPIL13在提高水稻盐胁迫耐性中的应用方法，具体方法如 下：它首先通过PCR方法扩增水稻OsPILlS基因的特异cDNA序列，然后将PCR产物连接 到祀NTR/D-T0P0载体，获得祀NTR-PIL13载体；然后将祀NTR-PIL13载体与pANDA载体进 行LR克隆反应，0SPIL13基因的特异序列分别W正向和反向插入pANDA植物表达载体的 gus-linker两侧，获得植物表达载体pANDA-PIL13 ;再利用农杆菌介导的遗传转化方法将 植物过表达载体转化至水稻品种日本晴中，抑制0SPIL13基因的表达，得到水稻0SPIL13基 因表达降低的转基因水稻植株。
[0009] 其中，祀NTR/D-T0P0克隆载体是商业化载体，植物表达载体pANDA已经公开发表 (Miki and Shimamoto, Plant Cell F*hysiol, 2004, 45(4) :490 - 49巧。
[0010] 本发明利用水稻品种日本晴的0SPIL13基因的特异片段作为应用序列，将该序列 正向和反向转入水稻中，降低0SPIL13基因的表达水平，转基因阳性水稻植株表现出抗盐 性提高。在盐胁迫（200mM化C1)条件下，对照材料的存活率约为11.0%，而转基因水稻幼 苗的存活率为71~90%，均明显高于对照。运为培育耐盐高抗作物品种提供了新的基因资 源和新途径，具有一定的经济意义。
[0011] 本发明的优点在于：
[0012] (1)本发明提供了一个增强水稻盐胁迫的基因0SPIL13 ;申请人在水稻中抑制表 达0SPIL13基因后，发现转基因水稻盐胁迫耐性明显提高；
[0013] (2)本发明首次在水稻中抑制表达了 0SPIL13基因，为培育抗盐水稻品种提供了 新思路，也为其它作物利用异源基因技术提高抗逆性提供了理论依据；
[0014] (3)本发明中所设及的抑制0SPIL13基因的表达方法，除了用RNAi技术外，还可w 利用反义RNA技术、CRISPR技术等抑制内源基因的表达，因此通过降低0SPIL13或者其同 源基因的表达培育耐盐作物新品种具有较为广泛的应用空间；
[0015] (4)本发明中应用的基因可W为水稻等禾谷类作物W及其它作物抗盐等抗性研究 提供支持。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明的0SPIL13基因RNAi表达载体的构建示意图；将含有0SPIL13基因 特异片段的祀NTR/D-T0P0载体（祀NTR-PIL13)与pANDA载体进行LR反应，运样OsPILlS 基因特异片段分别W正向和反向插入在pANDA载体上的gus linker的两侧，即构建成了 0SPIL13基因的RNAi植物表达载体PANDA-PIL13 ;
[0017] 图2为本发明中0SPIL13转基因植株的Southern杂交结果图；其中0sPIL13-RNAi 表示0SPIL13基因的RNAi转基因水稻株系，#3、#5和#6代表不同阳性转基因株系；WT代 表野生型水稻植株；
[001引图3为检测T4代转基因水稻性植株中0SPIL13基因转录本水平结果图； 0sPIL13-RNAi表示0SPIL13基因的RNAi转基因水稻株系，#3、#5和#6代表不同阳性转基 因株系；WT代表野生型水稻植株；
[0019] 图4为0sPIL13-RNAi转基因水稻植株和野生植株的盐胁迫耐性比较图；A是 0sPIL13-RNAi转基因水稻株系和野生型（WT)在200mM化C1处理前，化C1处理6天而后恢 复5天后的表型图巧是存活率比较图；#3、#5和#6代表不同阳性转基因株系；WT代表野生 型水稻植株。
【具体实施方式】
[0020] W下实施例定义了本发明，并描述了