嗜热异常球菌Dgeo0395增强细胞抗逆的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及嗜热异常球菌化eo0395基因的新功能，具体设及该基因在增强原核 宿主对干燥、氧化和紫外线福照抗性方面的应用。
【背景技术】
[0002] 异常球菌属值einococ州S)菌株可W在核污染地区的高福射上壤中生存，同 时在砂岩、大理石和南极冰盖和沙漠等极端环境中都可W生长繁殖。嗜热异常球菌 值einococ州S geothermalis)最初分离于意大利的溫泉，可在高达55°C环境下生存，而且 在深海环境（海平面下68-118米）中也分离到了该菌株。其对于电离福射（〉15kGy)和紫 外线福射（〉600J/m2)具有超强的抗性。其高效的DNA修复蛋白和细胞清除系统对其抗性 表型具有重大贡献。
[0003] Dgeo0395(GeneID:4057478 ;ProteinID:ABF44698. 1)是嗜热异常球菌 值einococcus geothermalis)重要的调控蛋白，能够特异性响应胁迫信号，提高该菌株本 身抗击基因的表达。
[0004] 但目前未见嗜热异常球菌中的Dgeo0395基因（GeneID:4057478; ProteinID:ABF44698. 1)在增强其他生物干燥、氧化和紫外线福照抗性功能的研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是从嗜热异常球菌基因组中发现能够增强细胞对干燥、氧化和紫外 线福射抗性的基因。并将该基因转入大肠杆菌，使转入该基因的生物获得抵抗运些胁迫的 能力。
[0006] 本发明通过如下研究，首次发现具有SEQ ID NO: 1所示序列的嗜热异常球菌的 Dgeo0395 基因（GeneID:4057478 ;ProteinID:ABF44698. 1)可用于增强其他生物干燥、氧化 和紫外线福照抗性。具体研究工作如下：
[0007] 1、获得含有化eo0395基因的重组工程菌株
[0008] 1)通过PCR从嗜热异常球菌菌株DSM 11300基因组扩增出化eo0395基因，基因 序列号为：GenelD :4057478。其大小为87化P，该基因编码289个氨基酸，将其克隆于载体 P巧T上，构建了含有完整化eo0395基因的重组质粒rJET-0395 ;
[0009] 2)将化eo0395基因连接于PRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和异常 球菌中都起作用的gro化启动子，构建含有gro化启动子的完整化eo0395基因重组质粒 PRADZ3-0395；
[0010] 3)将导入化eo0395基因的重组质粒PRADZ3-0395转入受体大肠杆菌JM109中，获 得工程菌株JM-0395 (详见实施例1);
[0011] 2、含有化eo0395基因重组工程菌株的抗干燥、氧化和紫外线福照实验
[0012] 实验证实，分别进行干燥、氧化和紫外线福照胁迫冲击后，含有嗜热异常球菌 化eo0395基因的JM-0395重组菌株生长状况良好，菌落数明显高于只含空质粒的JM-Z3菌 株（见实施例2及图2)。该工程菌株具有耐受干燥、氧化和紫外线福照冲击的能力。
[0013] 此实验表明：嗜热异常球菌化eo0395基因显著增强了细胞对干燥、氧化和紫外线 福照胁迫的抗性。
[0014] 序列表信息
[0015]沈Q ID NO. 1 :Dgeo0395 基因的 DNA 序列。
[0016]沈Q ID NO. 2 :Dgeo0395 的氨基酸序列。
【附图说明】：
[0017] 图1.是含有嗜热异常球菌化eo0395序列的PCR产物及载体验证电泳图谱；
[0018] Lane 1: 2K plus Marker ;Lane 2 ~3: PCR product of P化T-0395 ;Lane 4:pRADZ3-〇395/NdeI;Lane 日：pRADZ3-〇395/NdeI+Spe I;Lane 6:pRADZ3-〇395/Spe I; Lane 7:pRADZ3-〇395/NdeI+Spe I
[0019] 图2.紫外福照、丝裂霉素C氧化和干燥胁迫冲击前后，含有空载体菌株（JM-Z3) 和含有嗜热异常球菌化eo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌（JM-0395)的生长情况对 比。
【具体实施方式】
[0020] W下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发 明的实质内容加W限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规 条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（化W York:Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0021] 实施例中所举的质粒、菌株来源如下：
[0022] 克隆载体iJET :为化ermoFisher公司市售产品；
[002引穿梭质粒PRADZ3 :为本实验室保存；
[0024] 大肠杆菌JM 109 :为北京全式金公司市售产品。
[00巧]实施例1嗜热异常球菌化eo0395基因序列在大肠杆菌中的表达 [002引一、实验方法
[0027] 1.根据已公布的嗜热异常球菌菌株DSM 11300基因组中的化eo0395基因序列设 计1对PCR特异性引物：
[0028] 0395-F :5' ACCACTAGT ATGACGCAGGGCCAGACCCC 3'
[0029] 0395-R :5' ACCCATATG TCAGACACCCGACTCATCCT 3'
[0030] 2.通过PCR方法从嗜热异常球菌菌株DSM 11300基因组DNA中扩增出目的基因序 列。
[0031]反应条件：94 °C lOmin，巧4 °C 30sec，60 °C 30sec，72 °C 1. 5min]35 个循环， 72 °C 10min〇
[0032] 3. PCR产物经胶回收后，克隆于载体rJET上，命名为rJET-0395,并测序验证；然后 通过Spel/Ndel双酶切获得含有粘性末端的化eo0395基因及含有gro化启动子的PRADZ3 载体，将化eo0395基因连接于PRADZ3载体上，构建大肠杆菌表达载体PRADZ3-0395。
[0033] 4.将该表达载体转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切，测序验证插入序列正确（见图 1，2)，将该菌株命名为JM-0395。含有PRADZ3空质粒的E. coli JM109命名为JM-Z3。
[0034] 二、实验结果
[0035] 成功构建了表达化eo0395的重组大肠杆菌工程菌株。
[0036] 实施例2含嗜热异常球菌菌株化eo0395基因重组工程菌株的胁迫抗性实验
[0037] 一、实验材料
[0038] 重组工程菌株：实施例1得到的含有嗜热异常球菌菌株化eo0395的JM-0395菌株
[0039] 对照菌株：实施例1所述含空质粒的JM-Z3菌株。
[0040] 二、实验方法
[0041] 1.将对照菌株和重组工程菌株在LB固体培养基平板上划线活化；
[0042] 2.挑取单菌落接种于添加有相应抗生素的液体LB培养基中，37°C培养至指数中 后期；
[0043] 3.室溫下6, 00化pm离屯、5min收集菌体，然后用相同体积的憐酸缓冲液（pH 7. 0) 将菌体洗涂两次，震荡均匀；
[0044] 接下来进行紫外福照抗性、丝裂霉素C抗性和干燥抗性实验
[0045] A.紫外福照扣V)抗性分析：
[0046] 1)将菌液分为等体积两份；
[0047] 2) -份于室溫下6, 00化pm离屯、5min后收集菌体，作为对照；
[0048] 3)取另一份菌液经紫外福照5min后，室溫下6, 00化pm离屯、5min后收集菌体；
[0049] 4)取不同时间段的菌液，10倍稀释至10 5,取10 y L点在LB固体培养基平板上， 37°C培养2d，观察，记录不同菌株的生长情况；
[0050] W取不同时间段的菌液，10倍稀释至10 5,取200化涂布LB固体培养基平板， 37°C培养2d，记录菌落数量，计算菌株生存率，实验重复3次。
[0051]B.丝裂霉素C氧化抗性分析：
[0052] 1)将菌液分为等体积两份；
[0053] 2) -份于室溫下6, 00化pm离屯、5min后收集菌体，作为对照；
[0054]如将菌体重悬于终浓度为lOiig/血的丝裂霉素C的LB液体培养基中，30°C， 220rpm 摇床培养 5min, lOmin, 15min;
[0055] 4)取不同时间段的菌液，10倍稀释至10 5,取10 y L点在LB固体培养基平板上， 37°C培养2d，观察，记录不同菌株的生长情况；
[0056] 5)取不同时间段的菌液，10倍稀释至10 5,取200化涂布LB固体培养基平板， 37°C培养2d，记录菌落数量，计算菌株生存率，实验重复3次。
[0057]C.干燥抗性分析：
[0058]1)将菌液分为等体积两份；
[0059] 2) -份于室溫下6, 00化pm离屯、5min后收集菌体，作为对照；
[0060] 3)另一份分装于敞口的EP管中，置于无菌干燥器内（W颗粒状硅胶作为干燥 剂）；
[006。 4)每隔lOd取出一个批次的几种不同菌株，倍比稀释至10-5,取10化点在LB固 体培养基平板上，37°C培养2d，观察，记录不同菌株的生长情况；
[006引W取不同时间点的菌液，10倍稀释至10-5,取200 y L涂布LB固体培养基平板， 37°C培养2d，记录菌落数量，计算菌株生存率，实验重复3次。
[006引 S、实验结果
[0064] 如图2显示，紫外福照、丝裂霉素C和干燥胁迫冲击前，含有嗜热异常球菌菌株 化eo0395的JM-0395菌株与含空质粒的JM-Z3菌株生长状态基本一致；
[0065] 紫外福照、丝裂霉素C和干燥胁迫冲击后，含有嗜热异常球菌菌株化eo0395基因 的JM-0395重组菌株生长状况良好，菌落显著数多于只含空质粒的JM-Z3菌株。其中紫外 福照抗性和干燥胁迫抗性较对照菌株提高2个数量级，约100倍；丝裂霉素C氧化胁迫抗性 提高3个数量级，约1000倍。
[0066] 通过菌株胁迫后的生存率计算可W清楚的发现：
[0067] UV福照后对照菌株存活率为0. 644% ±0. 052% ;表达菌株Dgeo0395的JM-0395 菌株存活率为45. 570% ±3. 797%，比对照菌株提高近70倍。
[0068] 干旱胁迫处理后对照菌株存活率为3. 040% ±0. 929%，而JM-0395菌株存活率为 88. 889% ±7. 274%，比对照菌株提高近30倍。
[0069] 丝裂霉素C氧化胁迫后对照菌株几乎都已经死亡，而JM-0395菌株存活率为 58. 642% ±4. 660%，菌株生存能力显著高于对照菌株。
[0070] 表2是紫外福照、丝裂霉素C氧化和干燥胁迫冲击前后，含有空载体菌株（JM-Z3) 和含有嗜热异常球菌化eo0395基因的重组大肠杆菌菌株（JM-0395)存活率比较。
[0071] 表2 =种胁迫处理后菌株存活率比较
[0072]
[007引 四、实验结论
[0074] 嗜热异常球菌菌株化eo0395基因显著增强了原核生物抵抗紫外福射、氧化和干 燥胁迫的能力。
【主权项】
1. Dge〇0395基因在提高其它生物抗逆功能的应用，所述抗逆包括抗细胞氧化、抗紫外 辐照和抗干燥，所述基因的序列号是GeneID:4057478,如SEQIDN0:1所示。2. 权利要求1所述DNA序列编码的氨基酸序列，如SEQIDNO: 2所示。3. 权利要求1所述的应用，所述其它生物是原核生物。
【专利摘要】本发明发现嗜热异常球菌Deinococcus？geothermalis中的Dgeo0395基因在原核宿主细胞中表达后，能增强宿主细胞干燥、氧化和紫外线辐照抗性。实验证明，经与对照菌株相比，嗜热异常球菌菌株Dgeo0395基因显著增强了原核生物抵抗紫外辐射、氧化和干燥胁迫的能力。
【IPC分类】C12N15/31, C12N15/70
【公开号】CN105002201
【申请号】CN201510237091
【发明人】张维, 周正富, 陆伟, 林敏
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年5月11日