以淀粉为原料制备葡萄糖-1-磷酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种憐酸葡萄糖的制备方法，具体设及一种W淀粉为原料制备葡萄 糖-1憐酸的方法。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖-1-憐酸（G-1-巧广泛存在于动植物W及微生物中，在生物体中起着重要 的作用。G-1-P是糖原等多糖降解的第一个产物，可W在葡萄糖憐酸变位酶巧C 5. 4. 2. 2) 的作用下生成葡萄糖-6-憐酸，进入EMP途径；也可W在核酸二憐酸葡萄糖焦憐酸化酶的 催化下合成核酸二憐酸葡萄糖（NDP-glucose)，进一步用于各种糖巧的合成等。G-1-P在医 药、食品方面应用广泛，它能明显阻止脂肪肝浸润，促进骨骼及牙齿中巧的累积，W及增强 巧在哺乳动物小肠内的主动运输。此外，G-1-P还可W用作抗菌剂，其销馨合物更可用于癌 症的治疗；壳聚糖/G-1-P即型水凝胶可W作为创面止血材料及药物缓释材料。
[0003] 用于生产G-1-P的葡聚糖憐酸化酶可^从±豆中提取，W可溶性淀粉为原料 (化tional Academy Science Letters 2013, 36 (2): 133-137)。微生物是葡聚糖憐酸化酶 的最主要来源，微生物产酶具有产量高、易分离等优点。1979年，Werner等人对化ysarum polyce地alum中的a -葡聚糖憐酸化酶进行分离纯化并对酶学性质进行表征。该酶为糖原 憐酸化酶，最适溫度为30°C，最适抑为6. 7。在憐酸解方向，G-1-P与鸟巧二憐酸葡萄糖对 反应有抑制作用，而5' -AMP则有微弱的促进作用，可W中和G-1-P的抑制作用巧uropean Journal of Biochemistry. 1979,102:345-355)。1998 年，hkata 等人对嗜热脂肪芽抱杆 菌中的葡聚糖憐酸化酶进行研究，发现其最适溫度为50°C (Journal of F'ermentation and Bioengineering 1998,85(2) : 156-161)。由于耐高溫酶具有反应速率高、不易染菌、酶稳定 性好等优点，在工业应用中占有极大优势。2005年，化ngdon等人将化ermus caldophilus 中编码葡聚糖憐酸化酶的基因进行克隆，在E.coli中表达，将重组葡聚糖憐酸化酶分离 纯化，并对酶学性质进行表征。此重组酶的最适抑为7. 0,最适溫度为70°C，在低于70°C 时酶较稳定，而当溫度高于80°C时，酶活迅速下降。W可溶性淀粉为原料，在70°C下生产 G-1-P，底物转化率达68. 78 %，是目前报道的W葡聚糖憐酸化酶催化制备G-1-P的最高值 (Process Biochemistry 2005,40:3707 - 3713)〇
[0004] 目前所有的葡聚糖憐酸化酶研究中均采用可溶性淀粉为底物，而可溶性淀粉生产 工艺较复杂，价格是普通淀粉的3-4倍，不适合G-1-P的大规模生产。如果能W廉价的普通 淀粉代替可溶性淀粉直接用作酶催化产G-1-P的原料，则有望显著降低原料成本。目前， 国内外未见有关普通淀粉制备G-1-P的报道，主要原因可能是普通淀粉在常溫下不能完全 糊化，很难直接利用。而目前已报道的用于合成G-1-P的葡聚糖憐酸化酶中，最高溫度为 70°C。一般而言，常见淀粉的糊化溫度为60-70°C，完全糊化溫度为65-75°C，若反应溫度为 70°C，不能保证淀粉完全糊化。且70°C时各淀粉的粘度较高，如5%玉米淀粉及马铃馨淀粉 粘度分别为420CP及880CP。在70°C下反应，则造成底物与酶接触不充分，不利于反应进行。 所W若要有效地利用淀粉，需要寻找一种反应溫度更高的酶，使淀粉完全糊化，体系粘度降 低。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的是针对G-1-P现有的生产原料价格昂贵的问题，提供一种利用廉价 易得的普通淀粉生产G-1-P的方法，本发明具有原料成本低、转化率高、G-1-P产量高等优 点。
[0006] 一种W淀粉为原料制备葡萄糖-1-憐酸的方法，包括如下步骤：
[0007] (1)将编码葡聚糖憐酸化酶的基因经稀有密码子优化后连接到质粒上构建重组质 粒，再将重组质粒转化到宿主菌中构建重组菌；诱导表达所得重组菌；
[0008] (2)将诱导表达后的重组菌离屯、、收集菌体，制备重组葡聚糖憐酸化酶纯酶液；
[0009] (3)将所得重组葡聚糖憐酸化酶纯酶液加入淀粉与缓冲液的混合溶液中，85-90°C 下反应，得葡萄糖-1-憐酸；所述淀粉为木馨淀粉、玉米淀粉、马铃馨淀粉或小麦淀粉。
[0010] 步骤（1)中所述质粒为祀T-28a(+);所述宿主菌为E.coli BL2UDE3);因此步骤 (1)进一步优选为：
[0011] 将编码葡聚糖憐酸化酶的基因经稀有密码子优化后连接到祀T-28a(+)质粒上， 构建重组质粒祀T-28a-GP，再转化到E. coli BL21 〇)E3)中，构建重组菌，诱导表达所得重 组菌。
[0012] 优选地，所述编码葡聚糖憐酸化酶的基因来源于最适溫度为75°C及W上极端嗜 热菌；进一步优选地，所述极端嗜热菌为硫化叶菌（Sul化lobus tokodaii)或嗜热古生菌 (Pyrococcus furiosus);最优选为嗜热古生菌（Pyrococcus furiosus)。
[0013] 本发明Pyrococ州s化；riosus中编码葡聚糖憐酸化酶的基因在E. coli中重组表 达，得到的重组酶最适溫度为85-90°C，高于此前报道的其他葡聚糖憐酸化酶。本发明分别 考察了 5%的玉米淀粉和马铃馨淀粉在85°C保溫下化后的糊化效果，结果表明，在85°C下 淀粉可W完全糊化，两者处理后的粘度分别为150CP及390CP，有利于底物与酶的充分接 触，提高反应速率。
[0014] 由于Pyrococ州S化；riosus是古生菌，培养困难、生长速率和产酶量均很低，故 拟将其基因在常见的表达体系E.coli中重组表达。但由于作为古生菌的Pyrococ州S 化riosus与E. coli的密码子偏爱性差异显著，若直接将其基因在E. coli中表达，会导致蛋 白表达量较低。为此，本发明中对Pyrococcus化riosus中编码葡聚糖憐酸化酶的基因进 行稀有密码子优化，在E. coli中重组表达，W提高酶的表达量及活力。
[0015] 编码葡聚糖憐酸化酶的基因经稀有密码子优化后的碱基序列如SEQ ID NO. 2所 示。优化前的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0016] 步骤（1)中的诱导表达在常规诱导表达培养基上进行，优选地，步骤（1)中诱导表 达重组菌时的诱导条件为：在37°C下培养2-4.化，然后加入诱导剂，25-37°C继续培养6-10 小时。
[0017] 进一步优选地，所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖巧（IPTG);诱导剂的浓度为 0. 05-0. 4mM〇
[0018] 最优选的诱导条件为：于37°C下培养4h后加入0.2mM IPTG，继续于28°C下诱导 培养化。此时重组葡聚糖憐酸化酶表达量最高。
[0019] 步骤（2)中制备重组葡聚糖憐酸化酶纯酶液的方法为：将收集到的菌体破胞得粗 酶液，将所得粗酶液在85-90°C保溫20-40min使宿主菌中蛋白失活沉淀，然后离屯、、其沉 淀，所得上清液即为重组葡聚糖憐酸化酶纯酶液。
[0020] 进一步地，将收集到的菌体破胞得粗酶液，将所得粗酶液在85°C保溫30min使宿 主菌中蛋白失活沉淀，然后离屯、、其沉淀，所得上清液即为重组葡聚糖憐酸化酶纯酶液，利 用此纯化方法所得纯酶酶活达27140U，酶活回收率达85. 31 %。
[0021] 步骤（3)中在加入重组葡聚糖憐酸化酶纯酶液前对淀粉与缓冲液的混合溶液进 行预处理，即：将淀粉与缓冲液的混合溶液在95-105°C下保溫1. 5-2. 5h。进一步优选地，将 淀粉与缓冲液的混合溶液在l〇〇°C下保溫化后加入重组葡聚糖憐酸化酶纯酶液开始反应， 可明显提高整个反