应速率，缩短反应时间。
[0022] 步骤（3)中溫度W 80-90°C为佳，尤W 85°C -90°C为宜，最优选为85°C。
[0023] 优选地，步骤（3)中所加重组葡聚糖憐酸化酶纯酶液的终浓度为4500-5500U/L。 W24] 优选地，步骤（3)中85-90°C下反应时间为20-50小时。进一步优选为在 85°C -90°C下反应24小时。
[00巧]优选地，混合溶液中的淀粉分两次投加，一部分反应开始时投加，余下部分反应中 补加。 阳〇%] 更进一步地，混合溶液中淀粉的总质量浓度为10%，先将缓冲液和占混合液重量 浓度7. 5%的淀粉混合，预处理后加入酶液进行反应，85°C反应1化后补入余下的2. 5%的 淀粉。进行补料反应有利于提高产品的浓度。
[0027] 本发明W普通淀粉为原料制备葡萄糖-1-憐酸，例如木馨淀粉、玉米淀粉、马铃馨 淀粉或小麦淀粉。除W淀粉为原料外，还可W采用麦芽糊精、糖原、淀粉、可溶性淀粉等为原 料。运些原料均廉价易得，大大降低生产成本。
[0028]所述缓冲液为憐酸钟缓冲液（1M)，憐酸钟缓冲液的抑值为6. 0-8. 0,最优选为 6. 6〇
[0029] 本发明的方法中，W玉米淀粉为原料时，最优选的技术方案为：
[0030] 按照步骤（1)制备重组菌并诱导表达，将玉米淀粉加入1M憐酸钟缓冲液中（pH 6. 6)，100°C保溫化，同时将经过诱导的重组菌菌液离屯、收集菌体，破胞得粗酶液；将粗酶 液在85°C保溫30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀，离屯、，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖憐酸 化酶纯酶液；加入到玉米淀粉/憐酸钟缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/1，85°C反应 2地。该反应条件下最终G-1-P产量为32. 52g/l，底物转化率为65%。
[0031] W马铃馨淀粉为原料时，最优选的技术方案为：
[0032] 按照步骤（1)制备重组菌并诱导表达，将马铃馨淀粉加入1M憐酸钟缓冲液中（pH 6. 6)，100°C保溫化，同时将经过诱导的重组菌菌液离屯、收集菌体，破胞得粗酶液；将粗酶 液在85°C保溫30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀，离屯、，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖憐酸 化酶纯酶液；加入到马铃馨淀粉/憐酸钟缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/1，85°C反应 2地。该反应条件下最终G-1-P产量为33. 5g/l，底物转化率为66. 1 %。
[0033] 采用本发明方法，底物转化率可达67. 6%。本发明的特点在于直接利用普通淀粉， 与现有的G-1-P生产方法相比，本发明使用普通淀粉为原料，大幅降低G-1-P生产的原料成 本，为G-1-P的工业化生产奠定基础。
【附图说明】
[0034] 图1是GPase在不同溫度下的比酶活。
【具体实施方式】
[0035] 实施例1重组菌的构建
[0036] 将嗜热古生菌Pyrococ州S化；riosus值SM 3638)中编码葡聚糖憐酸化酶的基因根 据已报道的序列（GenBank:1469411)对其中相对E. coli的稀有密码子序列进行优化，利用 DNA Works完成此优化。原基因序列中约65%为稀有密码子并得到优化。优化前核巧酸序 列如SEQ ID NO. 1所示，优化后核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0037] 将优化后的基因序列进行全合成（委托生工生物工程股份有限公司完成），同时 在基因两段分别引入Sac I和化ndIII酶切位点，采用双酶切的方法，将目的基因定向连接 至表达载体。即用两种不同的限制性内切酶，Sac I和HindIII对基因片段进行酶解，使其 两端产生非互补的粘性末端。同时，质粒祀T-28a(+)也用运两种限制性内切酶酶解出非互 补粘性末端。基因片段与质粒通过互补的粘性末端互补，在DNA连接酶连作用下连接，构建 重组质粒祀T-28a-GP。参照《分子克隆实验指南（第S版）》中的方法，将重组质粒转化到 E. coli BL2UDE3)感受态细胞中，构建重组菌E. coli化2UDE3)/祀T-28a-GP，诱导表达重 组葡聚糖憐酸化酶。
[0038] 实施例2重组葡聚糖憐酸化酶诱导条件优化
[0039] 将重组菌于TB培养基中37 °C下培养，考察诱导时间（2-4.化）、诱导剂浓度 (0. 05-0. 4mM IPTG)、诱导溫度（25-37°C )及诱导后培养时间化-lOh)对重组葡聚糖憐酸化 酶表达的影响。最适诱导条件为：当培养地后加入0. 2mM IPTG于28°C下诱导培养化，此 时重组葡聚糖憐酸化酶表达量最高。
[0040] TB培养基成分：蛋白腺12g，酵母提取物24g，甘油4mL溶解在0.化水中高压灭菌。 冷却到 60°C，再加 100血灭菌的 170mmol/LKH2P〇4、720mmol/L K2HPO4的溶液。
[0041] 实施例3重组葡聚糖憐酸化酶的反应条件优化
[0042] 考察反应溫度化0-100°C )、抑化.0-8. 0)、初始底物浓度比例巧％可溶性淀粉 /0. 5-2M憐酸盐缓冲液）W及常见金属离子巧ml Mg2\ Zn2\化2\ Cu2\ Ca2\化+)对重组酶 酶活的影响。反应体系为ImU初始组成为5%可溶性淀粉/憐酸盐缓冲液，5000U/L GPase, 反应30min，测定不同反应条件的酶活。 阳0创图1是GPase在不同溫度下的比酶活。结果表明，溫度在80°C -90°C时，酶活较高 且变化较小，且85°C -90°C热稳定性较好，4化后仍维持初始酶活的95%及90%。故最适反 应溫度为85°C -90°C;其他最适反应条件分别为，pH 6. 6、5%可溶性淀粉/1M憐酸盐缓冲液 及不添加金属离子。 阳044] 实施例4反应体系预处理
[0045]由于淀粉的不完全糊化造成反应体系初始粘度较高，不利于酶与底物充分接触， 导致反应速度降低，延长反应时间，为了解决运一问题进行反应体系预处理。将淀粉/憐酸 盐缓冲液在100°c下保溫化，并与未预处理的体系比较。结果表明，经过预处理的体系反应 速度大幅提高，反应时间由未经预处理的3化缩短至2地。
[0046] 实施例5 W马铃馨淀粉为原料催化制备G-1-P
[0047]将5%马铃馨淀粉加入1M憐酸钟缓冲液中（pH 6. 6)，100°C保溫化。同时将经过 诱导的E. coli BL21 〇)E3)/pET-28a-GP菌液离屯、收集菌体，破胞，得粗酶液。将粗酶液在 85°C保溫30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀。离屯、，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖憐酸化酶纯 酶液。加入到马铃馨淀粉/憐酸钟缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/1，85°C反应2地，最 终G-1-P产量为33. 5g/l，底物转化率为66. 1 %。
[0048] 实施例6 W木馨淀粉为原料催化制备G-1-P
[0049]将5%木馨淀粉加入1M憐酸钟缓冲液中（pH 6. 6)，100°C保溫化。同时将经过诱导 的E. coli BL21 〇)E3) /pET-28a-GP菌液离屯、收集菌体，破胞，得粗酶液。将粗酶液在85°C保 溫30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀。离屯、，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖憐酸化酶纯酶液。 加入到木馨淀粉/憐酸钟缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/1，85°C反应2地，最终G-1-P 产量为32. 95g/l，底物转化率为65. 9 %。
[0050] 实施例7 W小麦淀粉为原料催化制备G-1-P
[0051]将5%小麦淀粉加入1M憐酸钟缓冲液中（pH 6. 6)，100°C保溫化。同时将经过诱导 的E. coli BL21 〇)E3) /pET-28a-GP菌液离屯、收集菌体，破胞，得粗酶液。将粗酶液在85°C保 溫30min，使宿主菌中蛋白失活沉淀。离屯、，弃沉淀，上清即为重组葡聚糖憐酸化酶纯酶液。 加入到小麦淀粉/憐酸钟缓冲液中，重组酶的终浓度为5000U/1，85°C反应2地，最终G-1-