一种高产异戊醇的基因工程菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程技术领域，具体设及一种高产异戊醇的基因工程菌及其 构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 截止到2014年，我国能源消费总量全年相当于37. 5亿吨标准煤，位居世界第二， 但石油的储备却仅仅占有世界的2%。能源、资源和环境问题是当前人类生存和发展所面临 的=大严重挑战，也是制约我国经济、社会又好又快发展的主要瓶颈。燃料乙醇、下醇、戊醇 等醇类燃料作为液体燃料，可替代或部分替代汽油做发动机燃料，减少汽油用量，缓解化石 燃料紧张，减轻对原油进口的依赖，提高国家能源安全。
[0003] 3-甲基-1-下醇（异戊醇）作为正戊醇的一种同分异构体，其生产合成可通过化 学和生物法得到，在化学制药、溶剂、香精、有机合成等行业有着非常广泛的用途。异戊醇作 为一种用途广泛的重要有机化工原料，从世界能源需求来看，是继乙醇之后的新型液体燃 料，但其有比乙醇更适合作为燃料的特性，譬如燃烧值和辛烧值与汽油更接近、具有更高的 能量密度、低水溶性、可更高的浓度和比例与汽油混合、无需对现有车辆进行改型W及 可利用现有的运输管道运送等诸多优点。随着世界化石资源的日益匿乏、石油价格的不断 波动，下醇、戊醇等生物长链醇近年成为世界科研工作者竞相研发的热点。
[0004] 早前异戊醇的生产都是经由杂醇油蒸馈得到，一直没有形成大规模的工业化生 产。在2008年，美国加州大学Liao的研究团队在《化化re》上率先报道了通过非发酵途径 合成高级支链醇的方法。他们利用氨基酸合成的共同前体物a -酬酸为底物，在a -酬酸脱 簇酶（KDC)和醇脱氨酶（ADH)的作用下生产出比直链下醇具有更高辛烧值的支链异下醇、 3-甲基-1-下醇和2-甲基-1-下醇等生物长链醇。该研究团队通过代谢途径改造，利用亮 氨酸合成的共同前提物a-酬异已酸为底物，在2-异丙基苹果酸合酶（leuA)、异丙基苹果 酸异构酶复合体（leuC，leuD)和3-异丙基苹果酸脱氨酶（leuB)等基因的代谢调控下，通 过碳链延长，合成出了具有6~8个碳原子的长链醇。运项研究较好地利用了已经发展成 熟的氨基酸生产技术，将氨基酸生产途径与a -酬酸的脱簇和还原途径相结合来生产长链 醇类。
[0005] 在所有长链醇生产合成中，国内外异下醇的生产合成研究相对较多。目前，异下醇 等生物长链醇生产所采用的宿主菌主要有大肠杆菌巧scherichia coli，E.coli)、谷氨酸 棒杆菌（Corynebacterium glutami州m，C. glutami州m)等。利用大肠杆菌作为宿主菌，长 链醇会对其产生毒性，即使溶液中含量为1% (V/V)的异下醇，也会引起大肠杆菌细胞膜结 构的破坏，阻止糖和营养物质的转运，从而造成大肠杆菌生长的停滞。当长链醇进入膜后， 会与膜内的憐脂双分子层作用，使膜的渗透性、流动性和无序性增大，进而对微生物产生毒 害作用。而谷氨酸棒杆菌作为一种目前仍然广泛使用的氨基酸生产安全菌株，由于其具有 较厚的细胞壁，细胞壁中含有的分枝菌酸能与多糖等连接，形成包裹于细胞壁的双分子层 膜，能够限制胞壁的渗透性，从而可W耐受更高浓度的长链醇。
[0006] 经由a -酬酸的非发酵途径合成异戊醇等生物长链醇无疑为人们提供了一条长 链燃料醇生物合成的新颖思路。国外在利用大肠杆菌生产异下醇等生物长链醇方面进行 了较多的探索，但在利用谷氨酸棒杆菌为宿主菌构建高产异戊醇基因工程菌方面还鲜有报 道，国内更是缺乏相关支链醇的生物合成报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种高产异戊醇的基因工程菌及其构建方法。
[0008] 本发明利用谷氨酸棒杆菌为宿主菌，通过基因敲除异戊醇生物合成支路途径基因 和过量表达异戊醇生物合成干路基因，从而提高异戊醇的生物产量，实现本发明目的。其具 体的异戊醇生物合成路径，如图1所示。
[0009] 所述的高产异戊醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，是在谷氨酸棒杆菌中 表达a-酬异戊酸脱簇酶基因kivd和醇脱氨酶基因a化3,而获得高产异戊醇的基因工程 菌，所述的a-酬异戊酸脱簇酶基因kivd的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的醇脱 氨酶基因a化3的核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0010] 所述的a -酬异戊酸脱簇酶基因kivd优选在其起始密码子前端加有核糖体结合 位点rbs，形成含有核糖体结合位点rbs的a -酬异戊酸脱簇酶基因kivd。进一步优选，该 含有核糖体结合位点rbs的a -酬异戊酸脱簇酶基因kivd的核巧酸序列如SEQ ID NO. 3 所示。
[0011] 优选，在所述的高产异戊醇的基因工程菌，其还敲除了谷氨酸棒杆菌的丙酬酸脱 氨酶组分基因aceE和/或乳酸脱氨酶基因1化，所述的丙酬酸脱氨酶组分基因aceE的核巧 酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述的乳酸脱氨酶基因1化的序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0012] 优选，是将含有核糖体结合位点rbs的a-酬异戊酸脱簇酶基因kivd和醇脱氨酶 基因a化3分别或者串联在表达载体祀C-X脚犯上，然后转化谷氨酸棒杆菌，得到高产异戊 醇的基因工程菌。
[0013] 所述的谷氨酸棒杆菌优选为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutami州m)ATCC 13032。
[0014] rbs是核糖体结合位点，影响翻译的起始效率。翻译开始的效果是影响基因表达的 一个重要因素，核糖体结合位点的选用，不会使目的基因5'端形成"茎环"结构，从而有利 于mRNA 5'端与核糖体30S亚基的结合，促进翻译的开始；引入rbs可W增加外源基因kivd 的表达。
[0015] 本发明的第二个目的是提供本发明的高产异戊醇的基因工程菌在制备异戊醇中 的应用。
[0016] 利用本发明方法构建的高产异戊醇的基因工程菌经发酵培养12h，异戊醇的产量 可高达497111旨/1，是目前已报道的基因工程菌中合成异戊醇能力最高的基因工程菌。本发明 的基因工程菌大大提高了生物合成异戊醇的产量，有利于异戊醇的工业化生产，具有广阔 的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明的高产异戊醇的基因工程菌的异戊醇生物合成路径图。
[0018] 图2是重组载体祀C-kivd和祀C-kivd-rbs的BamHI，Sal I双酶切凝胶电泳图，其 中M代表DNA Marker DL10000,1代表重组载体祀C-kivd，2代表重组载体祀C-kivd-rbs。
[0019] 图3是表达载体祀C-kivd-rbs-a化3的模式图。
[0020] 图4是A aceE和A 1化基因的PCR产物凝胶电泳图。其中，M是DNA Marker DL2000,1 代表 A aceE，2 代表 A 1化。
[0021] 图5是重组菌株C1，巧和C6的生长曲线图。其中，圓：第一组，0 :第二组，?：第 S组，A :第四组，▲第五组。
[0022] 图6是重组菌株C4、C7和C8的发酵产物含量对比图。重组菌株C4的基因型为 祀C-kivd-rbs-a化3,重组菌株口的基因型为AaceE/pEC-kivd-rbs-a化3,重组菌株C8的 基因型为 AaceE A 1 化/pEC-kivd-rbs-a化3。
【具体实施方式】
[0023] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0024] W下对实施例所用的实验材料、试剂和方法予m兑明。
[002引 1.本发明所用引物如表1所示，所用载体如表2所示，所用菌株如表3所示。
[0026] 表1本发明所用引物列表
[0027]
[0029] 表2本发明所用载体列表
[0030]
[0033]
[0034] 2.酶类及其它生化试剂
[003引 Taq DNA聚合酶酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自trans公司。细菌基因组 DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自Tiangen公司，其它均为分析纯或者国产试剂（均可 从普通生化试剂公司购买得到）。
[003引 3.培养基
[0037] W下培养基中各物质浓度均为质量体积比，溶剂均为蒸馈水。
[0038] 乳酸乳球菌培养基为MRS培养基。MRS液体培养基：1 %酪蛋白，1 %牛肉膏， 0. 5 %酵母提取物，0. 5 %乙酸钢，0. 2 %巧樣酸二钢，0. 1 %吐溫80,0. 2 % K2HPO4,0.02 % M拆〇4.7&0,0. 005%MnS〇4.H2〇，pH 6. 8，12rC灭菌 15min。MRS 固体培养基为 MRS 液体培 养基加入2 %的琼脂粉。
[0039] 大肠杆菌和运动发酵单胞菌培养基为LB培养基。LB液体培养基：1%蛋白腺、 0.5%酵母提取物、l%化Cl，pH7.0，12^C灭菌150min。LB固体培养基为LB液体培养基 加入2 %的琼脂粉。
[0040] LBG液体培养基（谷氨酸棒杆菌种子和发酵培养基）：1%膜蛋白腺，0.5%酵母提 取物，1%氯化钢，0.5%葡萄糖，121°(：灭菌15111111。1^8〇固体培养基为1^86液体培养基加入 2 %的琼脂粉。
[0041] EP0液体培养基（谷氨酸棒杆菌感受态细胞制备）：1%膜蛋白腺，0.5%酵母提取 物，1%氯化钢，2.5%甘氨酸；0.1%吐溫80, pH7.0，12rC灭菌15min。EP0液体培养基加 入2%琼脂糖即为EP0固体培养基。
[0042] LBHIS液体培养基（谷氨酸棒杆菌重组菌制备）：0.5%膜蛋白腺，0.2