3次；
[01川 （6)用200 iil 10 %甘油重悬菌体，然后按80 iil/管分装到预冷的1.5血EP管 中；
[0112] (7)用液氮速冻感受态细胞，-70°C保存。
[0113] 4. 7重组质粒提取
[0114] 本实验采用天根生物公司的高纯度质粒提取试剂盒提取大肠杆菌质粒，操作步骤 如下：
[0115] (1)取大肠杆菌培养液于1. 5血EP管中，12000巧m离屯、Imin，弃去上清液；
[0116] (2)向EP管中加入250 重悬液P1，满旋振荡至菌体完全悬浮（加入前确认重 悬液P1中的颗粒物质完全溶解）；
[0117] (3)加入250 缓冲液P2,轻轻颠倒混匀直至菌悬液呈无色，该步骤持续时间不 超过5min;
[0118] (4)加入350 y 1缓冲液P3,迅速颠倒混匀直至出现絮状沉淀；
[0119] (5)将上一步所得的溶液和絮状沉淀1200化pm离屯、lOmin;
[0120] (6)小屯、吸取上清液到吸附柱中，12000巧m离屯、30s ;
[012。 （7)用移液枪将收集管的液体吸回至该吸附柱中，12000rpm离屯、30s，弃去收集管 中的液体，将吸附柱放回收集管中；
[0122] (8)向吸附柱中加入500 y 1缓冲液PB，12000巧m离屯、Imin，弃去收集管中的液 体，将吸附柱放回收集管中；
[0123] (9)向吸附柱中加入750 y 1缓冲液阳，12000巧m离屯、Imin，弃去收集管中的液 体，将吸附柱放回收集管中；将吸附柱1200化pm离屯、2min，弃去收集管，将吸附柱转移至干 净的1. 5血EP管中，常溫下静置2~3min;
[0124] (10)待吸附膜上残余的缓冲液阳完全挥发，滴加60 60°C预热的缓冲液邸至 吸附膜中央，常溫下静置2min后，12000巧m离屯、2min，用移液枪将EP管中的液体吸回至吸 附柱中央，重复离屯、后，弃去吸附柱，于-20 °C保存质粒DNA。
[0125] 4. 8重组菌构建
[0126] (1)热击转化构建大肠杆菌重组菌
[0127] 本实验采用北京全式金生物技术公司的E. coli Transl-Tl Phage Resistant细 胞作为克隆宿主，E.coli BL2UDE3)作为基因的表达宿主。其转化方法具体操作如下：
[0128] I、从超低溫冰箱中取出装有感受态细胞的EP管（100 y 1/管），插入冰盒中，然后 将50 y 1解冻的感受态细胞加入到连接产物中，轻弹混匀，然后冰浴20min;
[0129] II、将上述EP管置于恒溫水浴中42°C Imin，然后立即在冰上冷却2min;
[0130] III、向EP管中加入200 y 1平衡至室溫的LB液体培养基，200巧m、37°C解育比；
[0131] IV、将所有菌液涂布含有Kan的LB平板，37°C静置过夜培养。
[0132] V、用灭菌牙签挑取筛选平板上的若干单菌落，分别接种于2血含有Kan的LB液体 培养基中，37 °C、200巧m过夜培养。次日每个样本取0. 5~1 y 1菌液为模板进行PCR，反应 体系参照表4,各组分等比例缩小配置总体积为15 y 1的反应液。PCR产物进行琼脂糖凝胶 电泳，将得到的所需目的条带大小的样本进一步提取质粒酶切鉴定，酶切结果正确的样本 送测序，基本确定重组菌的构建成功。
[0133] (2)电击转化构建谷氨酸棒杆菌重组菌
[0134] 本实验采用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032作为表达菌株，构建重组菌步骤如下：
[0135] I、在冰上融化感受态细胞，添加5 y 1质粒DNA连接产物后混匀，转移至预冷的1mm 灭菌电击杯中；
[0136]II、擦干电击杯表面的水，置于电转仪中，于1. 8KV、25 y F、200 Q、1mm条件下电击 细胞；
[0137] III、电击后立即加入0. 9血预热的LBHIS液体培养基，混匀后转入1. 5血EP管， 46°C 热激 6min;
[0138]IV、在恒溫培养箱30°C、200巧m恢复培养化；
[0139] V、离屯、菌液，取200 y 1菌液涂布在含有Kan的LBHIS平板，30°C过夜培养，直至长 出菌落。
[0140] VI、用灭菌牙签挑取筛选平板上的若干单菌落，分别接种于含Kan的2血LBG液 体培养基中，30°C、200巧m过夜培养。次日将培养液1300化pm离屯、3min，弃去上清液，用 ImLd地2〇重悬菌体，然后将重悬液置于沸水浴中30min，再迅速放入-20°C。菌液反复冻融 后1300化pm离屯、5min，每个样本取1~2 y 1上清液为模板进行PCR，反应体系参照表4。 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳W鉴定转化子的真假。
[0141] 4. 9发酵及产物分析
[0142] (1)将谷氨酸棒杆菌重组菌株接种到lOmL液体LBG种子培养基中30°C、200rpm过 夜活化培养。
[0143] (2)将新鲜的种子液按体积比2 %接种量转接至20血液体LBG发酵培养基，于 30°C、200巧m摇瓶培养2-3h，ODe。。约为0. 8-1.0,加入终浓度为ImM IPTG发酵诱导，然后 30°C、200巧m下摇床培养，培养12h，取上清经0. 22um滤膜过滤后，用气相色谱仪检测发酵 产物成分。
[0144] (3)气相程序：分流比1 :50,上样量1化，柱溫60°C平衡3min，45°C保持2min， 10°C /min上升至240°C，保持2min。&流量30血/min,空气流量400血/min,尾吹流量25血/ min,加热器 240°C。
[0145] 4. 10构建谷氨酸棒杆菌基因敲除菌
[0146] (1)重叠延伸PCR敲除基因
[0147] I、引物设计：重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计，本实验用软 件prime巧.0进行设计。W敲除aceE基因为例，分别在aceE基因的上下游各找5(K)bp的 碱基，每段碱基设计一对引物，分别为n和f2、巧和f4。其中，引物n及引物f4为aceE 基因两端的特异引物，引物f2及引物巧为中间引物，而且引物f2和引物巧中含有一段不 少于lObp的互补序列。
[0148] II、利用谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，分别用引物n和引物f2、引物巧和引 物f4进行配对进行PCR。该步采用高保真P化酶。
[0149] III、分别凝胶回收第2步所得两条PCR产物aceEl、aceE2。
[0150] IV、将第3步所得两份PCR产物aceEl、aceE2进行等量混合使其互为模板，用引物 n和引物f4作为引物对，加入dNTP及Taq酶进行PCR，反应体系和反应程序如常规PCR反 应。
[0151] V、取第4步PCR产物凝胶电泳，看条带的大小是否符合设计的大小，序列中aceE 基因缺失部分中间碱基的片段即为目的条带A aceE。
[0152] (2)谷氨酸棒杆菌基因敲除重组菌的筛选及鉴定
[0153] I、将电击转化的重组子涂布于含50yg/mL Kan的LBHIS培养基平板上，于30°C培 养箱倒置培养16h。
[0154] II、挑取单菌落接种至含50 y g/mL Kan的LBG液体培养基中，于30°C、200rpm过 夜培养。
[0155] III、吸取1 y L菌液稀释于200 y L无菌水中，涂布于含10%薦糖的LBHIS培养基 平板上，于3(TC培养箱倒置培养至菌落长出。
[0156] IV、挑取单菌落，用引物n和引物f4做其引物，做菌落PCR鉴定。
[0157] 实施例1: a -酬异戊酸脱簇酶基因的克隆和表达
[015引 根据NCBI网站上乳酸乳球菌（Xactococ州S lactis subsp.)的a -酬异戊酸脱 簇酶kivd基因的序列（其序列如SEQ ID NO. 1所示）设计引物对kl，k3(产物为kivd)和 k2, k3 (产物为kivd-rbs，其序列如沈Q ID NO. 3所示）。
[0159] rbs是核糖体结合位点，影响翻译的起始效率。翻译开始的效果是影响基因表达的 一个重要因素，核糖体结合位点的选用，不会使目的基因5'端形成"茎环"结构，从而有利 于mRNA5'端与核糖体30S亚基的结合，促进翻译的开始；引入rbs可W增加外源基因kivd 的表达。
[0160] 分别将PCR扩增的产物kivd和kivd-rbs与载体pEASY - T1连接，得到pEASY -Tl-kivd 和 pEASY - Tl-kivd-rbs，热击转化进感受态细胞 E. coli TRANS1-T1 中，菌落 PCR 获得阳性克隆子，菌液测序，测序结果经比对正确，kivt kivd-rbs和酶切位点均成功扩 增。由此分别得到含有pEASY - Tl-kivd的大肠杆菌E. coli TRANS1-T1和含有pEASY -Tl-kivd-rbs的大肠杆菌E. coli TRANS1-T1。提取大肠杆菌的质粒，由此分别获得祀ASY -Tl-kivd 和 pEASY - Tl-kivd-rbs。
[0161]将表达载体祀C-X脚犯、pEASY - Tl-kivd、祀ASY - Tl-kivd-rbs 经过 BanHI 和 Sail双酶切后具有相同的粘性末端的性质，酶切后的表达载体祀C-X脚9E分别和酶切后 的祀ASY - Tl-kivd、祀ASY - Tl-kivd-rb通过DNA连接酶的连接作用，形成祀C-kivd、 祀