一种提高棉花转基因效率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及转基因领域，具体一种提高棉花转基因效率的方法。
【背景技术】
[0002]利用转基因技术将外源基因导入棉花细胞并能稳定遗传是改良棉花品质、获得新的种质的重要途径。在棉花转基因方面主要有根癌农杆菌介导法和花粉管(Pollen-TubePathway Method)导入法。自1987年Umbeck首次利用农杆菌介导法将新霉素磷酸转移酶基因nap 11和氯霉素乙酞基转移酶基因CAT转入棉花基因组成功后，以农杆菌介导的棉花遗传转化方法得到广泛的应用。关于农杆菌携带Ti质粒的遗传转化机理已经研究得比较清楚，并具有明显的优势，如能稳定地整合到宿主基因组中，拷贝数比较低，符合孟德尔遗传规律等。然而，此方法需要宿主植株经过体细胞胚胎发生和植株再生过程，在棉花转基因技术应用中受到极大的限制，因为棉花体细胞胚胎发生和植株再生受品种基因型限制很大，生产上推广应用的大多数陆地棉栽培品种很难通过此方法很快获得转化。因此，将Ti质粒的转化优点与其他转基因途径相结合不失为一种有效的途径。
[0003]花粉管通道法不受棉花品种的限制，棉花花器结构非常适合于花粉管通道技术的基因导入方式，所需设备条件少，操作简单，受到研究者和技术人员的青睐。但是利用花粉管导入法多直接导入裸露的DNA分子，最大的缺陷是转化机理不明确，转化效率低且不稳定，在经过几代的种植后存在基因丢失并且多数后代的遗传分离比例变化较大，存在着遗传分离多样性等问题。因此如何结合Ti质粒整合优势和花粉管通道法操作优势是研究者努力的目标之一。
[0004]目前，已有研究利用花粉管通道法注射含有T-边界的质粒转化，但是效率较低。研究表明利用农杆菌携带T-DNA转化后的整合效率要远远高于基因枪法转化方法的整合效率。因此，整合效率可能与T-复合物中的农杆菌毒蛋白有关。T-DNA整合过程中有很多农杆菌毒蛋白参与，其中在T-DNA穿越宿主细胞核并整合到宿主DNA起关键作用的的蛋白有VirDl、VirD2和VirE2，VirD1'￥丨也2与Ti质粒上的T-DNA边界25个碱基的重复序列结合，使其松驰，卩^队在边界序列的重复序列处切割，产生T-DNA单链并与右边界紧密共价结合，并与VirE2形成复合体。复合体在VirD 2和VirE 2核定位信号(NLS)引导下，以VirD 2为先导转运进入细胞核整合到宿主基因组中。另外也有将T-DNA整合机理结合基因枪法创建了“农杆枪法”(AgrolisTic)，将携virDl、virD2的瞬时表达载体，与携带目的基因的T-DNA载体利用基因枪打入植物细胞中。大大提高了基因转移的效率。但是基因枪法在棉花基因导入方面仍然受到植株再生问题的困扰。
【发明内容】
[0005]为解决上述问题，本发明提供了一种提高棉花转基因效率的方法，其可有效提高转基因效率明以及转基因棉花的结铃率。
[0006]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:
[0007]—种提高棉花转基因效率的方法，包括如下步骤；
[0008]S1、冰上操作，将表达纯化后的农杆菌毒蛋白VirDl、VirD2、VirE2浓度分别调整至 100 μ g/ μ I ；
[0009]S2、用限制性内切酶酶切DNA后连接到pBin438质粒上构建外源质粒DNA ；
[0010]S3、将所得外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，得外源质粒DNA的浓度为I μ g/ μ L的混合液；
[0011 ] S4、取步骤SI所得溶液中的一种或几种共2 μ I，依次加入含8 μ I外源质粒DNA的步骤S3所得的混合液，6 μ I脂质体混合后，加入30 μ I的缓冲液中，4°C放置2小时后，取出，通过花粉管通道法将目的基因导入棉花中；
[0012]其中，所述缓冲液包含5-15mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，0.4-0.6mmol/L二氨基乙烷四乙酸，5-15mmol/L氯化钠、0.015yg.μ I '-0.055 μ g.μ I1甲基磺酸乙酯。
[0013]其中，质粒DNA保护剂由氢氧化铝溶胶保护剂、磷酸钙保护剂和TWeen20保护剂按体积比1: 2: I混合所得。
[0014]其中，限制性内切酶为限制性内切酶Hind II1.+EcoR I酶。
[0015]本发明具有以下有益效果:
[0016]以脂质体包裹的外源DNA进入细胞的过程中可免受细胞内核酸酶的降解，同时由于精子进入卵细胞时，此时细胞类似于原生质的状态，脂质体包装后的外源基因更容易整合至卵细胞内部。脂质体包装对农杆菌毒蛋白的稳定性有很大的作用，避免植物组织中的某些成分对外源物质的降解。对比加入脂质体的组合之间的转化效率，发现加入VirDl、VirD2、VirE2三种农杆菌毒蛋白的组合比只加入VirDl、VirD2的组合转基因成功的比例明显提高了，从6.8%提高到9.7%，只加入VirDl、VirD2两种农杆菌毒蛋白的组合也比未加入任何农杆菌毒蛋白的组合效率高；通过限制性内切酶酶切DNA导入棉花后，后代的变异率比完整DNA导入明显提高，稳定速度快；分别采用氢氧化铝溶胶、磷酸钙和TWeen20作为外源质粒DNA保护剂，提高了转化率；在缓冲液中添加了 0.015 μ g.μ I '-0.055 μ g.μ I 1甲基磺酸乙酯，经检测，平均转化率比传统的缓冲液的平均转化率提高了两倍。
【具体实施方式】
[0017]为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0018]实施例1
[0019]S1、冰上操作，将表达纯化后的农杆菌毒蛋白VirDl、VirD2、VirE2浓度分别调整至 100 μ g/ μ I ；
[0020]S2、用限制性内切酶Hind II1.+EcoR I酶酶切DNA后连接到pBin438质粒上构建外源质粒DNA ；
[0021]S3、将所得外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，得外源质粒DNA的浓度为I μ g/ μ L的混合液；质粒DNA保护剂由氢氧化铝溶胶保护剂、磷酸钙保护剂和TWeen20保护剂按体积比1:2:I混合所得；
[0022]S4、取步骤SI所得溶液中的一种或几种共2 μ I，依次加入含8 μ I外源质粒DNA的步骤S3所得的混合液，6 μ I脂质体混合后，加入30 μ I的缓冲液中，4°C放置2小时后，取出，通过花粉管通道法将目的基因导入棉花中；所述缓冲液包含5mmol/L三羟甲基氨基甲烧-盐酸，0.4mmol/L 二氨基乙烧四乙酸，5mmol/L氯化钠、0.015 μ g.μ I 1甲基磺酸乙酯。
[0023]实施例2
[0024]S1、冰上操作，将表达纯化后的农杆菌毒蛋白VirDl、VirD2、VirE2浓度分别调整至 100 μ g/ μ I ；
[0025]S2、用限制性内切酶Hind II1.+EcoR I酶酶切DNA后连接到pBin438质粒上构建外源质粒DNA ；
[0026]S3、将所得外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，得外源质粒DNA的浓度为I μ g/ μ L的混合液；质粒DNA保护剂由氢氧化铝溶胶保护剂、磷酸钙保护剂和TWeen20保护剂按体积比1:2:I混合所得；
[0027]S4、取步骤SI所得溶液中的一种或几种共2 μ I，依次加入含8 μ I外源质粒DNA的步骤S3所得的混合液，6 μ I脂质体混合后，加入30 μ I的缓冲液中，4°C放置2小时后，取出，通过花粉管通道法将目的基因导入棉花中；所述缓冲液包含15mmol/L三羟甲基氨基甲烧-盐酸，0.6mmol/L 二氨基乙烧四乙酸，15mmol/L氯化钠、0.055 μ g.μ I 1甲基磺酸乙酯。
[0028]实施例3
[0029]S1、冰上操作，将表达纯化后的农杆菌毒蛋白VirDl、VirD2、VirE2浓度分别调整至 100 μ g/ μ I ；
[0030]S2、用限制性内切酶Hind II1.+EcoR I酶酶切DNA后连接到pBin438质粒上构建外源质粒DNA ；
[0031]S3、将所得外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，得外源质粒DNA的浓度为I μ g/ μ L的混合液；质粒DNA保护剂由氢氧化铝溶胶保护剂、磷酸钙保护剂和TWeen20保护剂按体积比1:2:I混合所得；
[0032]S4、取步骤SI所得溶液中的一种或几种共2 μ I，依次加入含8 μ I外源质粒DNA的步骤S3所得的混合液，6 μ I脂质体混合后，加入30 μ I的缓冲液中，4°C放置2小时后，取出，通过花粉管通道法将目的基因导入棉花中；所述缓冲液包含lOmmol/L三羟甲基氨基甲烧-盐酸，0.5mmol/L 二氨基乙烧四乙酸，10mmol/L氯化钠、0.035 μ g.μ I 1甲基磺酸乙酯。
[0033]经过脂质体包装的组合之间比较，加入农杆菌毒蛋白的转基因效率明显提高了很多，加毒理蛋白的两种组合比不加毒蛋白的组合分别提高了 5.4%和8.3%,以脂质体包裹的外源DNA进入细胞的过程中可免受细胞内核酸酶的降解，同时由于精子进入卵细胞时，此时细胞类似于原生质的状态，脂质体包装后的外源基因更容易整合至卵细胞内部。脂质体包装对农杆菌毒蛋白的稳定性有很大的作用，避免植物组织中的某些成分对外源物质的降解。对比加入脂质体的组合之间的转化效率，发现加入VirDl、VirD2、VirE2三种农杆菌毒蛋白的组合比只加入VirDl、VirD2的组合转基因成功的比例明显提高了，从6.8%提高到9.7%，只加入VirDl、VirD2两种农杆菌毒蛋白的组合也比未加入任何农杆菌毒蛋白的组合效率高；分别采用氢氧化铝溶胶、磷酸钙和TWeen20作为外源质粒DNA保护剂，提高了转化率；在缓冲液中添加了 0.015 μ g.μ I '-0.055 μ g.μ I 1甲基磺酸乙酯，经检测，平均转化率比传统的缓冲液的平均转化率提高了两倍。
[0034]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，包括如下步骤； 51、冰上操作，将表达纯化后的农杆菌毒蛋白VirDl、VirD2、VirE2浓度分别调整至100 μ g/ μ I ； 52、用限制性内切酶酶切DNA后连接到pBin438质粒上构建外源质粒DNA; 53、将所得外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，得外源质粒DNA的浓度为Iμ g/ μ L的混合液； 54、取步骤SI所得溶液中的一种或几种共2μ 1，依次加入含8 μ I外源质粒DNA的步骤S3所得的混合液，6 μ I脂质体混合后，加入30 μ I的缓冲液中，4°C放置2小时后，取出，通过花粉管通道法将目的基因导入棉花中。2.根据权利要求1所述的一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，所述缓冲液包含5-15mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，0.4-0.6mmol/L 二氨基乙烷四乙酸，5-15mmol/L氯化钠、0.015 μ g.μ I ^0.055 μ g.μ I 1甲基磺酸乙酯。3.根据权利要求1所述的一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，质粒DNA保护剂由氢氧化铝溶胶保护剂、磷酸钙保护剂和TWeen20保护剂按体积比1: 2: I混合所得。4.根据权利要求1所述的一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，限制性内切酶为限制性内切酶Hind II1.+EcoR I酶。
【专利摘要】本发明公开了一种提高棉花转基因效率的方法，用限制性内切酶酶切DNA与质粒DNA保护剂混合后，利用脂质体包装携带Ti质粒上的毒蛋白基因通过花粉管通道法将目的基因导入棉花中。本发明可以有效提高转基因效率。
【IPC分类】C12N15/82
【公开号】CN105002209
【申请号】CN201510519959
【发明人】刘红玲, 祝建波, 朱华国, 孙燕飞, 邱红林, 王彦芹
【申请人】石河子大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年8月15日