通过端粒截短的植物人工染色体平台的制作方法
【专利说明】通过端粒截短的植物人工染色体平台
[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请日为2007年5月9日，申请号为200780025280. X(PCT/US2007/068589)，发明名称为"通过端粒截短的植物人工染色体平台"。
[0002] 发巧背景
[0003] 本申请要求2006年5月9日申请的美国临时专利申请顺序号60/798, 830和2006 年10月24日申请的美国临时专利申请顺序号60/862, 733的优先权，所述专利申请的全部 公开内容都通过引用特别结合到本文中。
[0004] 1.发明领域
[0005] 本发明设及分子生物学和植物遗传学领域。更准确地讲，本发明设及植物人工微 染色体平台及其生产和使用方法。
[0006] 2.相关领域的描述
[0007] 生物中染色体的维持和遗传通常需要=个必需元件：复制起点、着丝粒和端粒，如 之前用酵母人工染色体所鉴定的一样。例如，Murray和Szostak(1983)描述了基于体外构 建的线性酵母人工染色体的克隆系统。然而，在多细胞真核系统中，已鉴定出的核酸元件中 没有一个能够维持人工染色体。
[0008] 产生人工染色体的一种方法是通过从头构建，即将着丝粒、端粒和选择标记组装 起来并且重新导入植物中（美国专利第7, 015, 372号）。然而，已知对于通过减数分裂的有 效传递，染色体具有最小尺寸限制（Schubert, 2001)。虽然大多数从头构建的哺乳动物微 染色体可W在有丝分裂期间传递，但是还没有运类微染色体在种系中传递的报道。迄今为 止，真核生物中仅通过减数分裂传递的从头构建的人工染色体是酵母人工染色体（Murray 和Szostak，1983 ;Mu;rray和Szostak，1986)。另外，研究表明对于正常传递而言，植物着丝 粒大小必须超过大约1兆碱基化aszas和Birchler，1998)，运个大小超过了目前可W体外 组装的大小。
[0009] 相比之下，一些具有天然着丝粒的截短的染色体可通过减数分裂传递（化inohara 等，2000 ;Tomizuka 等，1997, 2000 ;Voet 等，2001;化en 等，1997,2000 ;Schube;rt，2001; Zheng 等，1999 ;Kato 等，2005 ;McClintock，1938 ;&rock 和 Pryor, 1996 ;化suda 等，2005)。 已应用于哺乳动物系统的截短染色体的一种方法是端粒介导的截短（telomere mediated truncation) (Farr 等，1991，1992,1995 ;Ba;rnett 等，1993 ;Itzhaki 等，1992 ;Heller 等， 1996 ;Mi 11s等，1999 ;Saffe巧等，2001)。然而，迄今为止还没有研究披露用于植物染色体 端粒介导的截短的方法。
[0010] 染色体缺失的其它方法已应用于植物系统。例如，通过X射线或丫射线照射玉米 花粉（McClintock，1938巧rock和Pryor, 1996)或通过B-9与复制9S的易位狂heng等， 1999 ;Kato等，2005)所产生的玉米染色体发生了改变。然而，通过运些方法产生的染色体 改变在减数分裂或有丝分裂期间缺乏稳定传递，无法携带位点专一重组位点，不能使异源 序列进行有效的表达，或者染色体改变难W产生。因此，本领域非常需要用于植物微染色体 的产生和使用方法。
[0011] 发巧概沐
[0012] 本发明通过提供可经有丝分裂和减数分裂有效传递的植物微染色体，从而克服了 本领域的局限性。术语"微染色体（minic虹omosome)"是指通过缺失部分天然染色体而制 备的工程染色体。因此，微染色体与通过重组DNA技术从头制备的人工染色体截然不同。在 具体实施方案中，本发明提供本文所述的植物微染色体，所述植物微染色体通过插入端粒 重复序列使起始天然植物染色体截短而获得。因此，本发明的植物微染色体可W限定为包 含至少一个被截短的染色体臂。在一些其它的实施方案中，植物微染色体的两个臂均被截 短。在一些方面，植物微染色体可在植物有丝分裂和减数分裂期间有效传递，所述植物与起 始染色体（starting C虹omosome)的植物品种相同。本领域技术人员应当了解的是，运类 微染色体通常包含功能性着丝粒和复制起点，运两者可供如实保持。
[0013] 在本发明的一个方面，植物微染色体包含天然着丝粒。天然着丝粒存在于内源染 色体中，并由着丝粒重复序列组成（Jiang等，2003)。运些序列在细胞分裂（例如有丝分裂 和减数分裂）期间供染色体有效分离。因此，在本发明某些方面，植物微染色体限定为包含 天然植物着丝粒序列。在其它实施方案中，本发明的微染色体可限定为不包含新着丝粒。
[0014] 微染色体还可包含工程端粒序列（engineered telomere sequence)。本文所用 术语"工程端粒序列"是指比起存在于天然染色体的端粒序列有所不同的端粒序列。例如， 工程端粒序列位于相对于着丝粒的位置可不同于存在于天然染色体的端粒的位置。具体 地讲，与天然端粒相比，本发明微染色体上的工程端粒序列可能更接近微染色体的着丝粒。 例如，在本发明的植物微染色体中，工程端粒序列可限定为距天然染色体序列的着丝粒约 10化至约10Mb。在更具体的实施方案中，工程端粒可距天然染色体序列的着丝粒约10化 至约5Mb或者约100化至约1Mb、2Mb、3Mb、4Mb或5Mb。本发明的植物微染色体还可包含两 个工程端粒序列，它们距微染色体着丝粒的距离可W不同。
[0015] 工程端粒序列可得自多种来源。例如，工程端粒序列可得自与天然染色体序列相 同的植物种或品种，或者得自相对于天然染色体序列是不同的植物种。例如，端粒序列可 W是由pAtT4克隆的端粒序列，所述pAtT4包含拟南芥型（Ar油idopsis-type)端粒基序 TTTAGGG(SEQ ID N0:1)的同向重复序列或其衍生物巧ichards和Ausubel，1988)。在运 种情况下，每个重复序列包含端粒序列的430个碱基对。工程端粒重复序列可得自玉米、小 麦、燕麦、水稻、拟南芥或大豆。本领域技术人员应当了解的是，工程端粒可包含多个端粒重 复序列。例如，在某些实施方案中，本发明的工程端粒可包含介于2个和100个之间、2个 和50个之间或者2个和10个之间的重复序列，包括6个重复序列。在本发明一些实施方 案中，提供端粒截短载体（telomere truncation vector)上的端粒序列，例如本文所示端 粒截短载体（例如pWY76、pWY86和PJV21)。在本发明一个实施方案中，可采用端粒截短载 体来产生截短的微染色体。端粒截短载体可包含在微染色体中，或者可从中分离出来。在 本发明一个实施方案中，在产生微染色体期间端粒截短载体可缺失。例如，转基因然后可被 导入微染色体中W产生包含一个或多个添加转基因的微染色体。通过运种方法形成的微染 色体构成本发明的一个实施方案。
[0016] 植物微染色体的一个方面是它们的大小。本文所述的微染色体优选编码最低数 目的可对包含微染色体的植物表型产生有害影响的内源基因。因此，优选制备缺失了大部 分内源染色体，而同时又保持足够大小W稳定传递的微染色体。当天然染色体是A染色体 时，运一点可能非常重要。B染色体通常不编码必需功能，因此不太可能产生有害表型。然 而，还是观察到微染色体太小w致于不能经有丝分裂和减数分裂如实保持下来。因此，在本 发明的某些实施方案中，植物微染色体包含天然植物染色体序列，其中约1%至约99. 9% 的天然染色体序列缺失。在一些实施方案中，微染色体中约10 %、20 %、25 %、35 %、50 %、 75%、85%、90%、93%、95%、97%、99%、99. 5%或99. 9%或从其中可派生的任何范围的天 然染色体序列缺失。
[0017] 在本发明的某些其它方面，植物微染色体可根据其大小来限定。例如，植物微染色 体大小可限定为约0. 1Mb至约20Mb或30Mb。在其它的实施方案中，植物微染色体大小可为 约 lMb、l. 5Mb、2Mb、2. 5Mb、3Mb、4Mb、5Mb、7. 0Mb、9Mb、10Mb、20Mb、50Mb 或 100Mb 或者其中可 派生的任何范围。例如，在某些情况下，本文所述的植物微染色体大小介于约1Mb和10Mb 之间，或者介于约5Mb和10Mb之间。
[0018] 在本发明的某些方面，植物微染色体可限定为通过有丝分裂W 100%频率进行传 递。在更多情况下，植物染色体通过其在减数分裂期间传递的频率来限定。例如，植物微染 色体在减数分裂期间可按大于约10%、20%、25%或30%的频率进行传递（50%为理想的 传递）。因此，本发明的植物染色体可包含截短的A染色体或B染色体，当微染色体在与起 始染色体品种相同的植物中传递时，所述截短的A染色体或B染色体在减数分裂期间传递 的频率大于35%。
[0019] 可W使用多种植物来制备本发明的植物微染色体。在一些实施方案中，该植物可 限定为双子叶植物或单子叶植物。例如，植物可为首猜、磨擦禾属（Tripsacum)、玉米、油菜 (canola)、水稻、大豆、烟草、草坪草、燕麦、黑麦、拟南芥或小麦。在本发明的某些方面，微染 色体可限定为得自玉米植物。
[0020] 在其它实施方案中，本发明的植物微染色体可得自植物A染色体。例如，微染色体 可包含得自A染色体的天然染色体序列，例如在玉米微染色体的情况下，它可包含得自玉 米1、2、3、4、5、6、7、8、9或10号染色体的天然序列。在一个实施方案中，本发明的植物微染 色体得自玉米7号染色体。
[0021] 在又一些实施方案中，本发明的植物微染色体包含植物B染色体的天然染色体序 列。对于某些应用，端粒截短的B染色体可提供益处，因为它们包含非必需基因，预期运些 非必需基因不会干扰植物表型或者不会干扰染色体的转基因的表达。本文所述的端粒截 短方法导致从B染色体中缺失天然染色体序列，特别是远离着丝粒的区。通过端粒截短来 缺失控制不分离的B染色体区，从而基于B染色体的微染色体将正常分离。实际上，可W 按照本文所述方法，利用任何类型的植物B染色体来制备植物微染色体。例如，植物微染色 体可包含天然B染色体序列，运些B染色体序列得自玉米、黑麦或高梁，或者得自具有B染 色体的任何其它植物品种，或者得自包含已导入B染色体的任何植物品种（Jones和Rees， 1982)。在一些实施方案中，染色体的截短在包含多个B染色体的植物细胞中进行，例如包 含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个或更多个B染色体拷贝的细胞。
[0022] 在本发明的某些方面，可优选缺乏B染色体的含微染色体植物，因为完整B染色体 的存在可能引起B染色体衍生的微染色体不分离。因此，在一些实施方案中，本发明提供通 过导入完整B染色体或部分B染色体来操纵包含B染色体序列的植物微染色体的含量的方 法。例如，可通过导入调控B着丝粒不分离的B染色体序列来调节植物微染色体的含量。
[0023] 本发明的植物微染色体可包含选择标记，该选择标记为携带标记的植物细胞在特 定生长条件下提供生长优势，从而能够鉴定包含微染色体的植物、植物细胞或植物部分。选 择标记可在细菌细胞中起作用。微染色体还可包含提供抗生素、除草剂或其它药剂敏感性 的"阴性"选择标记，从而能够对包含特定微染色体的植物、植物细胞或任何其它目标生物 的细胞进行选择。此外，在某些方面，植物微染色体可包含雄性育性恢复基因，例如R巧基 因。
[0024]植物微染色体还可包含位点专一重组序列。例如，本发明的微染色体可包含lox 或FRT位点。位点专一重组为基因移进移出人工染色体（例如本发明的植物微染色体）提 供了简便的方法。还可W运个方式提供随机诱变。应用位点专一重组W体内介导基因转移 的方法是本领域众所周知的。可W应用位点专一重组将基因序贯添加到微染色体上，W便 提供用于完整生化途径或一套农艺优良性状的基因。在本发明的某些方面，被插入起始植 物染色体的端粒序列包含位点专一重组序列。在运个方面，可W快速产生包含位点专一重 组序列的植物微染色体。
[00巧]在某些其它实施方案中，植物微染色体可包含控制细胞内微染色体拷贝数的基 因。运种基因的一个实例是介导上述不分离的B染色体的元件。一个或多个结构基因也可 包含在微染色体内。尤其预期有用的是与可插入微染色体内的基因一样多的且同时又保持 功能和如实传递人工染色体的结构基因。运可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个结构基 因。
[0026] 在另一个实施方案中，本发明提供用于在植物、植物细胞或任何其它目标生物的 细胞中表达一个或多个外源基因的方法。外源基因可得自任何生物，包括植物、动物和细 菌。在一个实施方案中，外源基因赋予指定植物改进的农艺性状。例如，转基因可赋予抗虫 性（insect resistance)、除草剂耐受性、糖代谢改变、脂肪酸代谢改变、抗病性和有害物抗 性（pest resistance)等性状。本发明还包括可使用微染色体同时转移多个外源基因到包 含完整生化或调节途径的植物中。在又一个实施方案中，本发明包括可用作DNA克隆载体 的植物微染色体。运种载体可用于植物和动物测序计划。在一些具体情况下，转基因可随 端粒重复序列一起导入起始染色体，从而产生包含转基因的植物微染色体。
[0027] 在又一个实施方案中，提供包含植物微染色体的植物细胞。该植物细胞的品种可 与起始植物染色体的品种相同，然而在某些情况下，可W是不同品种。因此，包含植物微染 色体的植物或植物种子也构成本发明的组成部分。在某些方面，包含微染色体的植物是玉 米植物。
[0028] -般而言，本发明的方法和组合物包括端粒介导的染色体截短（物）。例如，包含 植物端粒的载体被导入植物细胞中。运类载体可通过本领域众所周知的方法导入植物细胞 中，例如DNA轰击或±壤杆菌（Agrobacterium)介导的转化。例如，在某些实施方案中，可 应用±壤杆菌介导的转化产生由A染色体衍生的植物微染色体。相反地，在一些情况下，可 应用DNA轰击产生由B染色体衍生的植物微染色体。在将端粒序列整合到植物染色体的一 个或多个位置上后，可在整合点将染色体截短。因此，本发明的方法可包括用包含至少两个 端粒重复序列的异源核酸转化起始植物染色体，并使起始植物染色体截短W便产生植物微 染色体。可通过端粒整合来截短染色体的一个或两个臂。然后，可通过例如DNA印迹法或 FISH,对所得植物微染色体进行筛选W确定其大小和来源。
[0029] 在本发明的另一些方法中，起始植物染色体用包含端粒重复序列和额外序列（例 如位点专一重组序列、转基因或其它选定序列）的异源核酸序列转化。或者，起始植物染色 体可用包含端粒重复序列的异源核酸序列转化W产生植物微染色体。随后，植物微染色体 可用包含额外序列（例如转基因）的第二异源核酸序列转化。例如，额外序列可包含FRT 或lox位点。在一些情况下，额外序列还可包含赋予抗虫性、除草剂耐受性、糖代谢改变、月旨 肪酸代谢改变、抗病性、雄性育性恢复或有害物抗性的基因。因此，在某些实施方案中，额外 基因可W是雄性育性恢复基因，例如Rf3基因。本发明运个方面可能特别有利，因为恢复雄 性育性的植物微染色体可W非常高效地传递到子代细胞。
[0030] 至于本文所述任何其它方法或组合物，都可采用本发明运个方法和/或组合物方 面论述的实施方案。因此，有关一种方法或组合物的实施方案同样可应用于本发明的其它 方法和组合物。
[0031] 本文所用的术语前未加数词修饰时包括其复数形式。正如本文所附权利要求书一 样，当与术语"包含"联用时，术语前未加数词修饰时可指一个或一个W上。
[0032] 权利要求书中使用的术语"或"是用来指"和/或"，除非明确说明仅指二者之一， 或者二者相互排斥，虽然本公开内容支持仅指二者之一和"和/或"的定义。本文所用"其 它"可指至少两种或W上。
[0033] 本申请全文中，术语"约"用来指包括仪器误差、测定数值所采用方法的固有偏差， 或研究对象中存在的偏差。
[0034] 本发明的其它目的、特征和优势从W下详述来看将是显而易见的。然而，应当了解 的是，表示本发明优选实施方案的发明详述和具体实施例只是通过实例的方式给出，因为 从本发明详述来看，本发明精神和范围内的各种改动