用于载体表达的复合多联gRNA和RNAi的表达框架的制作方法_2

文档序号:9284954阅读:来源:国知局
以根据目的要求,灵活组合,在单一的启动子和终止子结构中,应 用一个或者多个gRNA和一个或者多个RNAi来达到对靶基因多位点(如多个DNA位点)和 多层次(DNA水平和RNA水平)的同步编辑修饰功能(gRNA/CRISPR的基因敲除(knockout) 修饰和RNAi的mRNA表达抑制(knockdown)的作用)。本发明的复合表达框架位于一个整 体中,可用于对真核细胞的多部位基因敲除和基因表达抑制的应用,如基因治疗、转基因动 物、单一或者多个基因的同步修饰等。一个载体可以同时表达多个gRNA/RNAi,解决了现有 单一启动子和转录终止子表达系统内只能构建一个gRNA的问题,及其导致的多个载体共 转染的复杂操作需求。
[0034] 具体地,本发明具有如下有益效果:
[0035]1、本发明中的复合多联表达框架只需一个启动子和一个终止子的可同时表达一 个或者一个以上的gRNA,一个或者一个以上RNAi的多联复合表达框架。
[0036] 2、在本发明中的复合多联表达框架中,间隔序列的切割由真核细胞内的自然存在 的Drosha及其复合酶系统完成,shRNA的成熟由细胞内自然存在的Dicer及其复合酶系统 来完成。因此,无需增加额外的外源酶来完成。
[0037] 3、本发明实现同一个载体拥有gRNA对DNA的编辑和RNAi对RNA的编辑的双层次 核酸编辑功能。
[0038]4、含有本发明中的复合多联表达框架的表达系统在一个CRISPR/Cas载体中完 成,无需额外辅助载体,无需辅助载体的共转染,实现真正意义上的多个RNA编辑工具在同 一载体的同步表达。
[0039] 5、本发明的表达框架可以被用于各种哺乳动物质粒载体中,包括病毒载体(逆转 录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒)和非病毒载体。
[0040] 下面结合附图对本发明进行更详细的说明。从下文的详细描述中,本发明的上述 方面和本发明的其他方面将是明显的。
【附图说明】
[0041] 图1为根据本发明的表达框架的示意图。其中,图Ia为根据本发明的表达框架1 的示意图,图Ib为根据本发明的表达框架2的示意图。
[0042] 图2为构建p458M载体的序列不意图。
[0043] 图3为示出HBV特异的gRNA2-miR-HBV-gRNA3复合表达体的原理和序列的图。
[0044] 图 4 为评价p458M-gRNA2-miR-HBV-gRNA3 产生gRNA2、gRNA3 和miR-HBV的能力的 图。
[0045] 图5为评价gRNA-miR-HBV-gRNA表达复合体对HBV复制水平的抑制作用的图。
[0046]图 6 为评价gRNA3-miR-HBV-gRNA2 和gRNA4-miR-HBV-gRNAl表达复合体HBVDNA 的剪切作用的图。
[0047]图 7 为评价gRNA3-miR-HBV-gRNA2 和gRNA4-miR-HBV-gRNAl表达复合体HBV cccDNA的剪切作用的图。
【具体实施方式】
[0048] 除非特别说明,本发明的术语具有本领域通常使用的含义。
[0049] 在本发明中,"转录"是指由DNA模板产生RNA的过程。
[0050] 在本发明中,"核酸"表示单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合 物,除非另有限定,包括以类似于天然存在核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的类似 物。除非另外指明,特定核酸序列包括其互补序列。
[0051] 在本发明中,"表达框架"是指与允许细胞中特定核酸转录的核酸元件重组或合成 形成的核酸结构。表达框架可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常地,表达框架包括 要转录的核酸,可操作的连接启动子、终止子。在一些实施方式中,表达框架还可包括复制 起点和/或染色体整合元件(例如逆转录病毒LTR)。
[0052] 在本发明中,"间隙序列"表示在核酸表达控制序列(例如gRNA、RNAi)之间的功 能性连接。
[0053] 在本发明中,"以交替串联的方式"是指gRNA和RNAi交替排列。其中,也包括一个 gRNA与一个RNAi的串联方式。具体地,在本发明的一个实施例中,采用"启动子-gRNAl-间 隔序列I-RNAil-间隔序列2-gRNA2-终止子"的交替串联方式;在本发明的另一个实施例 中,采用"启动子-(gRNAl-间隔序列I-RNAil-间隔序列2)n-gRNA(n+l)_终止子,其中n为 大于1的整数"的交替串联方式。
[0054] 在本发明中,"启动子"是指一组DNA控制序列,其参与了RNA聚合酶的结合以启动 核酸转录。如此处所用的,启动子包括接近转录启动位点的必需核酸序列。启动子还任选 地包括远侧增强子或阻遏子元件,其可位于离转录启动位点长达几千个碱基对之处。
[0055] 在本发明中,"PolII启动子"是包括可被RNA聚合酶II识别以便由该酶启动转录 的元件。PolII启动子通常包括特征元件,如TATA盒。
[0056] 在本发明中,"PolIII启动子"是包括可被RNA聚合酶III识别以便由该酶启动转 录的元件。
[0057] 在本发明中,"终止子"是终止转录的DNA序列。这些元件对于RNA聚合酶II和 RNA聚合酶III是不同的。
[0058] 在本发明中,"导向RNA(gRNA) "是指能够指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA 序列,从而起到基因编辑的作用的一种小型非编码RNA。
[0059] 在本发明中,"RNAi"是指引起互补RNA的序列特异性降解、序列特异性翻译抑制 或转录基因沉默的双链核酸(包括microRNA、siRNA、shRNA)。
[0060] 在本发明中,"Pri-miR"通常是来自于PolII转录的初级miR转录物。这些序列 可源于独立miR转录单位,转录物包括大于一个的miR前体或内含miR前体。这些序列通 常被细胞核内的Drosha加工以产生pre-miR。
[0061] 在本发明中,"Pre-miR"是由Drosha加工pri-miR的产物。pre-miRs通常是 60-80nt的长度。pre-miRs是由输出蛋白-5从细胞核输出的。在细胞质中,pre-miRs由 Dicer加工以形成成熟miR。
[0062] 在本发明中,"miR"是大约22nt长度的小RNA分子,其来自于pri-miR和之后的 pre-miR序列的加工。
[0063] 在本发明中,"短发夹RNA(shRNA) "是由自身回叠以使来自两个分离片段的核 苷酸形成碱基对的短序列单链RNA,得到的结构形如其名。shRNA是Dicer的底物并实现 RNAi(发夹的双链结构区可包含碱基错配即非AU或GC对)。
[0064] 在本发明中,"小干扰RNA(siRNA) "是由短双链RNA分子组成。siRNA分子通常含 有在3'端具有2nt的突出的19bp双螺旋区。一条链被并入细胞质RNA诱导的沉默复合物 (RISC)。这指导由RISC实现的序列特异性RNA切除。siRNA指导和其靶点之间的错配可引 起翻译抑制以取代RNA切除。siRNA可被合成或来自于Dicer对前体的加工。
[0065] 在本发明中,"感染性疾病"是指对其宿主有害的因子(如病毒、真菌或细菌)。在 某些实施方式中是指对人有害的因子。感染性疾病的例子包括而不限于HIV、HBV、西尼罗河 病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、天花、12结核、水泡性口炎病毒(VSV)、呼吸道合胞 体病毒(RSV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、SARS、流感、埃博拉病毒、病毒性脑膜炎、疱疹、炭疽、 莱姆病以及大肠杆菌等。
[0066] 本发明中,"非感染性疾病"是非由感染引起的与健康或正常生物学活性不同的情 况。感染性疾病的例子包括而不限于癌症等。
[0067] 在本发明中,"真核表达载体"可以是任何适当的真核表达载体,并且可以用于转 化或转染任何适当的宿主细胞。
[0068] 下面结合具体实施例,对本发明作进一步的阐述说明。应理解,这些实施例仅用于 说明本发明而不在于限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常 规方法;所用的材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂公司购买得到的。
[0069] 实施例1.表达框架的构建
[0070] 先合成分段的寡核苷酸,然后依次将特定片段插入载体,分步连接构建表达框架, 具体参见下文说明。
[0071] 如图Ia所示的表达框架1的构建,在本实施例中,间隔序列为pri-miRNA序列中 pre-miRNA的侧翼序列或类似序列。
[0072] 1.构建启动子一gRNAl-间隔序列I-RNAil-间隔序列2-gRNA2-终止子表达框架
[0073] 1)采用快速突变方法在p458 (pSpCas9 (BB) -2A-GFP)载体中插入XhoI和HindIII 酶切位点,并将polyT序列去掉,构建成p458M载体,其具体位置如图2所示。
[0074] 2)合成寡核苷酸,并依次进行变性、退火和连接,将gRNAl装入改造后的经BbsI酶 切的P458M载体中,以形成p458M-gRNAl载体。
[0075] 寡核酸序列如下:
[0076] gRN
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