一种冠突散囊菌富硒菌株及驯化和发酵方法与流程

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种冠突散囊菌富硒菌株及驯化和发酵方法。

背景技术：

硒元素是人类和动物体必须的微量元素之一，可以保护细胞膜并使之发挥重要功能，增强机体免疫力。缺硒可大大降低机体的抗氧化能力，并导致多种疾病，如克山病，大骨节病，心脏病及肿瘤等。我国人口中缺硒形式严峻，超过20个省市自治区直辖市有缺乏硒的情况。生物体一般以无机盐的形式摄取微量元素，这种方法转化率低，对机体刺激性大。

本发明筛选到一株能高效转化无机硒为有机硒的真菌---冠突散囊菌富硒菌株，可以将无机态的硒元素转化成有机态的硒元素，利于机体吸收转化，降低无机态硒元素对人体的毒副作用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种冠突散囊菌富硒菌株。该菌株来源于茯茶，生态安全，无害，能耐受无机硒，并能将无机硒高效转化为有机硒，可作为一株高效转化无机硒为有机硒的生产菌株，满足工业化生产需求。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种冠突散囊菌富硒菌株，其特征在于，所述冠突散囊菌富硒菌株为eurotiumcristatumxd-01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15395。保藏日期：2018年4月2日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

另外，本发明还提供了一种筛选冠突散囊菌富硒野生菌株的方法，其特征在于，该方法包括：从市售泾渭茯茶中称取10g带有亮黄色闭囊壳的茯砖茶，碾碎后加入90ml无菌水振荡混匀；取振荡混匀后的混合物用无菌水做10倍梯度稀释，分别选取10^-3和10^-4两个梯度的稀释液涂布于含有10mg/l硒元素的pda固体培养基上，30℃静置培养60h；挑取菌落较大而且颜色呈亮黄色的菌落划线于含有10mg/l硒元素的pda平板继续筛选8～10代，于pda斜面培养基4℃保存备用，得到冠突散囊菌富硒野生菌株。

进一步地，本发明提供了一种驯化上述方法筛选的冠突散囊菌富硒野生菌株的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求2保存备用的野生菌株的菌苔用生理盐水重悬，得到浓度为2×10⁶～2×10⁸个孢子/ml的重悬液，对重悬液进行紫外诱变，将紫外诱变后的重悬液分别接入含有无机硒0mg/l、5mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l和25mg/l的pda固体平板培养基上，涂布均匀，30℃培养60h；挑取菌落较大而且颜色光亮的菌落划线于含有10mg/l无机硒的pda固体平板，比较不同菌株的生长情况；选取菌落最大且颜色最亮黄的菌落为出发菌株，分离纯化8～10代，4℃斜面保存，得到权利要求1所述冠突散囊菌富硒菌株。

更进一步地，本发明提供了一种上述冠突散囊菌富硒菌株的发酵方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述冠突散囊菌富硒菌株的菌苔用生理盐水重悬，得到浓度为2×10⁶～2×10⁸个孢子/ml的重悬液，将所述重悬液接种至液体种子培养基中，150rpm，30℃振荡培养72h；以5％的接种比例接入发酵培养基中，150rpm，30℃振荡培养72h。

上述的发酵方法，其特征在于，所述液体种子培养基和发酵培养基的组成均包括：15g/l葡萄糖，2g/l硫酸镁，5g/l玉米干粉，5g/l硫酸铵，2g/l磷酸二氢钾，10mg/l硒元素。

本发明的冠突散囊菌富硒菌株具有如下的性质：

形态特征：将本发明的冠突散囊菌富硒菌株接种于pda固体平板上，28℃培养24h就可看到白色绒状菌落，48h菌落直径可达15mm，菌落中心位置菌丝开始变黄。72h整个菌落呈亮黄色，直径可达45～50mm。继续培养至144h菌落中央部位有黑褐色渗出液，整个菌落呈褐色，培养基背面也有褐色色素存在，菌落直径50～55mm。将其接种至察氏培养基中菌落形态同pda平板中基本相同，但生长较慢，最终菌落直径也小，为35～40mm。

生理生化特征：本菌株好气性强，耐剪切性差，搅拌转速超过300rpm时菌丝易断裂，生长变慢。生长的ph范围3.0～6.0，最适ph为5.0。最高生长温度38℃，最适生长温度28℃。该菌株可以利用多种碳源，但最佳碳源为葡萄糖；可以利用多种氮源，无机氮源较差，有机氮源中以玉米浆为最佳。本菌株耐受无机硒能力较强，转化无机硒到有机硒的能力更强，菌丝中有机硒可达690mg/kg。

该菌株经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定(鉴定采用fmic-qo01-003真菌多相鉴定检测方法；qo-03-02微生物菌种分子生物学鉴定操作规程)，确定为：冠突散囊菌(eurotiumcristatum)。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明的冠突散囊菌富硒菌株来源于茯茶，生态安全，无害。

2、本发明将冠突散囊菌富硒野生菌株经紫外诱变和无机硒驯化培养，筛选出的冠突散囊菌富硒菌株能耐受无机硒，能将无机硒高效转化为有机硒。

3、本发明通过对发酵培养基进行优化，冠突散囊菌富硒菌株能于优化后的培养基上耐受无机硒，并能将无机硒高效转化为有机硒，胞内有机硒含量高达690mg/kg，可作为一株高效转化无机硒为有机硒的生产菌株，满足工业化生产需求。

下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明冠突散囊菌富硒菌株在pda斜面培养基上生长60h的菌苔外观图。

图2为本发明冠突散囊菌富硒菌株在pda培养基上生长72h的菌苔外观图。

图3为本发明冠突散囊菌富硒菌株在pda培养基上生成的闭囊壳的显微照片。

图4为本发明冠突散囊菌富硒菌株所生成子囊及子囊孢子的显微照片。

图5为本发明冠突散囊菌富硒菌株于锥形瓶液体培养72h的外观图。

图6为本发明冠突散囊菌富硒菌株于125l发酵罐培养72h的外观图。

具体实施方式

实施例1冠突散囊菌富硒野生菌株的筛选

从西安的市售“泾渭茯茶”中称取10g带有亮黄色闭囊壳的茯砖茶，放入研钵中粗略碾碎，后放入90ml无菌水并带有3-5颗玻璃珠的锥形瓶中。150rpm振荡混匀约30min。取1ml孢子混合液用无菌水做10倍梯度稀释，分别选取10^-3和10^-4两个梯度的孢子悬液，吸取0.1ml涂布于含有10mg/l硒元素的pda固体培养基上，30℃静置培养60h。挑取菌落较大而且颜色呈亮黄色的菌落划线于含有10mg/l硒元素的pda平板继续筛选8-10代，pda斜面培养，置于4℃保藏。

实施例2野生菌株的诱变、驯化和分离纯化

将实施例1中所筛选的菌苔用无菌生理盐水进行洗脱，并用玻璃珠打散，将浓度调整为2×10⁶-2×10⁸个孢子/ml的孢子悬液，吸取一定量孢子悬液置于培养皿中(使液面高度不超过3mm)，用20w的紫外灯管距30cm辐照25min，吸取0.1ml菌悬液接入含有不同浓度的(0；5；10；15；20；25mg/l)无机硒的pda固体平板中并涂布。30℃培养60h。选取在不同浓度硒元素上菌落较大而且颜色光亮的数个菌落划线于含有10mg/l无机硒的pda固体平板，再次比较菌落大小及菌落外观，选取菌落最大，颜色最光亮的为优势菌。划线法分离纯化8-10代，得到一株可以耐受无机硒并能高效转化无机硒为有机硒的冠突散囊菌菌株，pda斜面4℃保藏备用。

该菌株经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定(鉴定采用fmic-qo01-003真菌多相鉴定检测方法；qo-03-02微生物菌种分子生物学鉴定操作规程)，确定为：冠突散囊菌(eurotiumcristatum)。

实施例3冠突散囊菌富硒菌株的保藏

挑取实施例2所筛选到的富硒冠突散囊菌菌苔于固体pda斜面上，30℃培养约60h，加入20ml无菌水用竹签刮取菌苔，混匀后孢子浓度约为2×10⁶--2×10⁸个/ml。以1：1的体积比加入含有50％甘油的pda液体培养基，混匀。先置于-20℃预冻，再转入-80℃中长期保存，孢子萌发率在90％以上。

实施例4冠突散囊菌富硒菌株的培养基筛选

选取碳源葡萄糖，有机氮源玉米浆干粉，无机氮源硫酸铵及微量元素硒这四个因素，其中葡萄糖选取5g/l，15g/l，25g/l；玉米浆干粉选取2g/l，5g/l，8g/l；硫酸铵选取2g/l，5g/l，8g/l；硒元素选取5mg/l，10mg/l，20mg/l三个水平；实验结果见表1。

表1正交试验因素水平表

从表中可以看出，经过四因素三水平正交优化，确认：15g/l葡萄糖；2g/l硫酸镁；5g/l玉米浆干粉；5g/l硫酸铵；2g/l磷酸二氢钾；10mg/l硒元素(亚硒酸钠)为所筛选到的冠突散囊菌富硒菌株较佳的发酵培养基。

实施例5冠突散囊菌富硒菌株的发酵培养

将实施例2所筛选到的富硒冠突散囊菌菌株的菌苔用生理盐水制成菌悬液，使孢子浓度为2×10⁶～2×10⁸个/ml，吸取该菌悬液1ml，接入液体pda种子培养基(100ml)，150rpm，30℃振荡培养72h，以5％(v/v)的接种比例接入200ml/500ml经实施例4筛选的发酵培养基，150rpm，30℃振荡培养72h。过滤法收集菌丝体，用去离子水反复冲洗菌丝体5-8次，至滤液清亮为止(培养过程分泌较多胞外色素)，再次过滤收集菌丝体，冻干后检测冠突散囊菌胞内有机硒含量达690mg/kg。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。