本发明涉及基因工程重组肠道病毒71型疫苗制备技术，尤其涉及一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法及其在制备手足口病疫苗中的应用。
背景技术：
肠道病毒71型(ev71)是导致手足口病的重要病原之一。我公司构建了表达ev71抗原的重组汉逊酵母。为了对重组汉逊酵母中ev71抗原含量进行测定以监测发酵工艺的稳定性，需要对该重组汉逊酵母进行细胞破碎，释放细胞内的ev71抗原，以便对其测定。
现有技术中常用的细胞破碎方法是采用高压均质机破碎，此方法耗能大，操作繁琐，破碎率低，且一次只能破碎一个样本。国内有报道称采用氧化锆珠作为研磨介质破碎汉逊酵母细胞，但破碎率只能达到50-60％，破碎过程产生大量热量且造成锆残留。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法，该方法可有效保持ev71抗原活性，操作简单，破碎率高且能够同时破碎多个样本，有效节省样本处理时间。
本发明进一步所要解决的技术问题是，提供一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法在制备手足口病疫苗中的应用，该应用可有效保持ev71抗原活性，操作简单，破碎率高且能够同时破碎多个样本，有效节省样本处理时间。
为解决上述技术问题，本发明公开了以下技术方案：
一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母细胞破碎方法，包括下列步骤：
收集重组汉逊酵母菌体，加入细胞洗涤缓冲液洗涤重悬，离心后弃上清液；
加入细胞破碎缓冲液充分重悬菌体；
加入苯甲基磺酰氟溶液、聚山梨酯80和酸化玻璃珠，制备成菌体悬液；
将所述菌体悬液置于细胞破碎器中振荡破碎，破碎后离心取上清液，得到细胞破碎液。
在一些可能的实施方式中，所述细胞洗涤缓冲液通过以下步骤制备：
按重量计，取磷酸氢二钠3.0-3.5份、磷酸二氢钠一水合物0.1-0.2份、氯化钠8.5-9.0份，加入纯化水充分溶解混匀，调节ph值至7.5-8.5。
在一些可能的实施方式中，所述细胞洗涤缓冲液通过以下步骤制备：
按重量计，取磷酸氢二钠3.3-3.4份、磷酸二氢钠一水合物0.1-0.2份、氯化钠8.7-8.8份，加入纯化水充分溶解混匀，调节ph值至8.0。
在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎缓冲液通过以下步骤制备：
按重量计，取磷酸氢二钠5.5-6.5份、磷酸二氢钠一水合物1.0-1.5份、氯化钠25.0-35.0份、乙二胺四乙酸二钠0.2-0.5份、按体积计丙三醇20-80，加入纯化水充分溶解混匀，调节ph值至7.0-7.5。
在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎缓冲液通过以下步骤制备：
按重量计，取磷酸氢二钠5.9-6.0g、磷酸二氢钠一水合物1.1-1.2g、氯化钠29.0-30.0g、乙二胺四乙酸二钠0.3-0.4g、按体积计丙三醇40-60份，加入纯化水充分溶解混匀，调节ph值至7.4。
在一些可能的实施方式中，所述重组汉逊酵母菌体的收集量为1-3份。
在一些可能的实施方式中，所述苯甲基磺酰氟溶液的加入量为0.01-0.03份，浓度为150mmol/l-250mmol/l。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的加入量为0.001-0.003份；和/或者，所述酸化玻璃珠的加入量为1-3重量份。
在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎器转速为100-500rpm，振荡时间为30-60分钟；和/或者，破碎后离心转速6000-12000rpm，时间为5分钟。
相应地，本发明还公开了如上所述的细胞破碎方法在制备手足口病疫苗中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的实施例通过收集菌体制备成菌体悬液；将所述菌体悬液置于细胞破碎器中振荡破碎，破碎后离心取上清液，得到细胞破碎液。从而有效保持了ev71抗原活性；对设备要求低，仅需要能提供圆周式旋转的设备就能进行破碎；破碎率高达98％，显著提高了细胞破碎率。
具体实施方式
下面详细描述本发明提供的表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法的实施例；本实施例主要包括以下步骤：
一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母细胞破碎方法，包括下列步骤：
收集重组汉逊酵母菌体，加入细胞洗涤缓冲液洗涤重悬，离心后弃上清液；
加入细胞破碎缓冲液充分重悬菌体；
加入苯甲基磺酰氟溶液、聚山梨酯80和酸化玻璃珠，制备成菌体悬液；
将所述菌体悬液置于细胞破碎器中振荡破碎，破碎后离心取上清液，得到细胞破碎液。
在一些可能的实施方式中，所述细胞洗涤缓冲液通过以下步骤制备：
按重量计，取磷酸氢二钠3.0-3.5份、磷酸二氢钠一水合物0.1-0.2份、氯化钠8.5-9.0份，加入纯化水充分溶解混匀，调节ph值至7.5-8.5。
在一些可能的实施方式中，所述细胞洗涤缓冲液通过以下步骤制备：
按重量计，取磷酸氢二钠3.3-3.4份、磷酸二氢钠一水合物0.1-0.2份、氯化钠8.7-8.8份，加入纯化水充分溶解混匀，调节ph值至8.0。
在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎缓冲液通过以下步骤制备：
按重量计，取磷酸氢二钠5.5-6.5份、磷酸二氢钠一水合物1.0-1.5份、氯化钠25.0-35.0份、乙二胺四乙酸二钠0.2-0.5份、按体积计丙三醇20-80，加入纯化水充分溶解混匀，调节ph值至7.0-7.5。
在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎缓冲液通过以下步骤制备：
按重量计，取磷酸氢二钠5.9-6.0g、磷酸二氢钠一水合物1.1-1.2g、氯化钠29.0-30.0g、乙二胺四乙酸二钠0.3-0.4g、按体积计丙三醇40-60份，加入纯化水充分溶解混匀，调节ph值至7.4。
在一些可能的实施方式中，所述重组汉逊酵母菌体的收集量为1-3份。
在一些可能的实施方式中，所述苯甲基磺酰氟溶液的加入量为0.01-0.03份，浓度为150mmol/l-250mmol/l。
在一些可能的实施方式中，所述酸化玻璃珠的加入量为1-3重量份。
在一些可能的实施方式中，所述聚山梨酯80的加入量为0.001-0.003份。
在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎器转速为100-500rpm，振荡时间为30-60分钟；和/或者，破碎后离心转速6000-12000rpm，时间为5分钟。
本发明实施例提供的细胞破碎方法在制备手足口病疫苗中的应用，可采用前述实施例所描述的方法，其余与现有技术相同，不再一一赘述。
与现有技术相比，本发明实施例的表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母细胞破碎方法具有下列优点：
本方法为物理破碎方法，对ev71抗原活性无影响；
本方法使用合适的破碎缓冲体系，能有效保持ev71抗原活性，为后续检测提供保障；
本方法对设备要求低，操作简便，破碎率高，且能同时破碎多个样本。
本发明的目的在于采用合适的细胞破碎条件，对一种能表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母进行破碎，并释放其细胞内的ev71抗原且保持其活性，解决了基因工程重组肠道病毒71型疫苗制备的发酵工艺中，重组汉逊酵母ev71抗原含量测定的前处理难题。
为了更进一步阐释本实施例为达成预定发明目的所采取的的技术手段和效果，对本实施例表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法的具体步骤，通过实例数据详细说明如下。
实施例1
仪器：
离心机：eppendorf，型号minispinplus
细胞破碎器：美国glas-col涡旋振荡器
电子天平：sartoriusbt4202s
显微镜：xds-1b型倒置显微镜
试验材料：
酸化玻璃珠(glassbeads，acid-washed)：生化级，sigma，425-600μm。
步骤：
细胞洗涤缓冲液(ph8.0)的制备，称取磷酸氢二钠0.334g、磷酸二氢钠一水合物0.016g、氯化钠0.876g，加入纯化水充分溶解混匀，调节ph值至8.0，定容至100ml；
细胞破碎缓冲液(ph7.4)的制备，称取磷酸氢二钠0.596g、磷酸二氢钠一水合物0.11g、氯化钠2.925g、乙二胺四乙酸二钠0.037g、丙三醇5g，加入纯化水充分溶解混匀，调节ph值至7.4，定容至100ml；
收集0.1g重组汉逊酵母菌体，加入1ml细胞洗涤缓冲液洗涤重悬，12000rpm离心2min，倒弃上清液，再加入1ml细胞破碎缓冲液充分重悬菌体，加入10μl200mmol/l苯甲基磺酰氟溶液和1μl聚山梨酯80，最后加入1.0g酸化玻璃珠，制备成菌体悬液；
置于细胞破碎器中，振荡转速100rpm，时间60分钟，取破碎液稀释100倍用于细胞计数，比较破碎前后的细胞数，计算破碎率。
本实例中，8次细胞破碎试验的破碎率均在98.0％以上，而高压均质机破碎率在60-70％，说明该方法对于一种能表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎率要优于使用高压均质机。
实施例2
仪器：
离心机：eppendorf，型号minispinplus
细胞破碎器：美国glas-col涡旋振荡器
电子天平：sartoriusbt4202s
试验材料：
酸化玻璃珠(glassbeads，acid-washed)：生化级，sigma，425-600μm。
步骤：
细胞洗涤缓冲液(ph8.0)的制备，称取磷酸氢二钠16.7g、磷酸二氢钠一水合物0.8g、氯化钠43.8g，加入纯化水充分溶解混匀，调节ph值至8.0，定容至5l。
细胞破碎缓冲液(ph7.4)的制备，称取磷酸氢二钠29.8g、磷酸二氢钠一水合物5.5g、氯化钠146.2g、乙二胺四乙酸二钠1.8g、丙三醇250g，加入纯化水充分溶解混匀，调节ph值至7.4，定容至5l。
收集0.2g重组汉逊酵母菌体，加入1ml细胞洗涤缓冲液洗涤重悬，12000rpm离心2min，倒弃上清液，再加入1ml细胞破碎缓冲液充分重悬菌体，加入10μl200mmol/l苯甲基磺酰氟溶液和1μl聚山梨酯80，最后加入1.0g酸化玻璃珠，制备成菌体悬液。
置于细胞破碎器中，细胞破碎器转速为500rpm，振荡时间为60分钟，将破碎后的液体以12000rpm离心5分钟取上清液即为细胞破碎液。
对照例1
仪器：
高压均质机：德国apv-2000
步骤：
将菌体稀释到20％浓度，用细胞破碎缓冲液定重至破碎前料液计算总重量设置高压均质机压力为1250bar，开启高压均质机，当高压均质机压力稳定在1250±50bar后，收集流出的料液，待所有料液第一次破碎结束，停止高压均质机，重复一次破碎步骤，待所有料液第二次破碎结束，停止高压均质机，取破碎液7000rpm离心45分钟，4℃条件下离心。
采用酶联免疫吸附法测定两种破碎方法得到的重组汉逊酵母破碎液的ev71抗原含量。
本方法中的细胞破碎缓冲体系有效地保持ev71抗原活性，为ev71抗原含量的测定提供保障。本实例中，使用玻璃珠破碎的能表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母ev71抗原含量均要高于使用均质机破碎的ev71抗原含量，进一步说明本方法对于一种能表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母细胞破碎效果要优于使用高压均质机破碎。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。