打靶载体及整合外源基因至小鼠DC-SIGN外显子7位点构建BAC克隆的方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，主要是一种打靶载体及整合外源基因至小鼠dc-sign外显子7位点构建bac克隆的方法和应用。

背景技术：

通过同源重组将外源基因定点整合至靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，这种技术称为基因打靶技术。利用基因打靶技术将外源基因靶向整合至特定的染色体位点在基因疗法、细胞工程、遗传动物模型、基因功能研究及药物开发等中具有重要应用价值，而所有这些应用一方面依赖于转入基因功能的可靠性和可预测性，另一方面要求转入基因不影响内源基因和或其他调控因子的功能。树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素因子(dendriticcellspecificintercellular-adherison-molecular-3grabbingnon-integr，dc-sign)是一种主要表达于树突状细胞(dc)表面的模式识别受体，属于c型凝集素超分子家族。研究发现，当外周血中的单核细胞可以在gm-csf和il-4的刺激下分化为dc，组织中处于稳态的dc能自我更新，而不需要单核细胞衍生dc的补充。有趣的是，单核细胞衍生dc表达dc-sign而组织中自我更新的dc不表达。所以dc-sign可以作为一个基因敲入的位点，使外源基因在单核细胞衍生dc中特异性表达，在其他细胞中不表达。而且我们把插入位点设置在dc-sign基因终止密码子之后，并利用ires启动外源基因表达，最小化外源基因插入对细胞功能的影响。

细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，bac)是指一种以f质粒为基础建构而成的细菌染色体克隆载体。在基因打靶技术中，为了保证同源重组的效率需要长片段的同源臂，而直接克隆长片段的同源臂较为困难。作为一个基因保存的载体，bac可以克隆约150kb的dna且具有遗传背景简单的特点。我们可以将需要靶向插入的外源基因利用短同源臂先导入相应的bac克隆，然后提取bac进一步作为基因打靶的载体，以提高基因打靶的效率。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供打靶载体及整合外源基因至dc-sign外显子7位点构建靶向插入外源基因的小鼠dc-signbac克隆的方法和应用。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。一种靶向打靶载体序列如seqidno.14所示，命名为打靶载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen-dcsign3ha；该载体能将外源基因ires-dtr及抗性基因neomycin靶向整合至dc-sign外显子7位点终止密码子之后。靶向整合后ires-dtr由dc-sign启动子调控被转录，外源基因dtr在ires的调控下被翻译，且不影响dc-sign表达，抗性基因neomycin在pgk(哺乳动物)和em7(大肠杆菌)的调控下被表达。如需要表达其它基因，只要将外源基因dtr替换成感兴趣的基因。

上述靶向打靶载体的制备方法包括如下步骤：

(1)以rp23-12k14bacdna为模板，利用序列如seqidno.1所示的正向引物和序列如seqidno.2所示的反向引物进pcr，扩增出序列如seqidno.3所示的基因片段dcsign5’侧同源臂(dcsign5ha)；

(2)将目的基因片段dcsign5ha利用酶切位点kpni、sali克隆至带阳性选择标记的载体pl451-targeted-empty(counter-selectionbacmodificationkit,genebridges)，得到中间载体pl451-dcsign5ha-pen。

(3)以plvx-ef1α-ires-mcherry质粒(addgene)为模板，利用序列如seqidno.4所示的正向引物和序列如seqidno.5所示的反向引物进行pcr，扩增出序列如seqidno.6所示的基因片段ires；以pires-prohbegfwt质粒(addgene)为模板，利用序列如seqidno.7所示的正向引物和序列如seqidno.8所示的反向引物进行pcr，扩增出序列如seqidno.9所示的基因片段dtr；overlappcr得到序列如seqidno.10所示的融合基因片段ires-dtr；

(4)将目的基因片段ires-dtr利用酶切位点sali、ecori克隆至中间载体pl451-dcsign5ha-pen，得到中间载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen。

(5)以rp23-12k14bacdna为模板，利用序列如seqidno.11所示的正向引物和序列如seqidno.12所示的反向引物进行pcr，扩增出序列如seqidno.13所示的基因片段dc-sign3’侧同源臂(dcsign3ha)；

(6)将目的基因片段dcsign3ha利用酶切位点bamhi、noti克隆至中间载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen，得到序列如seqidno.14所示的打靶载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen-dcsign3ha。

上述靶向打靶载体可用于靶向整合外源基因至dc-sign外显子7位点构建小鼠dc-signbac克隆。

本发明还提供利用上述打靶载体，靶向整合外源基因至dc-sign外显子7位点，构建靶向插入外源基因的小鼠dc-sign-dtrbac克隆的方法。具体步骤如下：

(1)电穿孔法将red/et表达质粒pred/et转化入dc-signbac克隆，在有氯霉素和四环素抗性的lb平板上筛选，挑取单菌落扩增，并用l-阿拉伯糖诱导red/et表达；

(2)打靶载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen-dcsign3ha利用noti酶切线性化，电穿孔法将线性化的载体转化入上述表达red/et的dc-signbac克隆，使ires-dtr-pgk-em7-neo靶向插入dc-signbac；

(3)成功插入ires-dtr-pgk-em7-neo的dc-signbac克隆表达新霉素抗性，用有新霉素和氯霉素的lb平板筛选得bac克隆dcsign-ires-dtr-pen；

(4)挑选单克隆，利用序列如seqidno.15所示的正向引物和序列如seqidno.16所示的反向引物作菌落pcr，成功插入ires-dtr-pgk-em7-neo的dc-signbac克隆能够得到约1.4kb的条带。spei酶切鉴定阳性bac克隆可见4-6kb间多出2条带。

至此，本发明提供了靶向打靶载体及靶向整合外源基因至dc-sign外显子7位点，构建靶向插入外源基因的小鼠dc-signbac克隆的制备和检测方法。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种高效、安全靶向整合外源基因至小鼠dc-signbac克隆dc-sign外显子7位点的方法和应用实例。

本发明提供了靶向小鼠dc-sign外显子7位点的打靶载体左、右同源臂dna序列信息及构建方法。

本发明提供了筛选与鉴定阳性克隆的方法和应用实例。

如背景技术所提到，dc-sign可以作为一个基因敲入的位点，使外源基因在单核细胞衍生dc中特异性表达并且不影响细胞功能，本发明提供了一个新的能实现靶向整合的位点序列，利用该位点可构建靶向插入外源基因的打靶载体，并验证了利用该打靶载体能高效整合外源基因至小鼠dc-signbac克隆dc-sign外显子7位点，后续得到的靶向插入外源基因的dc-signbac，可以用于构建靶向插入外源基因的小鼠胚胎干细胞，从而为构建转基因细胞系以及小鼠建立了基础。

附图说明

图1：构建靶向小鼠dc-sign外显子7位点的打靶质粒流程示意图；

图2：携带抗性基因neomycin的空载体pl451-targeted-empty的质粒结构示意图；

图3：携带外源基因ires-dtr、抗性基因neomycin和dc-sign两侧同源臂的打靶载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen-dcsign3ha质粒结构示意图；

图4：打靶载体打靶原理及同源重组插入dc-signbac后进行pcr筛选与鉴定的引物(黑色箭头)示意图；

图5：pcr筛选与鉴定靶向dc-sign外显子7位点的dc-signbac单克隆，正确靶向的单克隆出现约1.4kb条带；

图6：酶切鉴定成功靶向dc-sign外显子7位点的dc-signbac单克隆，阳性克隆可见4-6kb间多出2条带(黑色箭头)。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明做详细的介绍：

实施例1：构建靶向整合外源基因至小鼠dc-sign外显子7位点的打靶载体

从genome.ucsc.edu网站检索并下载获得小鼠dc-sign基因组序列，结合小鼠dc-sign(genbankno:nm_133238.5)序列，确定各外显子和内含子位置及序列。包含整个dc-sign基因的bacclone:rp23-12k14从chieldren’hospotaloaklandresearchinstitute购买获得，bacdna利用hipureplasmidfiltermaxiprepkit(invitrogen)制备备用。

pcr扩增得目的基因片段dc-sign5’侧同源臂(dcsign5ha)：以rp23-12k14bacdna为模板，利用正向引物dcsign-5ha-f(kpni)-accaccggtaccctccacatgcatatgtacacacac(seqidno.1)，反向引物dcsign-5ha-r(sali)-aacaacgtcgacgactgtggagatggtggagg(seqidno.2)作pcr扩增5’侧同源臂dcsign5ha(seqidno.3)。下划线序列为酶切位点。

表1：pcr反应体系如下：

表2：pcr扩增条件如下：

将目的基因片段dcsign5ha克隆至带阳性选择标记基因的载体pl451-targeted-empty：pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。带neomycin阳性选择标记的载体pl451-targeted-empty(counter-selectionbacmodificationkit,genebridges)和回收后的dcsign5ha经kpni、sali(neb)双酶切。酶切的pcr产物经axypreppcrclean-upkit(axygen)纯化回收，酶切的载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。利用t4dnaligase(neb)将载体与目的片段连接，接着转化至大肠杆菌dh5α，挑取单个菌落培养，提取质粒dna，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示dcsign5ha插入成功并命名为中间载体pl451-dcsign5ha-pen。

pcr扩增得目的基因片段ires和dtr：以plvx-ef1α-ires-mcherry质粒(addgene)为模板，利用正向引物ires-f(sali)-accaccgtcgacgcccctctccctcccccc(seqidno.4)，反向引物ires-r-catggttgtggcaagcttatcatcgtg(seqidno.5)作pcr扩增基因片段ires(seqidno.6)；以pires-prohbegfwt质粒(addgene)为模板，利用正向引物dtr-f-cacgatgataagcttgccacaaccatgaagctgctgccgtcg(seqidno.7)，反向引物dtr-r(ecori)-accaccgaattcttagtgggaattagtcatgccc(seqidno.8)作pcr扩增dtr(seqidno.9)。下划线序列为酶切位点。pcr反应体系同表1，pcr扩增条件同表2。

pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。ires和dtr进行overlappcr，合成融合基因片段ires-dtr(seqidno.10)，具体步骤如下：

overlappcr反应体系如下：

overlappcr扩增条件为：

将目的基因片段ires-dtr克隆至中间载体pl451-dcsign5ha-pen：pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。纯化后的ires-dtr和中间载体pl451-dcsign5ha-pen分别经sali、ecori(neb)双酶切。酶切的pcr产物经axypreppcrclean-upkit(axygen)纯化回收，酶切的质粒载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。利用t4dnaligase(neb)将载体与目的片段连接，接着转化大肠杆菌dh5α，挑取单个菌落培养，提取质粒dna，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示ires-dtr插入成功并命名为中间载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen。

pcr扩增目的基因片段dc-sign3’侧同源臂(dcsign3ha)：以rp23-12k14bacdna为模板，利用正向引物dc-sign-3ha-f(bamhi)-accaccggatccccaaaaccctgccaaatg(seqidno.11)，反向引物dc-sign-3ha-r(noti)-accaccgcggccgctcttgtcaaggttatcaatggtcac(seqidno.12)作pcr扩增3’侧同源臂dcsign3ha(seqidno.13)。下划线序列为酶切位点。pcr反应体系同表1，pcr扩增条件同表2。

将目的基因片段dcsign3ha克隆至中间载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen：pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。纯化后的dcsign3ha和中间载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen分别经bamhi、(neb)双酶切。酶切的pcr产物经axypreppcrclean-upkit(axygen)纯化回收，酶切的质粒载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。利用t4dnaligase(neb)将载体与目的片段连接，接着转化大肠杆菌dh5α，挑取单个菌落培养，提取质粒dna，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示dcsign3ha插入成功并命名为打靶载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen-dcsign3ha，序列如seqidno.14所示。至此靶向整合外源基因至小鼠dc-sign外显子7位点的打靶质粒构建完成。

实施例2：利用打靶载体靶向整合外源基因至小鼠dc-signbac

电穿孔法将pred/et转化入包含整个dc-sign基因的大肠杆菌bacclonerp23-12k14：将包含整个dc-sign基因的大肠杆菌bacclonerp23-12k14接种于含氯霉素(15μg/ml)的lb平板，37℃培养16h。挑选1个克隆于有1mllb培养基(含15μg/ml氯霉素)的2ml离心管(盖子上戳一个洞使能够通气)，37℃200rpm培养过夜。取30μl培养过夜的大肠杆菌克隆于有1.4mllb培养基(含15μg/ml氯霉素)的2ml离心管，37℃1000rpm，培养2-3h扩增得对数期的大肠杆菌。扩增的大肠杆菌2℃11000rpm离心30s，吸弃上清。大肠杆菌沉淀用1ml冰上预冷的ddh20清洗3遍，最后留下约30μlddh2o重悬大肠杆菌，加入1μlpred/et(20ng/μl,counter-selectionbacmodificationkit(genebridges,usa))，轻弹混匀，冰上静置。转移大肠杆菌悬液至冰上预冷的1mm电穿孔管，利用electroporator2510进行电穿孔，1350v10μf600ohms，将pred/et转化入bacclonerp23-212f14。用1ml无抗生素lb培养基重悬大肠杆菌并转移至2ml离心管，30℃1000rpm培养70min使抗性基因表达。

l-阿拉伯糖诱导red/et表达：取100μl转入pred/et并诱导抗性基因表达的大肠杆菌于含四环素(3μg/ml)、氯霉素(15μg/ml)的lb平板，涂布均匀，30℃避光培养16h。挑取1个单克隆于有1mllb培养基(含3μg/ml四环素，15μg/ml氯霉素)的2ml盖子戳洞的离心管，30℃200rpm培养过夜。取30μl大肠杆菌于1个有1mllb培养基(含3μg/ml四环素，15μg/ml氯霉素)的2ml盖子戳洞的离心管，30℃1100rpm培养2h，直到od600大约0.3。加入50μll-阿拉伯糖至终浓度为0.3-0.4％，37℃200rpm培养45-60min，诱导red/et表达。

电穿孔法将线性化的打靶载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen-dcsign3ha转化入表达red/et的bacclonerp23-12k14：表达red/et的大肠杆菌进行离心，2℃11000rpm30s，吸弃上清。大肠杆菌沉淀用1ml冰上预冷的ddh20清洗3遍，最后留下约30μlddh2o重悬大肠杆菌，加入1-2μl(100-200ng)用noti(neb)酶切线性化的打靶载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen-dcsign3ha，轻弹混匀，冰上静置。转移大肠杆菌悬液至冰上预冷的1mm电穿孔管，利用electroporator2510进行电穿孔，1350v10μf600ohms，将线性化的打靶载体pl451-dcsign5ha-ires-dtr-pen-dcsign3ha转化入bacclonerp23-12k14。用1ml无抗生素lb培养基重悬大肠杆菌并转移至2ml离心管，30℃1000rpm培养70min使ires-dtr-pgk-em7-neo同源重组插入dc-signbac，并表达新霉素抗性基因。取100μl大肠杆菌于含四环素(3μg/ml)、氯霉素(15μg/ml)、新霉素(15μg/ml)的lb平板，涂布均匀，30℃培养大于20h，得到插入ires-dtr-pgk-em7-neo的大肠杆菌克隆，命名为bacclonedcsign-ires-dtr-pen。

实施例3：外源基因靶向整合至小鼠dc-sign外显子7位点的bac克隆的筛选与鉴定

菌落pcr筛选靶向插入ires-dtr-pgk-em7-neo的大肠杆菌bacclone：挑选19个单克隆分别于有10μlddh2o的1.5ml离心管，吹打混匀。取1μl菌液作为模板，利用正向引物ghpa-f-ttctgaggcggaaagaacc(seqidno.15)和反向引物dcsign-r-caaaaggacaggccctagaa(seqidno.16)作菌落pcr。剩余菌液加入含5mllb培养基(含15μg/ml氯霉素,15μg/ml新霉素)的15ml离心管，37℃220rpm培养16h，pred/et在37℃时会丢失。

菌落pcr反应体系如下：

菌落pcr反应条件如下：

pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，靶向插入ires-dtr-pgk-em7-neo至dc-sign外显子7位点的大肠杆菌bac阳性克隆可见约1.4kb条带，如附图5所示。

酶切鉴定阳性bac克隆：过夜扩增的阳性bac克隆菌液取4ml，用counter-selection(advanced)bacmodificationkitprotocolversion3.0(genebridges,usa)提取bac。阳性克隆bac经spei(neb)酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性克隆在4-6kb会多出2条条带，如附图6所示。pcr和酶切鉴定均正确的靶向插入外源基因的阳性bac克隆剩余菌液离心后去上清，用20％甘油的lb培养基重悬，-80℃保存。

可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110>浙江大学医学院附属第一医院

<120>打靶载体及整合外源基因至小鼠dc-sign外显子7位点构建bac克隆的方法和应用

<160>

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>36

<212>dna

<213>引物dcsign-5ha-f(kpni)

<400>1

accaccggtaccctccacatgcatatgtacacacac

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>引物dcsign-5ha-r(sali)

<400>2

aacaacgtcgacgactgtggagatggtggagg

<210>3

<211>1025

<212>dna

<213>基因片段dcsign5ha

<400>3

accaccggtaccctccacatgcatatgtacacacacacacacacacacacacacacgaac60

acaatcacacagagatcaaaaattactgttgccattaacaatataacttgtaggtggaat120

tggagaggttgctcagtggttaagaacctaggagtccttaattccagatctgcaaaaaaa180

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cactccacaaaaagaaaagaatatgcccagagcttgttgtactcaaaggtccaaaaagaa420

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tcaaggaggcttagatgggatctttttaaagtgtgttagtgtgttctaggtgctgtcttt600

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caacttcctgccctagcaagtgatggccaactccctccaccatctccacagtcgtcgacg1020

ttgtt

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>引物ires-f(sali)

<400>4

accaccgtcgacgcccctctccctcccccc

<210>5

<211>27

<212>dna

<213>引物ires-r

<400>5

catggttgtggcaagcttatcatcgtg

<210>6

<211>602

<212>dna

<213>基因片段ires

<400>6

accaccgtcgagcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttgga60

ataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaa120

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ccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataagcttgccacaaccat600

ga

<210>7

<211>42

<212>dna

<213>引物dtr-f

<400>7

cacgatgataagcttgccacaaccatgaagctgctgccgtcg

<210>8

<211>34

<212>dna

<213>引物dtr-r(ecori)

<400>8

accaccgaattcttagtgggaattagtcatgccc

<210>9

<211>663

<212>dna

<213>基因片段dtr

<400>9

cacgatgataagcttgccacaaccatgaagctgctgccgtcggtggtgctgaagctcttt60

ctggctgcagttctctcggcactggtgactggcgagagcctggagcggcttcggagaggg120

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ggt

<210>10

<211>1238

<212>dna

<213>基因片段ires-dtr

<400>10

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<210>11

<211>30

<212>dna

<213>引物dcsign-3ha-f(bamhi)

<400>11

accaccggatccccaaaaccctgccaaatg

<210>12

<211>39

<212>dna

<213>引物dcsign-3ha-r(noti)

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