融合蛋白、以及使用该融合蛋白的高密度脂蛋白的测定试剂盒的制作方法

本发明涉及用作变性高密度脂蛋白的测定的标准品的融合蛋白、用于形成该融合蛋白的核酸及载体及细胞、以及变性高密度脂蛋白的测定方法和测定试剂盒。

背景技术：

血液中的胆固醇中，有所谓的好胆固醇(高密度脂蛋白；hdl：highdensitylipoprotein)和所谓的坏胆固醇(低密度脂蛋白；ldl：lowdensitylipoprotein)。在血液中它们的浓度和中性脂肪一起作为健康诊断的指标被通用。

原本的hdl以主要构成蛋白apoai和磷脂作为主成分，不仅抑制ldl的氧化，还通过no的增加减轻由氧化ldl引起的细胞毒性，发挥抗动脉硬化效果。然而，hdl也受到氧化等的修饰。已知动脉硬化患者的血液中存在高数值的变性hdl。非专利文献1公开，冠状动脉疾病患者的变性hdl增加，其通过lox-1作用于血管。

已知变性hdl不仅失去了原本hdl所具有的抗动脉硬化作用，在动脉硬化的发病、进展方面也很重要。非专利文献2公开，在人的动脉硬化灶中大量地积蓄有hdl的载脂蛋白apoai发生了变性的hdl。

这些结果是通过实际的患者所测定的，因此认为变性hdl在人的病态方面有着重大的意义。因此，即使在好胆固醇中变性hdl也可能是动脉硬化等各种疾病的原因，因此不仅hdl的量，还需要测定变性hdl的量和质。

作为以往的变性hdl的测定方法，已知通过抗变性hdl抗体进行测定的测定法。这种方法只能测定抗体识别的特定的表位的量。而且问题在于，只是能测定表位的量，无法同时且以反映生理活性的形式测定关键的受到各种变性的hdl。

此外，测定时的标准曲线制作的参照也有问题。例如，在测定由4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，hne)修饰的hdl的情况下将hne修饰的hdl用作参照，在测定由丙二醛(malondialdehyde，mda)修饰的hdl的情况下将mda修饰的hdl用作参照。因此，即使想用单一的测定法测定受到各种变性的hdl，不仅抗体不同，而且参照不同，因此实质上测定也是不可能的。为了解决该问题，有在铜离子等存在下进行hdl的氧化的方法(下文记为氧化hdl)。然而，氧化hdl及由hne及mda修饰而制备的hdl，不仅不稳定而无法长期保存，而且因为不稳定每次测定必需重新制作标准曲线。另外，容易产生批次间品质的偏差，重现地制备并测定是不可能的。因此，必需考虑标准品的批次差并校正试验结果，准确性存在着问题。因此，即使试验标本中真正的变性hdl的浓度相同，长期试验、大规模试验以及各测定试验间难以获得一定的测定值，测定值自身显示出的含义存在可信度的问题。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1beslerc.等：“hdl在enos活化通路上对冠状动脉疾病患者的不良影响的机制”，临床研究杂志，第121卷，第2693-708页，2011年

非专利文献2huangy.等：“人动脉粥样硬化中大量功能异常的载脂蛋白a1”，自然医学，第20卷，第193-203页，2014年

技术实现要素：

发明所要解决的技术问题

关于为了解决前述的问题的技术方案，本发明人反复进行了认真研究。结果发现，通过测定由lox-1和抗apoai抗体同时识别的hdl，可以测定受到各种变性的hdl，以及，将针对lox-1的抗体(抗lox-1抗体)的lox-1结合部位等之类的针对lox-1特异性结合的蛋白与apoai融合而得的融合蛋白，不仅针对lox-1和抗apoai抗体显示出与变性hdl同样的特异性结合性，而且可以作为稳定的标准品使用，完成了本发明。

本发明是为了解决前述问题而完成的发明，本应为好胆固醇的hdl变成变性hdl并影响到动脉硬化的发病、进展，因此为了测定hdl的质而使用本发明，此外，可以同时识别受到各种变性的hdl，为了测定受体结合活性并测定生理活性本身而使用本发明，其目的为提供不含脂质的、可以长期保存的、可以重现地调制的、可以减少各测定试验间的偏差并提高可靠性的可以成为参照的融合蛋白，用于形成该融合蛋白的核酸及载体及细胞，以及精确地、重现性·可靠性良好地测定由lox-1和抗apoai抗体识别的高密度脂蛋白的方法和测定试剂盒。

解决技术问题所采用的技术方案

为了达成前述目的而完成的本发明的融合蛋白中，在与凝集素样氧化ldl受体：lox-1结合的lox-1结合蛋白序列上，直接或隔着间隔子连接有载脂蛋白a1：apoai的全蛋白序列或部分片段蛋白序列。

关于所述融合蛋白，例如，前述lox-1结合蛋白序列为抗lox-1抗体或该抗lox-1抗体的lox-1结合结构域序列。

关于所述融合蛋白，前述抗lox-1抗体或lox-1结合结构域序列可以具有通过抗原抗体反应与lox-1结合的抗体上的活性部位。

关于所述融合蛋白，前述抗lox-1抗体可以将前述活性部位作为fv型抗体的活性部位。

关于所述融合蛋白，前述apoai的部分片段蛋白序列优选包含人apoai中的氨基酸序号31-267aa的区域。

为了达成前述目的而完成的本发明的核酸编码前述融合蛋白。

为了达成前述目的而完成的本发明的载体导入有前述核酸。

为了达成前述目的而完成的本发明的细胞具有前述载体。

为了达成前述目的而完成的本发明的标本试样中的变性高密度脂蛋白的测定方法为基于变性高密度脂蛋白针对lox-1和抗apoai抗体的结合的变性高密度脂蛋白的测定方法，其中，将权利要求1-3中任一项所记载的融合蛋白作为变性高密度脂蛋白的标准品使用，并且通过光学检测和/或放射剂量检测，通过与前述标准品的比较求出前述标准品和标本试样中的变性高密度脂蛋白。

为了达成前述目的而完成的本发明的变性高密度脂蛋白测定试剂盒为基于变性高密度脂蛋白针对lox-1和抗apoai抗体的结合的变性高密度脂蛋白的测定试剂盒，其用于将前述融合蛋白作为变性高密度脂蛋白的标准品使用，并且通过光学检测和/或放射剂量检测进行测定。

所述变性高密度脂蛋白测定试剂盒用于通过光学检测和/或放射剂量检测，通过与前述标准品的比较求出标本试样中的前述变性高密度脂蛋白的浓度和质。

所述变性高密度脂蛋白测定试剂盒优选进一步包含lox-1和抗apoai抗体。

关于所述变性高密度脂蛋白测定试剂盒，例如，前述标本试样为全血、血浆或血清。

发明效果

本应为好胆固醇的hdl变成变性hdl并影响到动脉硬化的发病、进展，因此为了测定变性hdl的质而将本发明的融合蛋白用作成为测定参照的普适性标准品。

所述融合蛋白为不含脂质的人工融合重组蛋白，是可以长期保存的，可以重现地制备的，用于对于从人采集的全血以及其处理后的血浆、血清之类的标本试样，即使测定日期及测定时间不一样，也减少各测定试验间的偏差，提高可靠性，得到具有可信度的实测值的标准品。

以往的变性脂质的测定有因为脂质的不稳定性而难以测定的问题，另外必需迅速处理标本试样。尽管标本样品自身的不稳定性问题可以通过保存方法的合理化以及测定时间的缩短来消除，但是存在作为测定基准的标准品不稳定而无法确保测定的稳定性·重现性的问题。然而，所述融合蛋白是不具有脂质的，通过重组dna技术制备对测定体系的lox-1蛋白和抗apoai抗体两者具有亲和性的人工蛋白，可以稳定并重现地生产该人工蛋白的标准品。

关于所述融合蛋白，如果使用用于形成该融合蛋白的核酸、导入有该核酸的载体、具有该载体的动物细胞之类的细胞，则随时可制备同样品质的东西。

使用所述融合蛋白的本发明的变性高密度脂蛋白的测定方法为利用了与变性hdl结合的lox-1的底物特异性测定。所述测定方法可以通过单一的方法检出·测定发生各种变性的hdl，因此是非常简便的。

尽管笼统地说变性hdl，但实际上变性的种类各式各样，并不是同时定量就是好的，变性hdl实际上具有何种程度的生物活性是重要的。于是，利用lox-1受体可以与各种变性hdl结合这一点以及通过与lox-1受体的结合程度可以评价生物活性这一点，用变性高密度脂蛋白的测定方法可以检出·测定变性hdl的量和质。

所述测定方法将前述融合蛋白用作作为定量及质的测定对照的标准品。所述测定方法将融合蛋白用作以作为lox-1结合蛋白的抗lox-1抗体的可变区作为中心的lox-1识别部分，将其与apoai蛋白制成嵌合蛋白，使用其测定标本试样中的变性hld。

通过所述测定方法，针对变性hdl可以同时识别各种表位，可以用于测定受体结合活性并测定生理活性本身，因此可以精确地且重现性·可靠性良好地测定变性hdl的量以及质。

此外，通过为了所述测定方法而使用的本发明的变性高密度脂蛋白的测定试剂盒，可以简便且迅速地、精确地且重现性·可靠性良好地测定变性hdl的量以及质，对以动脉硬化及血栓症为首的各种心脏病及缺血性疾病的检查及预测起到作用，可以帮助预防这些疾病。

所述测定试剂盒将lox-1固相化，通过作为受体结合试验的elisa(酶联免疫吸附试验：enzyme-linkedimmunosorbentassay)评价与lox-1结合的含有apoai的脂蛋白活性，通用性较高。

附图说明

[图1]是将适用本发明的融合蛋白的氨基酸序列用单字母符号表示的图。

[图2]是显示了lox-1或dectin-1是否与hdl、氧化hdl、ldl、氧化ldl结合的试验结果的图表的图。

[图3]是适用本发明的融合蛋白以及lox-1结合，与不适用本发明的人工氧化hdl以及lox-1结合进行试验后的结果的对比在图表中显示的图。

[图4]是显示了将人工氧化hdl与融合蛋白针对lox-1的反应性进行批次间比较的elisa结果的图表。

[图5]是显示了人血浆中的lox-1结合变性hdl的检出结果的图表。

具体实施方式

以下详细地关于本发明的具体实施方式进行说明，但是本发明的范围不限于这些实施方式。

本发明的融合蛋白为，在与lox-1结合的lox-1结合蛋白序列上，直接或隔着间隔子连接有apoai的全蛋白序列或部分片段蛋白序列的嵌合蛋白。

因此所述融合蛋白具备针对lox-1的特异性结合性和针对抗apoai抗体的特异性结合性。所述融合蛋白例如在通过使用lox-1和抗apoai抗体的夹心免疫试验测定变性hdl中，可以作为具有稳定性且精度容易管理的标准品而取代以往的标准品(人工氧化hdl)进行使用。

所述融合蛋白因为不具有脂质，所以是稳定的。此外，可以通过重组dna技术进行大量生产，可以大量地获得同一批次的标准品。

所述融合蛋白如果具有比为apoai全长的全蛋白序列更小分子的其部分片段蛋白序列，则比具有全蛋白序列更容易通过重组dna操作进行制备。

关于所述融合蛋白，lox-1结合蛋白序列例如为抗lox-1抗体，或是其一部分并针对lox-1能够特异性结合的lox-1结合结构域序列，可以列举抗体及与其具有构造·功能关联的免疫球蛋白ig。关于所述免疫球蛋白ig，其同种型类别及亚类不受限制，例如可以列举igg1、igg2、igg3等之类的igg、igm、iga、igd、ige等。

lox-1结合蛋白序列为由全长的免疫球蛋白ig构成的抗lox-1抗体的情况下，只要是与lox-1结合的抗体就没有特别限制，例如动物来源的可列举来源于人、鼠、牛等、更具体地可列举针对人lox-1特异性结合的鼠抗lox-1单克隆抗体#10-1(参考“lox-1-mt1-mmp轴对于内皮细胞中的氧化低密度脂蛋白诱导的rhoa和rac1活化至关重要。”，sugimotok等，心血管研究，第84卷,第124-136页,2009年)。

此外，lox-1结合蛋白序列是作为包含免疫球蛋白可变区的抗体功能性片段的、作为抗lox-1抗体的一部分的lox-1结合结构域序列的情况下，可列举vh、vl、fv、fab、以及f(ab’)2等。

关于所述融合蛋白，例如，抗lox-1抗体或lox-1结合结构域序列可以具有通过抗原抗体反应与lox-1结合的抗体上的活性部位，优选具有fv型抗体的活性部位。如图1所示，fv型抗体(scfv、vh-vl)为重链可变区(vh)与轻链可变区(vl)连接而成的抗体功能性片段。

所述融合蛋白中，apoai的全蛋白序列或部分片段蛋白序列只要是作为apoai起作用就没有特别限制，例如动物来源的可列举来源于人、鼠、牛等。

所述融合蛋白，作为具体的一示例，如图1中用单字母符号、序列号1中用三字母符号所表示的，具有作为与lox-1结合的lox-1结合蛋白序列的抗lox-1抗体(#10-1)的lox结合结构域(虚线部分)，以及作为apoai的部分片段蛋白序列的为抗apoai抗体结合蛋白的人apoai中氨基酸序号31-267aa的区域。

所述融合蛋白中，与lox-1结合的lox-1结合蛋白序列以及apoai的全蛋白序列或部分片段蛋白序列不限于天然来源，只要体现其功能，也可以是氨基酸的一部分被置换、缺失、被插入的变异蛋白序列。

关于所述融合蛋白，可以将lox-1结合蛋白序列的n末端侧与apoai的全蛋白序列或部分片段蛋白序列的c末端侧结合并连接，也可以将lox-1结合蛋白序列的c末端侧与apoai的全蛋白序列或部分片段蛋白序列的n末端侧结合并连接。它们可以用酰胺键直接结合并连接，也可以用隔着不抑制apoai及lox-1的作用的多肽间隔子的酰胺键间接地结合并连接，也可以隔着多肽和/或非多肽间隔子用除酰胺键以外的醚键等共价键间接地结合。

将不适用本发明的含有氧化hdl的蛋白与适用本发明的融合蛋白进行对比。与氧化脂质不稳定并不适合作为参照及标准品的生物体来源的氧化hdl不同，所述融合蛋白将氧化hdl置换为人工蛋白，由于不具有磷脂，所以稳定且可以重现地生产。

所述融合蛋白的制造方法没有特别限制，可以通过公知的基因技术制备，也可以通过化学合成制备。

如果采用基因技术，则例如可以制备编码所述融合蛋白的核酸，制备导入有所述核酸的载体，使用所述载体由宿主细胞(例如，cos及cho之类的动物细胞、酵母、大肠杆菌之类的细菌等)制造。

对由抗lox-1抗体和为抗apoai抗体结合蛋白的人apoai制备一个实施方式的所述融合蛋白的概要进行说明。

更具体地，关于所述融合蛋白，从抗lox-1抗体和apoai，基于已知的碱基序列，通过pcr等操作或通过化学合成，分别获取编码与lox-1结合的lox-1结合蛋白序列(例如为抗lox-1抗体的全氨基酸序列的全长或为其一部分并为与lox-1结合的氨基酸序列的部分片段)的dna，和编码为apoai全蛋白序列的全长或为其一部分并为与抗apoai抗体结合的部分片段蛋白序列的部分片段的dna。

然后，将编码lox-1结合蛋白部分的dna与编码apoai的全长或部分片段的dna以框一致的方式连接，制备编码融合蛋白的嵌合基因。

然后，使用限制酶和连接酶，将所述嵌合基因适宜地组装入大肠杆菌质粒之类的载体，制备为融合蛋白表达载体的重组载体。对所述重组载体的概要进行说明。

将所述重组载体导入宿主细胞并进行转化，制备为融合蛋白表达细胞的重组细胞。

进一步培养所述重组细胞。从其培养物中，通过离心分离、盐析、膜分离、亲和层析之类的层析等合适的分离方法纯化并采集融合蛋白。

标本试样中的变性高密度脂蛋白的测定方法为，将所述融合蛋白用作标准品，利用变性高密度脂蛋白针对lox-1和抗apoai抗体特异性结合的反应进行测定。

具体地，(1)以所述融合蛋白为标准品，制作作为浓度及活性与光学强度及放射剂量等测定值的相关关系的基准的标准曲线及对比表及换算式。例如，制备阶段性稀释的融合蛋白标准溶液，进行免疫试验，在各个浓度下测定吸光度之类的光学强度以及放射强度之类的放射剂量等标准液测定值，制作融合蛋白浓度与标准液测定值的标准曲线或对比表。

(2)另一方面，测定关于人的全血及血浆及血清之类的标本试样的变性hdl。例如，进行与标准液的测定同样的免疫试验，求出标本试样的变性hdl所导致的光学强度及放射剂量等测定值。

(3)然后，将变性hdl所导致的光学强度及放射剂量等测定值与标准曲线及对比表进行比较以及代入测定值的换算式，由此统括性地检出·测定变性hdl的量及质。例如，将变性hdl所导致的光学强度及放射剂量等测定值与标准曲线及对比表对照或代入换算式，得到作为关于变性hdl的量及质相对于融合蛋白的相对值的融合蛋白相对量。也可以代入从所述标准曲线及对比表所得到的换算式，算出融合蛋白相对量。

关于所述变性高密度脂蛋白的测定方法，采用使用了lox-1和抗apoai抗体的免疫试验。此类免疫试验通过夹心法、竞争法等公知的方法进行。

关于所述变性高密度脂蛋白的测定方法，为了测定标本试样，例如通过将lox-1以及抗apoai抗体的任一方固定于支撑体(即固相法)来进行。支撑体可列举微孔板的各个孔、和/或珠。

所述变性高密度脂蛋白的测定方法作为使用了lox-1和抗apoai抗体的免疫试验，可以代替以往的作为测定参照使用氧化hdl的氧化hdl测定法，或者在其之上进一步补充来进行。

关于所述变性高密度脂蛋白的测定方法，例如，用将lox-1固定于微孔板的孔等支撑体的示例进行说明，将从人采集的全血及血浆及血清之类的标本试样添加至孔，使标本试样中存在的变性hdl捕捉在lox-1上。然后，向那里添加被标记的抗apoai抗体或预先进行添加，使该抗体与被捕捉的变性hdl结合。将结合的抗apoai抗体的标记作为指标，可以通过光学检测和/或放射剂量检测测定标本试样中的变性hdl。

所述标记用于通过光学检测和/或放射剂量检测进行测定，例如可列举酶(酶免疫试验，eia、elisa)、荧光物质(荧光免疫试验，fia)、放射性物质(放射免疫试验，ria)。

作为标记抗apoai抗体的替代，也可以不标记抗apoai抗体，使用与抗apoai抗体结合的第二抗体。抗apoai抗体可以是单克隆的，也可以是多克隆的。

lox-1可以通过公知的方法(例如，日本专利特开平9-98787号公报等)制备。抗apoai抗体也可以使用市售的。

作为通过所述变性高密度脂蛋白的测定方法可以测定的变性hdl，例如可列举，hclo-hdl、hne-hdl、氨基甲酰化hdl以及mda-hdl等。这些变性hdl损害血管壁的血管内皮细胞，提高引起动脉硬化及血栓形成的心脏病及缺血性疾病等动脉硬化类疾病之类的各种疾病的发病风险。

所述变性高密度脂蛋白的测定方法可以作为动脉硬化类疾病的风险评价指标，特别是与脑梗塞的强烈关系以及与颈动脉内膜肥厚的关联之类的评价指标，还可以作为动脉硬化进展的替代标志物、动脉硬化治疗效果的判定指标，用于诊断、治疗方法的选择、诊断结果的数值化。

根据所述变性高密度脂蛋白的测定方法，可以测定单单通过基于hdl·ldl测定结果的健康诊断无法测定的变性hdl的量及质，根据需要可以在测定变性ldl的同时，提供变性胆固醇的适当的评价·诊疗。

可以使用基于变性脂蛋白针对lox-1和抗apoai抗体的结合的本发明的变性高密度脂蛋白的测定试剂盒，进行所述变性高密度脂蛋白的测定方法。

所述变性高密度脂蛋白的测定试剂盒用于：一方面，将前述融合蛋白用作变性高密度脂蛋白的标准品，并且在融合蛋白的各浓度下以光学方式测定光学强度，制作标准曲线及对比表及换算式等，另一方面，关于标本试样(例如人的全血及血浆及血清)，通过将lox-1或抗apoai抗体中的任一个固定于微孔板的各个孔以及珠之类的支撑体，添加lox-1或抗apoai抗体中的另一个，即固相法，来以光学方式测定光学强度，与标准曲线及对比表进行比较或代入换算式，检出·测定标本试样中的变性hdl浓度。

所述变性高密度脂蛋白的测定试剂盒中，根据需要在支撑体(例如微孔板的孔)上固定有lox-1，具有与其结合的融合蛋白、与该融合蛋白结合的抗apoai抗体和缓冲液，或者，根据需要在其他支撑体(例如可以添加需测定变性hdl的标本试样的微孔板的孔)上固定有lox-1，具有变性hdl与lox-1结合后与其结合的抗apoai抗体和缓冲液。抗apoai抗体被标记，或未被标记地与第二标记共存。

实施例

下面，制备适用本发明的融合蛋白和使用了该融合蛋白的变性高密度脂蛋白的测定试剂盒，对通过该试剂盒进行变性高密度脂蛋白的测定方法的细节进行说明。

首先，如下所述，制备本发明的融合蛋白。

(制备例1)融合蛋白的制备

为了获得对lox-1蛋白和抗apoai抗体两者具有亲和性的蛋白，首先制备由抗lox-1抗体基因(可变区(fv区))和apoai基因形成的融合蛋白基因。fv型抗体基因使用了基于从产生鼠单克隆抗人lox-1抗体(#10-1)的杂交瘤的cdna克隆的可变区基因制备的抗lox-1-fv基因(记载于“lox-1-mt1-mmp轴对于内皮细胞中的氧化低密度脂蛋白诱导的rhoa和rac1活化至关重要。”，sugimotok等，心血管研究，第84卷,第124-136页,2009年)。apoai基因由人肝脏cdna克隆。

(制备方法2)apoai基因的克隆

作为人apoai全长基因(genbank登录号nm000039.2；1,239bp)、以人mtcpanelii(克隆科技公司(clontech))的肝脏cdna文库作为模版，使用引物组apoai-f(caccatgaaagctgcggtgctgaccttg)(序列号2)、apoai-r(ctgggtgttgagcttcttagtgtac)(序列号3)、primestarhsdna聚合酶(宝生物公司(takara)#r010a)进行pcr，获得apoai全长基因。然后，使用pcdnagatewaydirectionaltopo表达试剂盒(英杰公司(invitrogen))将所述全长基因亚克隆至pcdna6.2/v5/gw/d-topo载体(英杰公司(invitorgen))，通过abiprism循环测序试剂盒确认碱基序列。

(制备方法3)fv型抗lox-1抗体和apoai的融合蛋白的制备

按照以下步骤制备fv型抗lox-1抗体的c末端侧与apoai的n末端侧隔着连接序列相连接的融合蛋白。

以上述的fv型抗lox-1抗体表达载体作为模版，使用正向引物(fv-h-f引物：caccatggattttgggctgatttttttta)(序列号4)以及在3’末端包含连接序列的一部分的反向引物(fv-l-linker-r引物：accagagccgccgccgccgctaccaccaccacctttcaactccagcttggtccc)(序列号5)、primestarhsdna聚合酶(takara#r010a)进行pcr，重新扩增fv型抗lox-1抗体基因。

此外，以通过上述而制备的apoai全长基因作为模版，使用在5’末端包含连接序列的一部分的正向引物(linker-apoai-f引物：agcggcggcggcggctctggtggtggtggatcccggcatttctggcagcaagatgaac)(序列号6)以及反向引物(apoai-r引物：ctgggtgttgagcttcttagtgtactc)(序列号7)、primestarhsdna聚合酶(takara#r010a)进行pcr，重新扩增编码apoai的基因。

将这些通过使用重叠延伸pcr法，将fv型抗lox-1抗体和apoai(55-801bp)分别隔着连接序列将vl的c末端侧与apoai的n末端侧连接，将该融合蛋白基因插入pef6-v5-his载体(英杰公司(invitrogen))。

然后，使用kod-plus-诱变试剂盒(东洋纺公司(toyobo)#smk-101)、linkerr引物(ggatccaccaccaccagagccgccg)(序列号8)、apoa1-31aaf引物(ccctgggatcgagtgaaggacctgg)(序列号9)，使包含apoai的翻译后切割部位gln24(参照“人apoa-i的cdna克隆：前原apoa-i的氨基酸序列。”，lawsw.等，生化与生物物理研究通讯，第112卷，第257-264页，1983年)的19-30号氨基酸序列缺失。通过abiprism循环测序试剂盒确认碱基序列，将其用于蛋白表达系统中。

使用expi293表达系统(英杰公司(invitrogen))进行融合蛋白的表达，使用nisepharoseexcel树脂(ge公司)对分泌至培养基中的融合蛋白进行his纯化。所得到的蛋白在pbs中透析后，进行0.22μm过滤器过滤灭菌，用于实验。

(试验例1)lox-1结合变性hdl检出系统的构建

首先，将从人edta血浆通过kbr密度梯度离心法分离的hdl或ldl用pbs调整使其浓度为3mg/ml，添加硫酸铜使其达到7.5μm后，在37℃、5％co2的培养箱中孵育16小时。然后，以含有2mmedta的0.15m氯化钠溶液作为外液将该溶液进行透析，作为人氧化hdl、氧化ldl。

通过使用了lox-1蛋白和抗apoai抗体的夹心elisa研究该氧化hdl是否与受体lox-1结合。

使用了lox-1以及抗apoai抗体的夹心elisa

将重组人lox-1(61-273aa)或者作为对照与lox-1属于同一家族的蛋白dectin-1在4℃下整夜在elisa板上固相化。用pbs清洗后，通过含有3％bsa的hepes缓冲液(10mmhepes，150mmnacl，ph7.4)进行封闭。用pbs清洗三次后，分别添加氧化hdl、hdl、氧化ldl、ldl，进行孵育。用pbs清洗后，添加鸡抗apoai单克隆抗体(chickenmonoclonalanti-apobantibody)或hrp标记抗apoai多克隆抗体(sheeppolyclonalanti-apobantibody-hrp)。使用鸡抗apoai单克隆抗体的情况下，添加鸡抗apoai单克隆抗体，使其在室温下反应1小时后，用pbs清洗后，添加第二抗体hrp标记驴抗鸡igy，室温下孵育1小时。

抗体反应后用pbs清洗5次，向板添加tmb溶液并使其在室温下反应。用2m硫酸使反应停止，使用spectramax340pc384(分子仪器公司(moleculardevices))测定450nm的吸光度，检出结合的氧化hdl。

结果如图2所示。图2是显示了为了考察lox-1结合变性hdl检出系统能否构建而用抗apoai抗体检出hdl、氧化hdl、ldl、氧化ldl与lox-1或dectin-1的结合的结果的图表。由图2清楚地看出，观察到氧化hdl与lox-1的浓度依赖性结合，未检出未氧化的hdl和ldl以及氧化ldl与lox-1的结合。另一方面，dectin-1与氧化hdl和hdl都没有结合。籍此得知，通过elisa可以检出与lox-1结合的变性hdl。

(试验例2)人工氧化hdl-lox-1结合与融合蛋白-lox-1结合的对比

分别使用通过前述试验例1制备的人工氧化hdl和通过前述试验例1制备的融合蛋白，按照前述试验例1的方法，研究人工氧化hdl或融合蛋白与lox-1以及抗apoai抗体的结合。结果如图3中的●所示。由图3清楚地看出，所制备的融合蛋白与lox-1和抗apoai抗体同时结合，在该图中，如用δ所显示的，在未将lox-1固相化的情况下未检出。籍此得知，可以用与人工氧化hdl同样的方法通过elisa检出融合蛋白。

另外，人工氧化hdl由于包含脂质，脂质与空气接触，容易被氧气氧化，随着时间发生化学变化而劣化，因此重现性差。然而，若使用所制备的融合蛋白，则不具有脂质，即使与空气接触也不容易被氧化，不容易随着时间发生化学变化，可以维持高品质，重现性好。因此，根据用该融合蛋白进行的测定，因为成为始终可以获得相同结果的尺度，所以可以成为制作普适性的标准曲线及对比表及换算式的标准品。

(试验例3)人工氧化hdl、融合蛋白的批次间比较

通过使用了lox-1和抗apoai抗体的夹心elisa(上述(试验例1))，研究了关于将由人血浆制备的hdl人工氧化的氧化hdl，由批次间的不同对测定值产生何种程度的影响。此外，同样地研究了通过本实施例所制备的融合蛋白的批次间的不同，验证融合蛋白的实用性。结果如图4所示。图中，〇、●、▲显示不同批次的人工氧化hdl或融合蛋白。人工氧化ldl(oxhdl)在三个不同批次中可见反应性的差异。另一方面，融合蛋白在批次间几乎未见差异。

(试验例6)人血液中的变性hdl的检出

按照前述试验例1的方法，尝试检出人血液中的变性hdl。测定标本使用了从6名健康人志愿者采集的edta血浆。

结果如图5所示。即，显示了通过使用了lox-1和抗apoai抗体的夹心elisa可以检出人血液中的变性hdl。

根据该试验，通过使用了lox-1和抗apoai抗体的夹心elisa，成功确认了所制备的人工重组蛋白是否可以同时识别lox-1和抗apoai抗体两者。籍此得知，所制备的人工重组蛋白同时与lox-1和抗apoai抗体结合，由抗apoai抗体被检出。由此得知，成功制备了稳定且可以重现地生产的标准标本。

由此，关于用于作为高密度脂蛋白的测定的标准品的融合蛋白、用于形成该融合蛋白的核酸及载体及细胞、以及高密度脂蛋白的测定方法和测定试剂盒，如同以上详细说明，根据本发明，可以精确地且简便地重现性良好地迅速检出·测定变性hdl。

此类变性hdl的测定，因为不仅检测其量还检测其质，因此与血液中的hdl·ldl的测定被用作健康诊断的指标一样，早晚会成为标准的测定方法的吧。

根据该变性hdl的测定，可以提供以往所遗漏的动脉硬化及血栓形成之类的动脉硬化类疾病及心脏病等的风险的评价法。此外，可以对动脉硬化类疾病及心脏病等生活习惯病的一次预防、诊察、治疗方针的研究、治疗、治疗效果的判定、二次预防起到作用。

产业上利用的可能性

本发明的融合蛋白作为精确地重现性·可靠性良好地测定高密度脂蛋白的方法和测定试剂盒的标准品是有用的。用于形成该高密度脂蛋白的核酸及载体及细胞对于高密度脂蛋白的制备是有用的。

使用该融合蛋白的本发明的精确地重现性·可靠性良好地测定高密度脂蛋白的方法和测定试剂盒对于获得进行动脉硬化类疾病及心脏病等的预防、诊疗时的重要信息是有用的。

<110>国立大学法人信州大学

<120>融合蛋白、以及使用该融合蛋白的高密度脂蛋白的测定试剂盒

<130>l14014

<160>5

<210>1

<211>516

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<213>人工序列

<220>

<223>设计的肽

<400>1

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<220>

<223>[正向引物]

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<213>人工序列

<220>

<223>[反向引物]

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<223>[正向引物]

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<213>人工序列

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<223>[反向引物]

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<213>人工序列

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<223>[正向引物]

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<213>人工序列

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<223>[反向引物]

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<213>人工序列

<220>

<223>[正向引物]

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<213>人工序列

<220>

<223>[反向引物]

<400>9

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