单细胞的高通量核酸谱分析的制作方法

文档序号:22688057发布日期:2020-10-28 12:57阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种对单细胞的核酸组合物进行谱分析的方法,所述方法包括:

在液滴中分离所述单细胞;

在所述液滴中裂解所述单细胞以从所述细胞中释放模板核酸;

在所述液滴中扩增所述模板核酸以产生经过扩增的核酸;以及

在所述液滴中检测所述经过扩增的核酸。

2.根据权利要求1所述的方法,其中所述分离包括在悬浮于与水不混溶的介质中的水性液滴中分离所述细胞。

3.根据权利要求1到2中任一项所述的方法,其中所述分离包括用裂解试剂、dna聚合酶、扩增引物、脱氧核苷酸三磷酸、rnase抑制剂、核酸逻辑门和报告子中的一种或多种在所述液滴中分离所述细胞。

4.根据权利要求3所述的方法,其中所述裂解试剂包括洗涤剂。

5.根据权利要求4所述的方法,其中所述洗涤剂包括非离子洗涤剂。

6.根据权利要求3到5中任一项所述的方法,其中所述dna聚合酶具有dna依赖性聚合酶和/或rna依赖性聚合酶活性,具有链置换活性,并且缺乏5'→3'核酸外切酶活性。

7.根据权利要求3到6中任一项所述的方法,其中所述逻辑门包括聚合酶依赖性逻辑门。

8.根据权利要求3到7中任一项所述的方法,其中所述报告子包括非特异性荧光dna报告子。

9.根据权利要求3到7中任一项所述的方法,其中所述报告子包括序列特异性荧光dna报告子。

10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法,其中所述裂解包括在所述液滴中存在裂解试剂的情况下加热所述细胞。

11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法,其中所述模板核酸包括rna,并且所述扩增包括将所述rna逆转录成dna。

12.根据权利要求11所述的方法,其中所述扩增进一步包括扩增所述dna。

13.根据权利要求1到10中任一项所述的方法,其中所述模板核酸包括dna,并且所述扩增包括扩增所述dna。

14.根据权利要求1到13中任一项所述的方法,其中所述扩增包括等温地扩增所述模板核酸。

15.根据权利要求1到14中任一项所述的方法,其中所述扩增包括使用酶依赖性等温扩增等温地扩增所述模板核酸。

16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法,其中所述扩增包括环介导等温扩增。

17.根据权利要求1到16中任一项所述的方法,其中所述检测包括非特异性地检测所述经过扩增的核酸。

18.根据权利要求1到16中任一项所述的方法,其中所述检测包括特异性地检测所述经过扩增的核酸。

19.根据权利要求1到18中任一项所述的方法,其中所述检测包括通过用核酸逻辑门进行分子计算来对所述经过扩增的核酸进行谱分析。

20.根据权利要求19所述的方法,其中所述逻辑门被配置成执行选自由以下组成的组的逻辑运算:是、非、与、或、与非、非与、非或、异或、同或和蕴涵。

21.根据权利要求19到20中任一项所述的方法,其中所述逻辑门包括聚合酶依赖性核酸逻辑门。

22.根据权利要求21所述的方法,其中所述聚合酶依赖性核酸逻辑门包括退火重结合(anneal)于门链的输出链,所述逻辑门被配置成在存在输入链和dna聚合酶的情况下从所述门链释放所述输出链,其中:

所述输出链退火重结合于所述门链的输出链退火重结合部分,而不退火重结合于所述门链的输出链非退火重结合部分,其中所述输出链退火重结合部分比所述输出链非退火重结合部分更靠近所述门链的5'端;

所述输入链退火重结合于所述门链的输入链退火重结合部分,而不退火重结合于所述门链的输入链非退火重结合部分,其中所述输入链退火重结合部分比所述输入链非退火重结合部分更靠近所述门链的3'端;并且

所述输入链退火重结合于所述门链以及所述输入链沿所述门链聚合酶介导延伸以形成延伸的输入链对于从所述门链释放所述输出链是必要和充分的。

23.根据权利要求22所述的方法,其中所述输出链退火重结合部分和所述输入链非退火重结合部分至少部分地重叠,并且其中所述输入链退火重结合部分和所述输出链非退火重结合部分至少部分地重叠。

24.根据权利要求22到23中任一项所述的方法,其中所述输出链退火重结合部分和所述输入链退火重结合部分至少部分地重叠。

25.根据权利要求22到23中任一项所述的方法,其中所述输出链退火重结合部分和所述输入链退火重结合部分不重叠。

26.根据权利要求22到25中任一项所述的方法,其中所述逻辑门执行非运算,其中:

所述逻辑门进一步包括退火重结合于所述输出链的非链;并且

所述输出链从所述门链的释放导致所述输出链与所述非链的结合,从而阻止所述输出链的下游信号传递或对所述输出链的检测。

27.根据权利要求26所述的方法,其中:

所述输出链包括荧光团-淬灭剂对中的荧光团或淬灭剂中的第一个;

所述非链包括所述荧光团-淬灭剂对中的所述荧光团或所述淬灭剂中的第二个;并且

所述输出链从所述门链的释放导致所述输出链与所述非链的结合和所述荧光团的淬灭。

28.根据权利要求22到25中任一项所述的方法,其中所述逻辑门执行兼或运算,其中:

所述输入链包括至少两条不同的输入链;

所述门链的所述输入链退火重结合部分能够退火重结合于所述至少两条不同的输入链中的每一条;并且

所述至少两条不同的输入链中的任何一条退火重结合于所述门链诱导所述至少两条不同的输入链中的任何一条的聚合酶介导的延伸并且将所述输出链从所述门链置换出来。

29.根据权利要求22到25中任一项所述的方法,其中所述逻辑门执行兼或运算,其中:

所述输入链包括至少两条不同的输入链;

所述门链包括至少两条不同的门链;

所述至少两条不同的门链中的第一条的所述输入链退火重结合部分退火重结合于所述至少两条不同的输入链中的第一条;并且

所述至少两条不同的门链中的第二条的所述输入链退火重结合部分退火重结合于所述至少两条不同的输入链中的第二条。

30.根据权利要求22到25中任一项所述的方法,其中所述逻辑门执行与运算,其中:

所述输入链包括至少两条不同的输入链;

所述门链包括至少两条不同的门链;

所述至少两条不同的门链中的第一条的所述输入链退火重结合部分退火重结合于所述至少两条不同的输入链中的第一条,但不退火重结合于所述至少两条不同的输入链中的第二条;

所述至少两条不同的门链中的第二条的所述输入链退火重结合部分退火重结合于所述至少两条不同的输入链中的所述第二条,但不退火重结合于所述至少两条不同的输入链中的所述第一条;

所述逻辑门进一步包括阈值链,其中所述阈值链以与所述输出链与之结合的所述至少两条不同的门链中的每一条基本相等的摩尔浓度存在于所述液滴中,并且其中所述阈值链当从所述门链置换出来时退火重结合于所述输出链;并且

所述至少两条不同的门链中的所述第一条退火重结合于其输入链退火重结合部分并且所述至少两条不同的门链中的所述第二条退火重结合于其输入链退火重结合部分对于释放超过所述阈值链的输出链的量是必要的。

31.根据权利要求22到25中任一项所述的方法,其中所述逻辑门执行与非运算,其中:

所述输入链包括至少两条不同的输入链;

所述门链包括至少两条不同的门链;

所述输出链包括至少两条不同的、基本互补的输出链;

所述至少两条不同的门链中的第一条的所述输入链退火重结合部分退火重结合于所述至少两条不同的输入链中的第一条,但不退火重结合于所述至少两条不同的输入链中的第二条;

所述至少两条不同的门链中的第二条的所述输入链退火重结合部分退火重结合于所述至少两条不同的输入链中的所述第二条,但不退火重结合于所述至少两条不同的输入链中的所述第一条;并且

当从所述门链释放时,所述至少两条不同的输出链退火重结合于彼此。

32.根据权利要求22到25中任一项所述的方法,其中:

所述输出链包括报告子门退火重结合部分,所述报告子门退火重结合部分退火重结合于报告子门的报告子链或淬灭剂链。

33.根据权利要求32所述的方法,其中:

所述输出链进一步包括退火重结合于第二输入链的第二输入链退火重结合部分,其中所述第二输入链退火重结合部分比所述报告子门退火重结合部分更靠近所述输出链的3'端。

34.根据权利要求22到25中任一项所述的方法,其中所述逻辑门进一步包括阈值链,所述阈值链被配置成退火重结合于所述输出链。

35.根据权利要求22到34中任一项所述的方法,其中所述门链的长度为约4到约300个核苷酸碱基。

36.根据权利要求22到35中任一项所述的方法,其中所述输出链的长度为约2到约100个核苷酸碱基。

37.根据权利要求22到36中任一项所述的方法,其中所述输入链包含所述经过扩增的核酸。

38.根据权利要求22到36中任一项所述的方法,其中所述输入链是来自被配置成检测第二输入链的第二逻辑门的输出链。

39.根据权利要求22到38中任一项所述的方法,其中:所述输出链是第二逻辑门的输入链。

40.根据权利要求22到39中任一项所述的方法,其中所述输出链是报告子门的输入链。

41.根据权利要求19到40中任一项所述的方法,其中对所述经过扩增的核酸进行所述裂解、所述扩增和所述谱分析是在基本相同的温度下进行的。

42.根据权利要求19到41中任一项所述的方法,其中对所述经过扩增的核酸进行所述裂解、所述扩增和所述谱分析是在基本恒定的温度下进行的。

43.根据权利要求19到42中任一项所述的方法,其中在对所述经过扩增的核酸进行所述裂解、所述扩增和所述谱分析的整个过程中及其之间保持基本恒定的温度。

44.根据权利要求1到7、10到16和19到43中任一项所述的方法,其中所述检测包括用非特异性荧光dna报告子检测所述经过扩增的核酸。

45.根据权利要求1到7、10到16和19到43中任一项所述的方法,其中所述检测包括用特异性荧光dna报告子检测所述经过扩增的核酸。

46.根据权利要求1到45中任一项所述的方法,其中所述检测包括检测所述单细胞的所述核酸组合物中的单核苷酸多态性。

47.根据权利要求1到46中任一项所述的方法,其中所述分离、所述裂解、所述扩增和所述检测都在单一、连续的通道网络中发生。

48.根据权利要求1到47中任一项所述的方法,其中所述分离在所述裂解之前发生,所述裂解在所述扩增之前发生,和/或所述扩增在所述检测之前发生。

49.根据权利要求1到48中任一项所述的方法,其中在所述裂解、所述扩增和所述检测的整个过程中及其之间,所述液滴保持基本恒定的体积。

50.根据权利要求1到49中任一项所述的方法,其中所述裂解、所述扩增和所述检测都在于所述分离后不稀释所述液滴、不向所述液滴添加另外的试剂和/或不从所述液滴中去除试剂或液体的情况下发生。

51.一种根据权利要求21到40中任一项所述的聚合酶依赖性核酸逻辑门。

52.一种用于执行根据权利要求1到50中任一项所述的方法的系统。


技术总结
对单细胞的核酸组合物进行谱分析的方法和用于所述方法的工具。所述方法可以包含在液滴中分离单细胞,在所述液滴中裂解所述单细胞以从所述细胞释放模板核酸,在所述液滴中扩增所述模板核酸以产生经过扩增的核酸,以及在所述液滴中检测所述经过扩增的核酸。所述方法可用于对表达模式进行谱分析和/或检测如单核苷酸多态性等遗传特征。所述工具包含核酸逻辑门,包含聚合酶依赖性逻辑门。所述逻辑门可以执行如是、非、与、或、与非、非与、非或、异或、同或和蕴涵等逻辑运算。所述工具还包含用于执行所述方法的微流体系统。

技术研发人员:P·A·罗梅罗;L·B·海曼
受保护的技术使用者:威斯康星校友研究基金会
技术研发日:2019.03.06
技术公布日:2020.10.27
当前第2页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1