基于载体VTvaf17的基因治疗的制作方法

文档序号:25541913发布日期:2021-06-18 20:38

技术特征:

1.基于基因治疗dna载体vtvaf17的基因治疗dna载体,用于治疗与骨发生,骨和软骨组织形成和再生的障碍相关的疾病,用于改善骨植入物的骨诱导,经由增加人和动物中的col1a1治疗性基因的表达来实现,所述疾病由如下引起:包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节,间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化,胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少,尤其包括在骨折的情况下,骨的脆性增加,骨矿化的减少,其中基因治疗dna载体具有克隆到基因治疗dna载体vtvaf17的col1a1治疗性基因的编码区,从而产生具有核苷酸序列seqidno.1的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1。

2.基于基因治疗dna载体vtvaf17的基因治疗dna载体,用于治疗与骨发生,骨和软骨组织形成和再生的障碍相关的疾病,用于改善骨植入物的骨诱导,以及作为基于旨在降低异位骨化风险的重组成骨因子的药物的替代方案,经由增加人和动物中的col1a2治疗性基因的表达来实现,所述疾病由如下引起:包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节,间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化,胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少,尤其包括在骨折的情况下,骨的脆性增加,骨矿化的减少,其中基因治疗dna载体具有克隆到基因治疗dna载体vtvaf17的col1a2治疗性基因的编码区,从而产生具有核苷酸序列seqidno.2的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2。

3.基于基因治疗dna载体vtvaf17的基因治疗dna载体,用于治疗与骨发生,骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病,用于改善骨植入物的骨诱导,以及作为基于旨在降低异位骨化风险的重组成骨因子的药物的替代方案,经由增加人和动物中的bmp2治疗性基因的表达来实现,所述疾病由如下引起:包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节,间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化,胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少,尤其包括在骨折的情况下,骨的脆性增加,骨矿化的减少,其中基因治疗dna载体具有克隆到基因治疗dna载体vtvaf17的bmp2治疗性基因的编码区,从而产生具有核苷酸序列seqidno.3的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2。

4.基于基因治疗dna载体vtvaf17的基因治疗dna载体,用于治疗与骨发生,骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病,用于改善骨植入物的骨诱导,以及作为基于旨在降低异位骨化风险的重组成骨因子的药物的替代方案,经由增加人和动物中的bmp7治疗性基因的表达来实现,所述疾病由如下引起:包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节,间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化,胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少,尤其包括在骨折的情况下,骨的脆性增加,骨矿化的减少,其中基因治疗dna载体具有克隆到基因治疗dna载体vtvaf17的bmp7治疗性基因的编码区,从而产生具有核苷酸序列seqidno.4的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的携带col1a1、col1a2、bmp2或bmp7治疗性基因的基于基因治疗dna载体vtvaf17的基因治疗dna载体,所述基因治疗dna载体由于以下事实而是独特的:构建的基因治疗dna载体:根据权利要求1、2、3或4所述的vtvaf17-col1a1,或vtvaf17-col1a2,或vtvaf17-bmp2,或vtvaf17-bmp7的每一个由于不超过3200bp的vtvaf17载体的受限的大小,具有有效地渗透到人和动物细胞中并表达克隆到其中的col1a1、col1a2、bmp2或bmp7治疗基因的能力。

6.根据权利要求1、2、3或4所述的携带col1a1、col1a2、bmp2或bmp7治疗性基因的基于基因治疗dna载体vtvaf17的基因治疗dna载体,所述基因治疗dna载体由于以下事实而是独特的:创建的基因治疗dna载体,即根据权利要求1、2、3或4所述的vtvaf17-col1a1,或vtvaf17-col1a2,或vtvaf17-bmp2,或vtvaf17-bmp7的每一个使用并非抗生素抗性基因、病毒基因或病毒基因组调控元件的核苷酸序列,所述核苷酸序列确保其安全用于人和动物中的基因治疗。

7.生产根据权利要求1、2、3或4所述的携带col1a1、col1a2、bmp2或bmp7治疗性基因的基于基因治疗dna载体vtvaf17的基因治疗dna载体的方法,其涉及如下获得基因治疗dna载体的组,即vtvaf17-col1a1,或vtvaf17-col1a2,或vtvaf17-bmp2,或vtvaf17-bmp7的每一个:将根据权利要求1、2、3或4所述的col1a1,或col1a2,或bmp2,或bmp7治疗性基因的编码区克隆到dna载体vtvaf17,并分别获得基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1,seqidno.1,或vtvaf17-col1a2,seqidno.2,或vtvaf17-bmp2,seqidno.3,或vtvaf17-bmp7,seqidno.4,其中通过将总rna从人生物组织样品分离,随后使用特异性寡核苷酸进行逆转录反应和pcr扩增,并通过限制性内切核酸酶切割扩增产物获得col1a1、col1a2、bmp2或bmp7治疗性基因的编码区,并在nhei和hindiii限制性位点处克隆到所述基因治疗dna载体vtvaf17,其中在不存在抗生素的情况下进行选择;

同时构建基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1,seqidno.1用于逆转录反应和pcr扩增,以下寡核苷酸用作构建的寡核苷酸:

col1a1_fccagctagcgtctagggtctagacatgttc,

col1a1_rtataagcttctacaggaagcagacagggccaac,

并且使用nhei和hindiii限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割及将所述col1a1基因的编码区克隆到dna载体vtvaf17,

其中构建基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2,seqidno.2用于逆转录反应和pcr扩增,以下寡核苷酸用作构建的寡核苷酸:

col1a2_fccagctagcgtctaagtgctagacatgctc,

col1a2_rcgaagcttttatttgaaacagactgggcca,

并且使用nhei和hindiii限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割及将所述col1a2基因的编码区克隆到dna载体vtvaf17,

其中构建基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2,seqidno.3用于逆转录反应和pcr扩增,以下寡核苷酸用作构建的寡核苷酸:

bmp2_facagctagcctcctaaaggtccaccatggt,

bmp2_rtataagcttctagcgacacccacaaccct,

并且使用nhei和hindiii限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割及将所述bmp2基因的编码区克隆到dna载体vtvaf17,

其中构建基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7,seqidno.4用于逆转录反应和pcr扩增,以下寡核苷酸用作构建的寡核苷酸:

bmp7_ftcagctagcgtagagccggcgcgatgca,

bmp7_rtataagcttctagtggcagccacaggc,

并且使用nhei和hindiii限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割及将所述bmp7基因的编码区克隆到dna载体vtvaf17。

8.使用根据权利要求1、2、3或4所述的携带col1a1,或col1a2,或bmp2,或bmp7治疗性基因的基于基因治疗dna载体vtvaf17的基因治疗dna载体经由增加人和动物中的col1a1,或col1a2,或bmp2,或bmp7治疗性基因的表达来治疗与骨发生,骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病,用于改善骨植入物的骨诱导,以及作为基于旨在降低异位骨化风险的重组成骨因子的药物的替代方案的方法,所述疾病由如下引起:包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节,间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化,胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少,尤其包括在骨折的情况下,骨的脆性增加,骨矿化的减少,所述方法涉及用选择的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体或若干选择的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体或构建的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体转染人或动物器官和组织的细胞,和/或将所述患者或动物的人或动物自体细胞注射到人或动物器官和组织中,所述细胞用选择的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体或若干选择的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体或构建的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体转染,和/或用选择的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体或若干选择的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体或构建的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体注射所述患者或动物的器官和组织,或所示方法的组合。

9.生产用于构建根据权利要求1、2、3或4所述的基因治疗dna载体的方法,所述基因治疗dna载体经由增加人和动物中的col1a1,或col1a2,或bmp2,或bmp7治疗性基因的表达来治疗与骨发生,骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病,用于改善骨植入物的骨诱导,以及作为基于旨在降低异位骨化风险的重组成骨因子的药物的替代方案,所述疾病由如下引起:包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节,间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化,胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少,尤其包括在骨折的情况下,骨的脆性增加,骨矿化的减少,所述方法涉及制备大肠杆菌菌株scs110-af的电感受态细胞,并对这些细胞进行基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1,或dna载体vtvaf17-col1a2,或dna载体vtvaf17-bmp2,或dna载体vtvaf17-bmp7的电穿孔,之后将所述细胞倒入具有选择性培养基的琼脂平板(培养皿)中,所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6%蔗糖和10μg/ml氯霉素,结果获得了大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a1,或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a2,或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp2,或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp7。

10.根据权利要求9所述获得的大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a1,其携带所述基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1用于其产生,允许在所述基因治疗dna载体生产期间的无抗生素选择,所述基因治疗dna载体用于治疗与骨发生,骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病,用于改善骨植入物的骨诱导,以及作为基于旨在降低异位骨化风险的重组成骨因子的药物的替代方案,所述疾病由如下引起:包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节,间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化,胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少,尤其包括在骨折的情况下,骨的脆性增加,骨矿化的减少。

11.根据权利要求9所述获得的大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a2,其携带所述基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2用于其产生,允许在所述基因治疗dna载体生产期间的无抗生素选择,其用于治疗与骨发生,骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病,用于改善骨植入物的骨诱导,以及作为基于旨在降低异位骨化风险的重组成骨因子的药物的替代方案,所述疾病由如下引起:包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节,间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化,胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少,尤其包括在骨折的情况下,骨的脆性增加,骨矿化的减少。

12.根据权利要求9所述获得的大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp2,其携带所述基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2用于其产生,允许在所述基因治疗dna载体生产期间的无抗生素选择,其用于治疗与骨发生,骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病,用于改善骨植入物的骨诱导,以及作为基于旨在降低异位骨化风险的重组成骨因子的药物的替代方案,所述疾病由如下引起:包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节,间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化,胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少,尤其包括在骨折的情况下,骨的脆性增加,骨矿化的减少。

13.根据权利要求9所述获得的大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp7,其携带所述基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7用于其产生,允许在所述基因治疗dna载体生产期间的无抗生素选择,其用于治疗与骨发生,骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病,用于改善骨植入物的骨诱导,以及作为基于旨在降低异位骨化风险的重组成骨因子的药物的替代方案,所述疾病由如下引起:包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节,间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化,胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少,尤其包括在骨折的情况下,骨的脆性增加,骨矿化的减少。

14.在工业规模上生产根据权利要求1、2、3或4所述的携带col1a1、col1a2、bmp2或bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17的方法,所述基因治疗dna载体用于治疗与骨发生,骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病,用于改善骨植入物的骨诱导,以及作为基于旨在降低异位骨化风险的重组成骨因子的药物的替代方案,所述疾病由如下引起:包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节,间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化,胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少,尤其包括在骨折的情况下,骨的脆性增加,骨矿化的减少,所述方法涉及通过以下步骤生产基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1,或基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2,或基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2,或基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7:用选自大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a1,或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a2,或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp2,或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp7的种子培养物接种含有准备培养基的培养瓶,然后在培养箱振荡器中温育细胞培养物并将其转移至工业发酵罐,然后生长至静止期,然后提取含有靶dna产物的级分,进行多级过滤并通过层析方法进行纯化。


技术总结
基于下述基因治疗DNA载体产生基因治疗DNA载体,所述基因治疗DNA载体用于治疗与骨发生、骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病,在骨折的情况下,包括骨的脆性增加,骨矿化的减少,用于改善骨植入物的骨诱导。基因治疗DNA载体含有COL1A1、COL1A2、BMP2或BMP7治疗基因的编码区。产生或使用携带治疗性基因的基因治疗DNA载体的方法。通过上述携带基因治疗DNA载体VTvaf17‑COL1A1、VTvaf17‑COL1A2、VTvaf17‑BMP2或VTvaf17‑BMP7的方法获得大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑COL1A1、SCS110‑AF/VTvaf17‑COL1A2、SCS110‑AF/VTvaf17‑BMP2或SCS110‑AF/VTvaf17‑BMP7。产生携带COL1A1,或COL1A2,或BMP2,或BMP7治疗性基因的基因治疗DNA载体的方法以工业规模使用。

技术研发人员:N.萨韦利瓦;V.N.拉扎雷夫;G.V.什马里纳
受保护的技术使用者:阿莱尔特森特尔创新生物技术有限责任公司;普罗里夫涅创新技术有限责任公司;细胞基因治疗有限公司
技术研发日:2019.08.14
技术公布日:2021.06.18
再多了解一些
当前第2页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1