花期基因及其使用的方法与流程

1.本公开发明涉及到植物育种和遗传学领域，还涉及到对调控植物开花期和/或抽穗期有用的重组dna构建体，以及控制植物开花期、抽穗期和/或成熟期的方法。
2.研究背景
3.水稻的生育期通常包括营养生长期和生殖生长期。从营养生长到生殖生长的转变受到多种开花信号的影响。开花信号又受到多种因素的影响，如遗传因素(如基因型)和环境因素(如光照周期和光照强度)(dung等,theoretical and applied genetics,97:714-720(1998))。
4.植物的开花期或者抽穗期是一个重要的农艺性状，也是植物分布和区域适应性的一个关键决定性因素。加速或延缓开花对于农民和种子生产者都是有用的。
5.相应地，需要开发新的组合物和方法来改变目标植物的开花特性(例如，在较温暖的气候区，谷物、水稻和玉米，以及在温度较高的气候区，小麦、大麦、燕麦和黑麦)。本发明提供了此类组合物和方法。
6.发明概述
7.以下实施例是本发明所涵盖的实施例之一：
8.在一个实施例中，本公开发明包括一个分离的多核苷酸，编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127有至少90％的序列一致性，增加植物中该多核苷酸的表达能延缓开花时间。在某些实施例中，所述分离的多核苷酸编码的氨基酸序列为seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127。在某些实施例中，所述分离的多核苷酸包含的核苷酸序列为seq id no:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124或126。在某些实施例中，增加植物中该多核苷酸的表达会延缓植物的成熟。
9.本公开发明还提供了一种重组dna构建体，其包含有一个可操作地连接至少一个异源调控元件的分离的多核苷酸，该多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127有至少90％的序列一致性。
10.本公开发明进一步提供了一种改良的植物或种子，其编码多肽的至少一种多核苷酸的表达或活性是增加的，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述改良植物或种子在其基因组中含有一个重组dna构建体，该重组dna构建体中包含一个可操作地连接至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的多肽的
氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述改良植物与在同样的田间生长条件下的对照植物相比较时，表现出延缓的开花时间和/或成熟期。
11.在某些实施例中，所述改良植物或种子在其基因组位点上含有一个靶向基因修饰，该靶向基因修饰的基因组位点上含有的一个多核苷酸所编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127有至少90％的序列一致性。其中所述靶向基因修饰提高了所述多肽的表达量和/或活性。在某些实施例中，当与田间种植条件下的对照植物相比较时，所述改良的植物表现出开花时间的延缓和晚熟。
12.本公开发明进一步提供了一种改良的植物或种子，其具有至少一个编码多肽的多核苷酸的表达量或活性的降低，该多肽含有的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述改良的植物或种子在其基因组中包含有一个rnai构建体，以靶向一个编码多肽的多核苷酸，该多肽含有的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127有至少80％的序列一致性。在某些实施例中，当与田间生长条件下的对照植物相比较时，所述改良的植物表现出早开花和/或早熟的性状。
13.在某些实施例中，在其基因组位点上含有一个靶向基因修饰的改良植物或种子，所述靶向基因修饰的基因组位点上包含有一个编码多肽的多核苷酸。所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127有至少90％的序列一致性，其中所述靶向基因修饰减少了该多肽的表达和/或活性。在某些实施例中，当与田间生长条件下的对照植物相比较时，所述改良的植物表现出早开花和/或早熟的性状。
14.在某些实施例中，用于本文提供的组合物和方法的植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小米、甘蔗和柳枝稷。
15.还提供了一种延缓植物开花时间的方法，该方法包括增加至少一个编码多肽的多核苷酸的表达，植物中所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127有至少90％的序列一致性，其中所述植物与对照植物相比较时，表现出晚开花的性状。
16.在某些实施例中，延缓开花时间的方法包括：(a)向可再生植物细胞引入一个重组dna构建体，该重组dna构建体含有一个多核苷酸可操作地连接至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127相比较时有至少80％的序列一致性；和(b)再生
所述植物，该植物在其基因组中包含有所述重组dna构建体。
17.在某些实施例中，延缓开花时间的方法包括：(a)向一个可再生植物细胞的基因组位点上引入一个靶向基因修饰，该靶向基因修饰的基因组位点上含有的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127相比较时有至少80％的序列一致性；和(b)再生所述植物，该植物在其基因组中包含有所述引入的基因修饰，并提高了所述多肽的表达和/或活性。在某些实施例中，所述靶向基因修饰可以使用以下基因技术被引入：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、工程化位点特异性巨核酸酶或argonaute。在某些实施例中，所述靶向基因修饰存在于基因组位点的(a)编码区；(b)非编码区；(c)调控序列；(d)非翻译区；(e)任何(a)-(d)的组合，以编码含有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127相比较时有至少80％的序列一致性。
18.还提供了能够加速植物开花时间的方法，该方法包括减少至少一种编码多肽的多核苷酸的表达量，所述植物多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127有至少90％的序列一致性，其中该植物在与对照植物相比较时表现出早开花的性状。
19.在某些实施例中，加速开花时间或早熟的方法包括：(a)向可再生植物细胞引入一个包含有发夹结构多核苷酸的rnai构建体，该多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127相比较时有至少80％的序列一致性；和(b)再生所述植物，该植物在其基因组中包含有引入的基因修饰，并能够减少多肽的表达和/或活性。
20.在某些实施例中，加速开花时间的方法包括：(a)向一个可再生植物细胞的基因组位点上引入一个靶向基因修饰，该靶向基因修饰的基因组位点上包含有能编码多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127相比较时有至少80％的序列一致性；和(b)再生所述植物，该植物在其基因组包含有引入的基因修饰，并能减少所述多肽的表达和/或活性。
21.在某些实施例中，所述靶向基因修饰可以使用以下基因修饰技术被引入：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、工程化位点特异性巨核酸酶或argonaute。在某些实施例中，所述靶向基因修饰存在于基因位点的(a)编码区；(b)非编码区；(c)调控序列；(d)非翻译区；(e)任何(a)-(d)的组合，以编码含有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127相比较时有至少80％的序列一致性。
22.附图说明和序列表
23.通过以下详细描述和构成本技术一部分的随附序列列表，可以更全面地理解本发明。此处所附的序列描述和序列列表符合37c.f.r.
§§
1.821和1.825中规定的专利申请中核苷酸和氨基酸序列披露规则。序列描述包括37c.f.r.
§§
1.821和1.825中定义的氨基酸的三个字母代码，通过引用并入本文。
24.表1.序列表详述
25.[0026][0027]
详细信息
[0028]
本文件所述各参考文献全部通过引用并入本文件。
[0029]
如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用。因此，例如，对“植物”的引用包括多个这样的植物；对“细胞”的引用包括本领域技术人员已知的一个或多个细胞及其等效物，等等。
[0030]
定义
[0031]“开花时间”在本文中也称为“始穗日”，是指从播种到植株第一穗抽出的日期和/或50％抽穗日期的天数。始穗日是第一个圆锥花序(通常是主茎圆锥花序)伸出旗叶鞘的日期；50％抽穗期是指同一株系中一行植株50％的幼穗伸出旗叶鞘的日期。
[0032]
植物的“晚开花或延缓开花时间”是指在相同条件下生长时，相对于参照植物或对照植物，开花时间的任何可测量的延缓。
[0033]
植物的“早开花或加速开花时间”指在相同条件下生长时，相对于参照或对照植物，开花时间的任何可测量的减少。
[0034]“成熟期”是90％颖壳、粒-小穗轴或副颖壳从外观上变黄的日期，这是最佳收获期。
[0035]“农艺性状”是可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色量、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序的大小、早期苗的活力和低温胁迫下的出苗状况。
[0036]“转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组dna构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物。例如一个重组dna构建体，包括最初的转基因事件以及由最初转基因事件产生的有性杂交或无性繁殖产生的事件。本文使用的术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或自然发生的事件(如随机交叉受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座)改变基因组(染色体或额外染色体)，或自发突变。
[0037]“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代。例如，除了导致测试植物或细胞的遗传改变之外，对照植物可以和测试植物具有相同的遗传背景。
[0038]“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及该植株的子代。植物细胞包括但不限于来自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
[0039]“子代”包括植物的任何后续世代。
[0040]“改良植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸或修饰基因或启动子的植物。例如，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内，使得该多核苷酸被传递到连续世代。异源多核苷
酸可单独或作为重组dna构建物的一部分整合到基因组中。
[0041]
关于序列的“异源”意思是来源于外来物种的序列，或者，如果来自同一物种，在组成和/或基因组位置上通过人为干预对其天然的组成形式进行了实质性的修改。
[0042]“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链rna或dna聚合物。核苷酸(通常以它们的5
′‑
单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“a”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应rna或dna)，“c”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“g”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“u”表示尿苷酸，“t”表示脱氧胸苷酸，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“i”表示肌苷，并且“n”表示任何核苷酸。
[0043]“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和adp-核糖基化。
[0044]“重组dna构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组dna构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
[0045]“调控元件”指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。
[0046]“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。“植物中有功能启动子”是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
[0047]“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
[0048]
rna干扰(rnai)指由短干扰rna(sirna)介导的动物序列特异性转录后基因沉默过程(fire等、nature、391:806(1998))。植物中相应的过程通常被称为转录后基因沉默(ptgs)或rna沉默，在真菌中也被称为抑制。转录后基因沉默的过程被认为是一种进化上保守的细胞防御机制，用于防止外源基因的表达，并被不同的植物区系和门共同分享(fire等、trends genet.15:358(1999))。
[0049]
rnai构建体包含的核酸能靶向并降低目的基因的表达，包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、干环抑制构建体、双链rna产生构建体、sirna构建体，mirna的构建。
[0050]“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mrna或功能rna)和/或rna翻译成前体或成熟蛋白质。
[0051]
在本文中，“增加”、“增多”等是指实验组(例如，具有本文所述dna修饰的植物)与对照组(例如，不包含dna修饰的野生型植物)相比的任何可检测到的增加。因此，蛋白质的增加表达包括样品中蛋白质总水平的任何可检测的增加，并且可以使用本领域的常规方法(例如，western blotting和elisa)来确定。
[0052]
在本文中，“减少”、“降低”等指实验组(例如，具有本文所述dna修饰的植物)与对照组(例如，不包含dna修饰的野生型植物)相比的任何可检测到的减少。因此，蛋白质表达的降低包括样本中蛋白质总水平的任何可检测的降低，并且可以使用本领域的常规方法(例如，western blotting和elisa)来确定。
[0053]
在本文中，“产量”指每单位土地收获的农业产量，可包括收获时作物每英亩蒲式耳或每亩千克数，并根据谷物水分进行调整(例如，玉米通常为15％，水稻为13.5％)。谷物水分是在谷物收获时测量的。谷物的调整试验重量确定为每蒲式耳磅或每株克的重量，并根据收获时的谷物水分水平进行调整。
[0054]
在本文中，在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，“序列一致性”或“一致性”指当在指定的比较窗口上对齐以获得最大对应性时相同的两个序列中的残基。当序列同一性百分比用于蛋白质时，人们认识到，不完全相同的残基位置往往因保守的氨基酸替换而不同，氨基酸残基被具有类似化学性质(如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能性质。当序列在保守替换中不同时，可向上调整序列一致性百分比，以纠正替换的保守性质。通过这种保守替换而不同的序列称为“序列相似性”或“相似性”。进行此调整的方法为本领域技术人员所熟知。通常，这涉及将保守替换作为部分不匹配而不是完全不匹配进行评分，从而增加序列一致性的百分比。因此，例如，如果相同氨基酸的得分为1，非保守替代的得分为0，保守替代的得分为0到1之间。计算保守替换的得分，例如，在pc/gene(intelligenetics,mountain view,california)计划中实施。
[0055]“序列一致性百分比(％)”是经过序列比对和引入缺口后，待测序列的序列一致性计算包括，将两个序列中相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数目，获得匹配位置数，然后将匹配的位置数除以比对窗口中位置总数再乘以100。
[0056]
除非另有说明，本文提供的序列的多重比对是使用clustal v比对方法(higgins and sharp.(1989)cabios,5:151-153)进行的，具有默认参数(间隙惩罚＝10，间隙长度惩罚＝10)。使用clustal v方法进行成对比对和氨基酸序列同一性百分比计算的默认参数为k倍数＝1，间隙惩罚＝3，窗口＝5，对角线保存＝5。对于核酸，这些参数为k倍数＝2，间隙惩罚＝5，窗口＝4，对角线保存＝4。序列对齐后，使用clustal v程序，通过查看同一程序上的“序列距离”表，可以获得“一致性百分比”和“散度”值；除非另有说明，否则本文中提供和声明和分歧百分比是以这种方式计算的。
[0057]
组合物
[0058]
多核苷酸和多肽
[0059]
本公开文件提供了一种编码以下多肽的多核苷酸：his(核心组蛋白h2a/h2b/h3/h4，推定，表达)，dn-ftg1(表达蛋白)，wrky76(wrky76,表达)，myb77(myb转录因子tamyb1,推定,表达)，dn-ftg2(表达蛋白)，ena1(外切核酸酶，推定，表达)，grf1(生长调节因子，推定，表达)，hip14(锌指，c3hc4类型结构域蛋白，表达)，以及dn-ftg3(表达蛋白)。
[0060]
一方面本公开文件提供了一种编码多肽的多核苷酸，该多肽的氨基酸序列与任一
mol.biol.，12:619-632和christensen等人，(1992)plant mol.biol.，18:675-689)；pemu(last等,(1991)theor.appl.genet.,81:581-588)；mas(velten等,(1984)embo j.,3:2723-2730)；als启动子(美国专利号5659026)等。其他组成型启动子包括，例如，美国专利号5608149、5608144、5604121、5569597、5466785、5399680、5268463、5608142、和6177611。
[0075]
组织特异性或发育调控启动子是一种dna序列，能够选择性调节植物细胞/组织中dna序列的表达。例如在这些细胞/组织中至关重要的雄穗发育、种子形成或两者都有的生长发育时期，通常将dna序列的表达限制在植物中所需的发育期(如雄穗发育或种子成熟)。可在本发明的方法中使用会引起所需时间和空间表达的任何可识别的启动子。
[0076]
许多叶片优选启动子在本领域内是已知的(yamamoto等,(1997)plant j.,12(2):255-265；kwon等,(1994)plant physiol.,105:357-367；yamamoto等、(1994)plant cell physiol.、35(5):773-778；gotor等、(1993)plant j.、3:509-518；orozco等、(1993)plant mol.biol.,23(6):1129-1138；and matsuoka等、(1993)proc.natl.acad.sci.usa、90(20):9586-9590)。
[0077]
种子或胚胎特异性的启动子，在本发明中可能有用，包括大豆kunitz胰蛋白酶抑制子(kti3，jofuku和goldberg.，(1989)plant cell,1:1079-1093)、豌豆球蛋白convicilin、vicilin和legumin(豌豆子叶)(rerie，w.g.，等(1991)mol.genet.,259:149-157；newbigin、e.j.等(1990)planta、180:461-470；higgins、t.j.v.等人(1988年)plant.mol.biol.,11:683-695)、玉米醇溶蛋白(玉米胚乳)(schemthaner，j.p.等,(1988)embo j.,7:1249-1255)，菜豆子叶(segupta-gopalan、c.等,(1985)proc.natl.acad.sci.,82:3320-3324)、植物血凝素(豆子叶)(voelker、t.等(1987)embo j.6:3571-3577)，b-伴甘氨酸和甘氨酸(豆子叶)(chen，z-l，等(1988)embo j.7:297-302)，谷蛋白(水稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(marris，c.，等(1988)plant mol.biol.,10:359-366)、麦谷蛋白和醇溶蛋白(小麦胚乳)(colot，v.，等,(1987)embo j.、6:3559-3564)。与嵌合基因结构中异源编码区可操作连接的种子特异基因的启动子在转基因植物中保持其时空表达模式。这些例子包括在拟南芥和甘蓝型油菜种子中表达脑啡肽的拟南芥2s种子贮藏蛋白基因启动子(vanderkerckhove等(1989)bio/technology 7:l929-932)、表达荧光素酶的大豆凝集素和大豆β-豆素启动子(riggs等(1989)plant sci.、63:47-57)，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(colot等人(1987)embo j 6:3559-3564)。
[0078]
可诱导启动子选择性表达可操作连接的dna序列，以响应内源性或外源性刺激的存在，例如通过化合物(化学诱导物)或响应环境、激素、化学和/或发育信号。可诱导或调节的启动子包括，例如，受光、热、应激、洪水或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酸、水杨酸或安全剂等化学物质调节的启动子。
[0079]
还有合成启动子，其包括一种或多种异源调节元件的组合。
[0080]
本发明的重组dna构建体的启动子可以是本领域已知的任何类型或类别的启动子，从而可以使用多个启动子中的任何一个来表达本文公开的各种多核苷酸序列，包括期望的多核苷酸序列的天然启动子。可基于期望结果选择用于本发明重组dna构建体中的启动子。
[0081]
本发明的重组dna构建体还可包括其他调控元件，包括但不限于翻译先导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。在某些实施例中，重组dna构建体进一步包含增强子或沉默子。
[0082]
可将内含子序列添加到5'-非翻译区、蛋白质编码区或3'-非翻译区，以增加积累在细胞质中的成熟信息量。在植物和动物表达结构的转录单元中加入可剪接的内含子已被
证明可以在mrna和蛋白质水平上将基因表达提高1000倍(buchman和berg.,(1988)mol.cell biol.、8:4395-4405；callis等人(1987)genes dev.、1:1183-1200)。
[0083]
植物和植物细胞
[0084]
提供的植物、植物细胞、植物部分、种子和籽粒，在其基因组中含有任何本文描述的重组dna构建体，因而所述植物、植物细胞、部分植物、种子和/或籽粒具有增加的编码多肽的表达。在某些实施例中，所述植物与对照植物相比较时，表现出开花时间的延缓。在某些实施例中，所述植物与对照植物相比较时表现出至少一种农艺性状的改变。
[0085]
还提供了在其基因组位点上包含有一种引入的基因修饰的植物、植物细胞、部分植物、种子和籽粒，使其编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127这些氨基酸序列相比较时有至少80％的一致性。在某些实施例中，该基因修饰增加了编码多肽的活性。在某些实施例中，该基因修饰增加了编码多肽的水平。在某些实施例中，该基因修饰同时增加了编码多肽的水平和活性。在某些实施例中，所述植物与对照植物相比较时，表现出开花时间的延缓。在某些实施例中，所述植物与对照植物相比较时表现出至少一种农艺性状的改变。
[0086]
进一步提供了植物、植物细胞、部分植物、种子和籽粒，在其基因组内含有rnai构建体以靶向编码多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列与来自于seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127这些氨基酸序列的，该rnai构建体降低了编码多肽的表达。在某些实施例中，所述植物与对照植物相比较时，开花时间明显加速。在某些实施例中，所述植物与对照植物相比较时表现出至少一种农艺性状的改变。
[0087]
还提供了一种植物、植物细胞、部分植物、种子和籽粒，在其基因组位点上引入一个靶向基因修饰，该基因组位点上包含一个编码多肽，该多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127这些氨基酸序列有至少80％的一致性，其中所述基因修饰减少了编码多肽的表达水平和/或活性。在某些实施例中，所述基因修饰降低了编码多肽的活性。在某些实施例中，所述基因修饰减少了编码多肽的表达水平。在某些实施例中，所述基因修饰同时降低了编码多肽的表达水平和活性。在某些实施例中，所述植物与对照植物相比较时，加速了开花时间。在某些实施例中，所述植物在与对照植物相比较时表现出农艺性状的改变。
[0088]
所述植物可以是单子叶植物或双子叶植物，例如，水稻或玉米或大豆植物，例如玉米杂交植株或玉米自交植株。所述植物还可以是向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小米、甘蔗或柳枝稷。
[0089]
其它目的性状的堆叠
[0090]
在某些实施例中，本文中发明的多核苷酸被设计成一种分子堆叠。这样，本文所述的多种宿主细胞、植物、植物细胞、植物部分、种子和/或籽粒能进一步包含一个或多个期望的性状。在某些实施例中，这些宿主细胞、植物、部分植物、种子和/或籽粒可以任何多核苷酸序列的组合形式进行堆叠，以产生具有期望性状组合的植物。如本文所用，术语“堆叠”是指在同一植物或有机体中具有多种性状。例如，“性状堆叠”可以包含一种序列在物理上互
相毗邻的分子堆叠。在本文中，性状是指来自于特定序列或序列组的表型。在一个实施例中，分子堆叠包括至少一个能赋予草甘膦耐性的多核苷酸。这种赋予草甘膦耐性的多核苷酸在领域内是已知的。
[0091]
在某些实施例中，分子堆叠包含至少一个赋予草甘膦耐性的多核苷酸和至少一个赋予第二除草剂耐性的附加的多核苷酸。
[0092]
在某些实施例中，含有本发明的多核苷酸序列的植物、植物细胞、种子和/或籽粒可以被和一种或多种赋予以下耐性的序列进行堆叠，例如：肌萎缩侧索硬化抑制剂；hppd抑制剂；2,4-d；其他苯氧基生长素除草剂；芳氧基苯氧基丙酸除草剂；麦草畏；草铵膦除草剂；针对protox酶的除草剂(也称为“protox抑制剂”)。
[0093]
含有本发明的多核苷酸序列的植物、植物细胞、植物部分、种子和/或籽粒还能与至少一个其它性状相结合以产生进一步包含有多种期望的性状组合的植物。例如，具有本发明多核苷酸序列的植物、植物细胞、植物部分、种子和/或籽粒可与编码具有杀虫和/或杀虫活性的多肽的多核苷酸进行堆叠，或植物、植物细胞、植物部分、种子和/或具有本发明多核苷酸序列的籽粒可与植物抗病基因结合。
[0094]
这些堆叠组合可以使用任何方法来创建，包括但不限于，使用任何常规育种，或基因转化。如果所述序列通过对植物进行基因转化而堆叠的，该目的多核苷酸序列能够在任何时间以任何顺序进行结合。这些性状可以在共转化方案中与任何转化盒组合提供的相关多核苷酸同时引入。例如，如果两个序列将被引入，这两个序列可以被包含在单独的转化盒(trans)或包含在相同的转化盒(cis)中。该序列的表达受到相同启动子或不同启动子的驱动。在某些情况下，也可以期望引入一个转化盒来抑制目标多核苷酸的表达。可以与任何其它抑制盒或过表达盒的组合进行结合，以产生植物中期望性状的组合。需要进一步认识到，多核苷酸序列能使用位点特异性重组方法在所需的基因位点上进行堆叠。参见，例如，wo99/25821、wo99/25854、wo99/25840、wo99/25855和wo99/25853，以上均通过引用并入本文。
[0095]
方法
[0096]
提供了一种延缓开花时间和/或晚熟的方法，包括增加至少一个编码多肽的多核苷酸的表达，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127相比较有至少80％(如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性。
[0097]
在某些实施例中，所述方法包括：(a)在可再生植物细胞中表达一个重组dna构建体，该重组dna构建体包含有一个调控元件可操作地连接一个编码多肽的多核苷酸；和(b)再生所述植物，该植物在其基因组中包含有所述重组dna构建体。在某些实施例中，所述调控元件是一个异源启动子。
[0098]
在某些实施例中，该方法包括：(a)向一个可再生的植物细胞的编码所述多肽的基因组位点上引入一个靶向基因修饰；和(b)再生该植物，该植物中编码多肽的水平和/或活性是增加的。在某些实施例中，所述靶向基因修饰可以使用以下基因修饰技术被引入：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、工程化位点特异性巨核酸酶或argonaute。在某些实施例中，所
述靶向基因修饰存在于基因位点的(a)编码区域；(b)非编码区域；(c)调控序列；(d)非翻译区；或(e)任何(a)-(d)的组合，以编码含有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127这些氨基酸序列相比较时有至少80％的一致性。
[0099]
在某些实施例中，所述dna修饰是一个或多个核苷酸，最好是相邻的，插入基因位点。例如，一个表达调节元件(eme)插入可操作连接的基因中，如pct/us2018/025446所描述的。在某些实施例中，所述靶向dna修饰可以用另一种领域内已知的具有高表达的启动子替换内源性多肽启动子。在某些实施例中，所述靶向dna修饰可以插入一个领域内已知的具有高表达的启动子到5’utr，以使内源性多肽的表达受到插入的启动子的控制。在某些实施例中，所述dna修饰是一种优化kozak环境以增加表达的修饰。在某些实施例中，所述dna修饰是一种位点上的多核苷酸修饰或snp，可以调节表达蛋白的稳定性。
[0100]
提供了一种加速植物开花时间和/或早熟的方法，包括减少至少一种编码多肽的多核苷酸的表达，所述多肽含有的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127相比较时有至少80％(如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性。
[0101]
在某些实施例中，所述方法包括：(a)在一个可再生植物细胞中表达一个rnai构建体以减少编码具有氨基酸序列的多肽的多核苷酸的表达，所述氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127有至少80％的序列一致性；和(b)再生所述植物，该植物与对照植物相比，所述多肽的表达量是减少的。
[0102]
在某些实施例中，所述方法包括：(a)向可再生植物细胞的编码所述多肽的基因组位点上引入一个靶向基因修饰；和(b)再生所述植物，该植物编码多肽的表达水平和/或活性是减少的。在某些实施例中，所述靶向基因修饰可以使用以下基因修饰技术被引入：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、工程化位点特异性巨核酸酶或argonaute。在某些实施例中，所述靶向基因修饰存在于基因位点的(a)编码区域；(b)非编码区域；(c)调控序列；(d)非翻译区；或(e)任何(a)-(d)的组合，以编码含有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与选自seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、61、63、65.67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125或127的这些氨基酸序列有至少80％的一致性。
[0103]
使用本发明方法的植物可以是本文中描述过的任何种类的植物。在某些实施例中，所述植物是玉米、大豆或水稻。
[0104]
多种方法能被用于向植物、植物部分、植物细胞、种子和/或籽粒引入一个期望的序列。“引入”在这里是指把本发明的多核苷酸或产生的多肽提供给植物、植物细胞、种子和/或籽粒，使该序列获得进入植物细胞内部的途径。本公开发明的方法不依赖于特定的方法将序列引入植物、植物细胞、种子和/或籽粒，只是单纯的让所述多核苷酸或多肽能够进
入植物的至少一个细胞内部。
[0105]
转化方法是引入多肽或多核苷酸序列到植物中的方法，可以根据转化目标植物或植物细胞(即双子叶植物或单子叶植物)类型的不同而异。合适的引入多肽和多核苷酸到植物细胞的方法包括微量注射(crossway等(1986)biotechniques，4:320-334)、电穿孔(riggs等(1986)proc.natl.acad.sci.usa，83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5563055和美国专利号5981840)、直接基因转移(paszkowski等(1984)embo j.3:2717-2722)，和弹道粒子加速(例如，见美国专利号4945050、美国专利号5879918、美国专利号5886244和美国专利号5932782；tomes等人(1995)，in plant cell、tissue、and organ culture:fundamental methods、编著者gamborg和phillips(berlin，springer-verlag)；mccabe等人(1988)biotechnology 6:923-926)、和lec1转化(wo 00/28058)。另见weissinger等人(1988年ann.rev.genet.，22:421-477；sanford等人(1987)particulate science and technology，5:27-37(洋葱)；christou等人(1988年)plant physiol.，87:671-674(大豆)；mccabe等人(1988)bio/technology 6:923-926(大豆)；finer和mcmullen(1991)in vitro cell dev.biol.，27p:175-182(大豆)；singh等人(1998)theor.appl.genet.，96:319-324(大豆)；datta等人(1990)biotechnology 8:736-740(水稻)；klein等人(1988年)proc.natl.acad.sci.usa，85:4305-4309(玉米)；klein等人(1988)biotechnology 6:559-563(玉米)；美国专利号5240855、5322783及5324646；klein等人(1988)plant physiol.，91:440-444(玉米)；fromm等人(1990)biotechnology 8:833-839(玉米)；hooykaas van slogteren等人(1984)nature(london)311:763-764；美国专利号5736369(谷物)；bytebier等人(1987年)proc.natl.acad.sci.usa，84:5345-5349(百合科)；de wet等(1985)在胚珠组织的实验操作中，编著者chapman等(纽约朗文)，第197-209页(花粉)；kaeppler等(1990)plant cell reports 9:415-418和kaeppler等(1992)theor.appl.genet.，84:560-566(晶须介导的转化)；d'halluin等(1992)plant cell，4:1495-1505(电穿孔)；li等(1993)plant cell reports，12:250-255和christou和ford(1995)annals of botany 75:407-413(水稻)；osjoda等人(1996)《nature biotechnology 14:745-750(玉米和根癌农杆菌)；所有这些都通过引用并入本文。
[0106]
在另一些实施例中，本发明的多核苷酸可以通过病毒或病毒核酸接触被引入植物中。通常，这些方法涉及到在dna或rna分子内结合本发明的核苷酸结构。需要认识到，本发明的多核苷酸序列最初可作为病毒多蛋白的一部分进行人工合成，随后可以在体内或体外通过蛋白质水解处理以产生所需的重组蛋白。进一步，还应认识到本文公开的启动子也包括用于病毒rna聚合酶转录的启动子。向植物引入多核苷酸并在其中表达编码蛋白的方法，涉及到病毒dna或rna分子，这在本领域内是已知的。例如，参见美国专利5889191、5889190、5866785、5589367、5316931和porta等人,(1996)molecular biotechnology，5:209-221。这些文本通过引用并入本文。
[0107]
这些转化的细胞可以按照常规方法生长成为植物。参见mccormick等、(1986)plant cell reports,5:81-84。然后可以生长这些植物，并用相同的转化品种或不同的品种授粉，得到的后代具有所需表型特征的组成型表达。可以种植两代或更多代以确定所需表型特征的表达能够稳定保持和遗传，然后收获的种子也能够确保获得所需的表型特征。以这种方式，本发明提供的转化种子(也称为“转基因种子”)，其具有本文公开的多核苷酸，
作为表达盒的一部分，稳定地并入其基因组中。
[0108]
通过植物转化技术获得的前文讨论的这些转化植物细胞，可以培养再生成整个拥有转化表型(即，发明的多核苷酸)的植株，并获得所需的表型，例如增加的产量。关于玉米的转化和再生，参见gordon-kamm等，(1990)the plant cell，2:603-618。
[0109]
多种方法可以用于向基因位点引入基因修饰，以在植物、部分植物、植物细胞、种子和/或籽粒中编码本文的多肽。在某些实施例中，所述靶向dna修饰通过选自以下的基因修饰技术被引入：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、工程化位点特异性巨核酸酶或argonaute。
[0110]
在一些实施例中，所述基因修饰可以通过在基因组中靠近所需改变的特定位置诱导双链断裂(dsb)或单链断裂来推进。双链断裂(dsb)的诱导能使用任何双链断裂诱导剂进行，包括但不限于，talens、巨核酸酶、锌指核酸酶、cas9-grna系统(基于细菌crispr-cas系统)、引导cpf1核酸内切酶系统，等等。在一些实施例中，双链断裂的引入可以与多核苷酸修饰模板的引入相结合。
[0111]
多核苷酸修饰模板可以通过任何本领域内已知的方法被引入，比如，但不限于，瞬时导入法、转染、电穿孔、微量注射、颗粒介导的递送、局部递送、晶须介导的递送、通过细胞穿透肽的递送或介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)介导的直接递送。
[0112]
所述多核苷酸修饰模板能作为一个单链多核苷酸分子、一个双链多核苷酸分子或作为一个环状dna(载体dna)的一部分被引入细胞。该多核苷酸修饰模板还能被束缚在向导rna和/或cas内切核酸酶上。
[0113]“修饰核苷酸”或“编辑核苷酸”是指与它的未修饰核苷酸序列相比较，包含至少一个改变的目的核苷酸序列。这种“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的删除，(iii)至少一个核苷酸的插入，或(iv)任何(i)-(iii)的组合。
[0114]
术语“多核苷酸修饰模板”包括一个与被编辑的核苷酸序列相比较时含有至少一个核苷酸修饰的多核苷酸。一个核苷酸修饰能被至少一个核苷酸替代、添加或删除。通常，该多核苷酸修饰模板能进一步包含同源核苷酸序列侧翼于至少一个核苷酸修饰，其中该侧翼异源核苷酸序列提供足够的同源物到所需的核苷酸序列用于编辑。
[0115]
编辑结合双链断裂(dsb)和修饰模板的基因组序列的过程通常包括：提供一个宿主细胞，一个双链断裂(dsb)诱导剂，或一个编码双链断裂(dsb)诱导剂的核酸，以识别染色体序列中的靶向序列并能够诱导基因组序列中的双链断裂(dsb)，以及与被编辑的核苷酸序列相比较，含有至少一个核苷酸改变的至少一个多核苷酸修饰模板。该多核苷酸修饰模板能进一步包含至少一个核苷酸改变的核苷酸序列的侧翼序列，其中侧翼序列与双链断裂(dsb)侧翼的染色体区域基本同源。
[0116]
核酸内切酶可以通过任何本领域内已知的方法被提供给细胞，例如，但不限于，瞬时导入法、转染、微量注射和/或局部应用或通过重组结构间接应用。核酸内切酶能作为蛋白或作为向导多核苷酸复合物直接提供给细胞或间接通过重组构建体提供。核酸内切酶通过使用本领域内已知的任何方法能短暂地被引入细胞，或能结合到宿主细胞的基因组。在crispr-cas系统的情况下，如2016年5月12日公开的wo2016073433所述，细胞穿透肽(cpp)可促进内切酶和/或引导多核苷酸进入细胞。
[0117]
除了通过双链断裂技术进行修饰外，还可以使用碱基编辑技术实现一个或多个碱
基的无双链断裂修饰，例如，gaudelli等人，(2017)programmable base editing of a*t to g*c in genomic dna without dna cleavage,nature,551(7681)：464-471；komor等人，(2016)programmable editing of a target base in genomic dna without double-stranded dna cleavage,nature,533(7603)：420-425。
[0118]
这些融合包括dcas9或cas9切口酶以及一个合适的脱氨酶，并且它们可以将，例如胞嘧啶转化为尿嘧啶，而不会导致目标dna的双链断裂。尿嘧啶然后通过dna复制或修复转化为胸腺嘧啶。改进的具有靶向灵活性和特异性的碱基编辑器用于编辑内源基因座以产生靶向变异并提高粮食产量。类似地，腺嘌呤碱基编辑器使腺嘌呤转变为肌苷，然后通过修复或复制转化为鸟嘌呤。因此，使用适当的位点特异性基础编辑器，在一个或多个位置进行有针对性的碱基改变，即c
·
g到t
·
a转换和a
·
t到g
·
c转换。
[0119]
在一个实施例中，碱基编辑是一种能够直接将目标基因组位点上的一个碱基对转变为另一个，且无需双链断裂(dsb)、同源定向修复(hdr)过程或外部供体dna模板的基因编辑方法。在一个实施例中，碱基编辑包括(i)一种催化受损的crispr
–
cas9突变体，其突变使其一个核酸酶结构域不能产生dsb；(ii)单链特异性胞苷/腺嘌呤脱氨酶，在cas9产生的单链dna泡中的适当核苷酸窗口内将c转化为u或a转化为g；(iii)尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)，阻碍尿嘧啶切除和下游过程，降低碱基编辑效率和产品纯度；和(iv)尼克斯酶活性，以切割未编辑的dna链，然后进行细胞dna修复过程以替换含g的dna链。
[0120]
如本文所用，“基因组区域”是细胞基因组中存在于靶位点任一侧的染色体片段，或者也包括靶位点的一部分。所述基因组区域可以包括至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800.5-2900、5-3000、5-3100或更多碱基，使得基因组区域具有足够的同源性以与相应同源区域进行同源重组。
[0121]
tal效应核酸酶(talen)是一类序列特异性核酸酶，可用于在植物或其他生物体基因组中的特定目标序列上进行双链断裂(miller等,(2011)nature biotechnology，29:143
–
148)。
[0122]
核酸内切酶是在多核苷酸链内切割磷酸二酯键的酶。核酸内切酶包括限制性内切酶，其在特定位点切割dna而不损伤碱基；以及巨核酸酶，也称为归巢内切酶(hease)，其与限制性内切酶类似，在特定识别位点结合并切割，但是巨核酸酶的识别位点通常较长，大约18bp或更长(专利申请号pct/us12/30061，于2012年3月22日提交)。根据保守的序列基序，巨核酸酶被分为四个家族，分别是laglidadg、giy-yig、h-n-h和his cys-box家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。hease以其长识别位点和耐受dna底物中的某些序列多态性而著名。巨核酸酶的命名规则与其他限制性内切酶的命名规则相似。对于分别由独立orf、内含子和内含子编码的酶，巨核酸酶也以前缀f-、i-或pi-为特征。重组过程中的一个步骤涉及多核苷酸在识别位点或其附近的切割。解理活性可用于产生双链断裂。关于位点特异性重组酶及其识别位点的综述，见sauer(1994)curr op biotechnol,5:521-7；和sadowski(1993)faseb 7:760-7。在一些例子中，重组酶来自整合酶或分解酶家族。
[0123]
锌指核酸酶(zfns)是由锌指dna结合域和双链断裂诱导剂组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，锌指结构域通常包括两个、三个或四个锌指，
例如具有c2h2结构，然而其他锌指结构是已知的，并且已经改变基因的结构。锌指结构域适于设计特异性结合一个选定的多核苷酸识别序列的多肽。锌指核酸酶(zfn)包括连接到非特异性核酸内切酶结构域的工程dna结合锌指结构域，例如来自iis型核酸内切酶(例如foki)的核酸酶结构域。其他功能可以融合到锌指结合域，包括转录激活域、转录抑制域和甲基化酶。在一些实例中，切割活性需要核酸酶结构域的二聚化。每个锌指识别目标dna中的三个连续碱基对。例如，一个3指结构域识别9个相邻的需要核酸酶二聚化核的苷酸的序列，两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。
[0124]
使用双键断裂(dsb)诱导剂(如cas9-grna复合物)进行基因组编辑已有叙述，例如在2015年3月19日发布的美国专利申请us 2015-0082478 a1、2015年2月26日发布的wo2015/026886a1、2016年1月14日发布的wo2016007347和2016年2月18日发布的wo201625131中，所有这些都通过引用并入本文。
[0125]
实例
[0126]
以下是本发明某些方面的具体实施例的示例。这些实施例仅用于说明目的，并不打算以任何方式限制本发明的范围。
[0127]
实例1
[0128]
晚开花基因的克隆和载体构建
[0129]
使用含有四个来自花椰菜花叶病毒35s(camv 35s)启动子的多聚增强子元件的双元结构，并从四个粳稻品种(中花11、超优1号、台中65和日本晴)开发水稻激活标签群体，按照lin和zhang((2005)plant cell rep.23:540-547)所述，通过农杆菌介导的方法转化。建立转基因株系，收获转基因种子，形成水稻激活标签群体。
[0130]
晚开花标签株系(atls)通过田间重复试验进行验证，并确定了t-dna的插入位点。通过测序法(zastrow-hayes g.m.等、(2015)the plant genome、8:1-15)确定了t-dna在atl株系中的插入位点。克隆该t-dna左右两侧附近的基因，并通过田间筛选重述该功能基因。此处仅显示了重现功能的基因。依据表2所示的loc id和这些基因相应的基因序列，设计引物克隆水稻晚开花基因oshis(使用seq id no:28和29)、osdn-ftg1(使用seq id no:30和31)、oswrky76(使用seq id no:32和33)、osmyb77(使用seq id no:34和35)、osdn-ftg2(使用seq id no:36和37)、osena1(使用seq id no:38和39)、osgrf1(使用seq id no:40和41)、oship14(使用seq id no:42和43),和osdn-ftg3(使用seq id no:44和45)。
[0131]
表2.水稻基因名称,基因id(来自tigr)和载体id
[0132]
基因名称loc idconstruct idoshisloc_os03g14669.2dp1492osdn-ftg1loc_os01g04010.1dp1120oswrky76loc_os09g25060.1dp1189osmyb77loc_os06g43090.1dp0207osdn-ftg2loc_os03g30680.1dp0683osena1loc_os01g43080.1dp1438osgrf1loc_os04g51190.1dp1707oship14loc_os04g55510.1dp0696osdn-ftg3loc_os03g61070.1dp2088
[0133]
使用柱试剂盒在琼胶凝脂电泳后提取的pcr扩增产物，然后与ta克隆载体连接。通过测序确认了这些构建体内的序列和方向。每个基因都被克隆到一个植物双元载体中。
[0134]
实例2
[0135]
转基因水稻株系的转化和基因表达分析
[0136]
如lin和zhang((2005)plant cell rep.23:540-547)所述，通过农杆菌介导的转化，使用实施例1中制备的载体或空载体(dp0158)转化中花11(oryza sativa l.)。将转化实验室产生的转基因苗(t0)移栽到田间获得t1种子。筛选t1和随后的t2种子以确认转化，并在以下性状筛选中使用鉴定为阳性的转基因种子。
[0137]
通过rt-pcr测定转基因水稻叶片中的基因表达水平。设计引物对过表达的转基因水稻中的oshis(使用seq id no:46和47)、osdn-ftg1(使用seq id no:48和49)、oswrky76(使用seq id no:50和51)、osmyb77(使用seq id no:52和53)、osdn-ftg2(使用seq id no:54和55)、osena1(使用seq id no:56和57)、和osdn-ftg3(使用seq id no:58和59)等基因进行rt-pcr分析。将zh11-tc(组织培养zh11水稻)中的表达水平设置为1.00，并将dp1492、dp1120、dp1189、dp0207、dp0683、dp1438和dp2088转基因水稻植株中的表达水平与zh11-tc进行比较。基因表达根据ef-1α mrna水平进行标准化，基因表达分析结果见下表3。
[0138]
表3.转基因水稻植株中相关表达水平的增长倍数
[0139]
基因名称 构建体id相关表达水平的增长倍数oshis dp1492从1.30到10.22osdn-ftg1 dp1120从1.59到6.66oswrky76 dp1189从0.86到421.94osmyb77 dp0207从0.37到71.79osdn-ftg2 dp0683从141.14到966.56osena1 dp1438从1.39到273.64osdn-ftg3 dp2088从1.43到21.11
[0140]
实例3
[0141]
转基因水稻植株的特性
[0142]
实施例2的转基因水稻植株以及zh11-tc和dp0158水稻植株分别在北京田间(40
°
13’n)、海南田间(18
°
30’n)或长沙田间(28
°
11’n)进行试验，并在生长期记录表型。
[0143]
晚开花验证。将发芽的种子种植在田间苗床，到达三叶期时，将幼苗转移到试验田种植。每一个转基因株系种植在同一行，每行种植10株。zh11-tc(组织培养中花11)作为对照植株种植在相同田块在转基因株系附近。水稻植株按常规使用杀虫剂和化肥进行管理。在试验期间观察并记录包括抽穗期在内的植株表型。
[0144]
抽穗期包括始穗日和50％抽穗期。始穗日是第一个穗抽出的日期，通常是指主茎的穗伸出旗叶鞘；50％抽穗期时当同一行有50％幼穗伸出旗叶鞘的日期。成熟期是90％颖片、粒-小穗轴或副颖片的外观变黄的日期。始穗期定义为从播种到始穗日的天数，计算每个植株的抽穗时间，并通过t检验进行统计分析。
[0145]
表4提供了这些研究的结果，并提供了每种构建体的转基因株系的组合数据。
[0146]
表4.转基因水稻株系的开花/抽穗时间性状
[0147][0148]
[0149][0150]
dp1492转基因株系的t1代在北京田间表现出晚开花的性状，种植的15个转基因株系中有14个出现晚开花；这14个株系的平均始穗日比对照zh11-tc晚17天。为进一步调查dp1492转基因水稻植株的开花性状，并调查温度和光照是否会影响水稻的抽穗期或开花时间，t1种子种植在不同地点或环境中：北京(40
°
13’n)和长沙(28
°
11’n)。12个dp1492过表达水稻株系在北京田间进行试验。如表4所示，这12个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，12株的平均抽穗期比对照zh11-tc晚24.4天。14个dp1492过表达水稻株系在长沙田间进行试验。如表4所示，14个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，这14个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚17.3天。这些数据表明oshis是一个晚开花的基因。
[0151]
dp1120转基因水稻植株的t0代在海南田间表现出晚开花的性状，种植的60个t0转基因植株全部表现为晚开花，且这60株的平均始穗日比对照zh11-tc晚35天。为进一步调查dp1120转基因水稻植株的开花性状，并调查温度和光照是否会影响水稻的抽穗期或开花时间，t1种子种植在不同地点或环境中：海南(18
°
30’n)和长沙(28
°
11’n)。5个dp1120过表达水稻株系在海南田间进行试验。如表4所示，这5个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，5个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚23.2天。5个dp1120过表达水稻株系在长沙田间进行试验。如表4所示，5个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，这5个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚2.4天。这些数据表明osdn-ftg1是一个晚开花的基因。
[0152]
dp1189转基因水稻植株的t0代在北京田间表现出晚开花的性状，种植的59个t0转基因植株全部表现为晚开花，且这59株的平均始穗日比对照zh11-tc晚10.0天。为进一步调查dp1189转基因水稻植株的开花性状，并调查温度和光照是否会影响水稻的抽穗期或开花时间，t1种子种植在不同地点或环境中：北京(40
°
13’n)和长沙(28
°
11’n)。13个dp1189过表达水稻株系在北京田间进行试验。如表4所示，这13个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，13个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚8.1天。13个dp1189过表达水稻株系在长沙田间进行试验。如表4所示，13个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，这13个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚6.4天。这些数据表明oswrky76是一个晚开花的基因。
[0153]
dp0207转基因水稻植株的t1代在海南田间表现出晚开花的性状，种植的8个t1转基
因株系中的5个株系表现为晚开花，且这5个株系的平均始穗日比对照zh11-tc晚20.0天。为进一步调查dp0207转基因水稻植株的开花性状，并调查温度和光照是否会影响水稻的抽穗期或开花时间，t1种子种植在不同地点或环境中：北京(40
°
13’n)、长沙(28
°
11’n)和海南(18
°
30’n)。6个dp0207过表达水稻株系在北京田间进行试验。如表4所示，这6个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，6个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚9.6天。6个dp0207过表达水稻株系也在海南田间进行了试验。如表4所示，6个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，这6个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚8.3天。7个dp0207转基因水稻株系在长沙田间进行了试验，这7个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，且这7个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚了6.4天。这些数据表明osmyb77是一个晚开花的基因。
[0154]
dp0683转基因水稻植株的t0代在北京田间表现出晚开花的性状，种植的74个t0转基因植株全部表现为晚开花，且这74株的平均始穗日比对照zh11-tc晚10.0天。为进一步调查dp0683转基因水稻植株的开花性状，并调查温度和光照是否会影响水稻的抽穗期或开花时间，t1种子种植在不同地点或环境中：北京(40
°
13’n)、长沙(28
°
11’n)和海南(18
°
30’n)。14个dp0683过表达水稻株系在北京田间进行试验。如表4所示，这14个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，且14个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚12.9天。14个dp0683转基因水稻株系也在长沙田间进行了试验，这14个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，且这14个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚了11.5天。14个dp0683过表达水稻株系同样在海南田间进行了试验。如表4所示，14个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，这14个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚9.6天。这些数据表明osdn-ftg2是一个晚开花的基因。
[0155]
dp1438转基因水稻植株的t1代在海南田间表现出晚开花的性状，种植的13个t1代转基因植株全部表现为晚开花，且这13个株系的平均始穗日比对照zh11-tc晚5.0天。为进一步调查dp1438转基因水稻植株的开花性状，并调查温度和光照是否会影响水稻的抽穗期或开花时间，t1种子种植在不同地点或环境中：北京(40
°
13’n)和海南(18
°
30’n)。13个dp1438过表达水稻株系在北京田间进行试验。如表4所示，这13个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，且13个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚9.3天。10个dp1438过表达水稻株系也在海南田间进行了试验。如表4所示，10个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，这10个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚8.1天。这些数据表明osena1是一个晚开花的基因。
[0156]
dp1707转基因水稻植株的t0代在海南田间表现出晚开花的性状，种植的21个t0转基因植株中有10株表现为晚开花。为进一步调查dp1438转基因水稻植株的开花性状，并调查温度和光照是否会影响水稻的抽穗期或开花时间，t1种子种植在不同地点或环境中：北京(40
°
13’n)和海南(18
°
30’n)。5个dp1707过表达水稻株系在北京田间进行试验。如表4所示，这5个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，且5个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚10.0天。这5个dp1707过表达水稻株系同样在海南田间进行了试验。如表4所示，5个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，这5个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚5.4天。这些数据表明osgrf1是一个晚开花的基因。
[0157]
dp0696转基因水稻植株的t0代在北京田间表现出晚开花的性状，种植的57个t0转
基因植株全部表现为晚开花，且这57株的平均始穗日比对照zh11-tc晚10.0天。为进一步调查dp0696转基因水稻植株的开花性状，并调查温度和光照是否会影响水稻的抽穗期或开花时间，t1种子种植在不同地点或环境中：海南(18
°
30’n)和长沙(28
°
11’n)。15个dp0696过表达水稻株系在北京田间进行试验。如表4所示，这15个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，且15个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚9.3天。15个dp0696转基因水稻株系也在长沙田间进行了试验，这15个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，且这15个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚了2.4天。这些数据表明oship14是一个晚开花的基因。
[0158]
dp2088转基因水稻植株的t0代在北京田间表现出晚开花的性状，种植的50个t0转基因植株中的33株表现为晚开花，且这33株的平均始穗日比对照zh11-tc晚10到15天。为进一步调查dp2088转基因水稻植株的开花性状，并调查温度和光照是否会影响水稻的抽穗期或开花时间，t1种子种植在不同地点或环境中：北京(40
°
13’n)和长沙(28
°
11’n)。13个dp2088过表达水稻株系在北京田间进行试验。如表4所示，这13个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，且13个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚8.1天。13个dp2088转基因水稻株系也在长沙田间进行了试验，这13个株系的始穗日显著晚于对照zh11-tc(p《0.01)，且这13个株系的平均抽穗期比对照zh11-tc晚了32.3天。这些数据表明osdn-ftg3是一个晚开花的基因。
[0159]
综上，这些结果表明，过量表达oshis、osdn-ftg1、oswrky76、osmyb77、osdn-ftg2、osena1、osgrf1、oship14 and osdn-ftg3这些基因相对于对照植物能延迟开花时间。
[0160]
实例4
[0161]
水稻晚开花基因在玉米中的转化和评估
[0162]
玉米植株将通过编码本文所述多肽的一种多核苷酸或来自玉米、拟南芥或其它物种的相应同系物转化。所述基因在玉米转化载体中的表达可以被组成型启动子如玉米泛素启动子(christensen等,(1989)plant mol.biol.,12:619-632和christensen等,(1992)plant mol.biol.,18:675-689)或其它启动子所控制，如应激反应启动子或组织优选启动子。所述重组dna构建体可以通过国际公开专利wo 2009/006276描述的粒子轰击的方法转入玉米细胞中。或者，重组dna构建体在玉米植株中的转化也可以通过zhao等人在meth.mol.biol.318:315-323(2006)和在mol.breed.8:323-333(2001)，以及1999年11月9号公开的美国专利号5981840描述的农杆菌介导的方法进行。
[0163]
产生的子代，例如t1代植株，可以通过田间试验进行测试。抽穗期和成熟期可以在多个地点进行测量。在开花期和/或成熟期相对于对照的显著变化将会被认为是该基因在玉米中起作用的证据。
[0164]
实例5
[0165]
实验室筛选拟南芥中的水稻晚开花基因
[0166]
为了解水稻晚开花基因是否能改善双子叶植物晚开花或其它性状，本文所述的水稻表达载体可以通过农杆菌介导的转化程序使用花浸法转化到拟南芥中，并鉴定转基因植株(clough,s.t.和bent,a.f.,(1998)the plant journal 16,735
–
743；zhang,x.等,(2006)nature protocols,1:641-646)。
[0167]
产生的子代，如t1代植物，可以通过田间试验进行验证。抽穗期和成熟期可以在多个地点进行测量。在开花期和/或成熟期相对于对照的显著变化将会被认为是该基因在玉
米中起作用的证据。