酰胺酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用的制作方法

本发明涉及酶工程
技术领域：
，具体涉及一种酰胺酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用。
背景技术：
：2-氯烟酸是一种合成农药和医药的重要中间体化合物。在农药领域，2-氯烟酸可用于合成磺酰脲类除草剂烟嘧磺隆、酰胺类除草剂吡氟草胺、酰胺类杀菌剂啶酰菌胺以及三唑硫酮类的一系列杀菌活性化合物等；在医药领域，2-氯烟酸是合成抗艾滋病药物-奈韦拉平、抗抑郁药物-米氮平、非甾体消炎镇痛药-尼氟灭酸、普拉洛芬以及烟甲灭酸等的重要中间体。由于2-氯烟酸在农药和医药中的广泛应用，其市场需求日益增长。目前，2-氯烟酸的生产方法主要为化学合成法。如以烟酸为起始原料经氮氧化、氯化和水解合成2-氯烟酸；以3-氰基吡啶为原料，经氮氧化、氯化、水解合成2-氯烟酸；2-氯-3-甲基吡啶氧化法；以氰基乙酸乙酯为起始原料的成环法；以2-氯-3-三氟甲基吡啶为起始原料的氯化水解法。自瑞士lonza公司于1977年申请了2-氯烟酸合成专利后(us4144238)，日本有机合成和日本光荣化学等化工巨头先后投身于2-氯烟酸的合成研究(jp59144759；jp56169672)。目前工业上主要采用3-氰基吡啶法生产2-氯烟酸，但其生产工艺存在污染重、合成步骤冗长、收率低等缺陷。酰胺酶是一类催化酰胺化合物合成相应羧酸的水解酶。因其高立体选择性、广底物谱等优势，以酰胺酶为生物催化剂的(手性)羧酸、(手性)酰胺衍生物及光学纯氨基酸的生物合成日益受到研究者的重视。酰胺酶法水解2-氯烟酰胺已成为合成2-氯烟酸的重要方法(cn101857889；bioorganicchemistry,2018,76:81-87)。蛋白质工程和晶体结构解析等技术的发展为酶分子改造提供了强有力工具。在已报道的酰胺酶中，郑仁朝等构建的泛生菌来源酰胺酶pa-ami突变体g175a可高效催化2-氯烟酰胺合成2-氯烟酸(cn201710974605.4)。构建高催化活力的酰胺酶生物催化剂对于实现2-氯烟酸的高效、绿色生产具有十分重要的意义。技术实现要素：本发明的目的在于通过定点饱和突变技术对泛生菌来源(pantoeasp.)酰胺酶pa-ami突变体g175a进行进一步分子改造，提供一种突变体蛋白，提高其对2-氯烟酰胺的水解活力，从而有利于该酰胺酶在2-氯烟酸制备中的应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明在泛生菌来源酰胺酶pa-ami突变体g175a(氨基酸序列如seqidno.1所示)基础上，利用半理性设计方法进一步获得酶活提高的突变体。所述酰胺酶突变体由seqidno.1所示氨基酸序列的第378位、402位或403位进行单位点突变或多位点突变获得。具体的，所述的单位点突变为：将seqidno.1所示氨基酸序列的第378位的丙氨酸(a)替换为缬氨酸(v)或苏氨酸(t)；或将seqidno.1所示氨基酸序列的第402位的缬氨酸(v)替换为亮氨酸(l)；或将seqidno.1所示氨基酸序列的第403位的亮氨酸(l)替换为缬氨酸(v)或苏氨酸(t)。所述多位点突变为上述单位点突变的组合。作为优选，所述酰胺酶突变体为：seqidno.1所示氨基酸序列的第378位的丙氨酸突变成苏氨酸且第403位的亮氨酸突变为缬氨酸、或第378位的丙氨酸突变成苏氨酸且第402位的缬氨酸突变为亮氨酸、或第378位的丙氨酸突变成缬氨酸且第402位的缬氨酸突变为亮氨酸、或第378位的丙氨酸突变成缬氨酸且第403位的亮氨酸突变为缬氨酸、或第378位的丙氨酸突变成缬氨酸且第402位的缬氨酸突变为亮氨酸且第403位的亮氨酸突变为缬氨酸。相较于亲本酰胺酶pa-ami突变体g175a，上述酰胺酶突变体的活力大幅提升，均适应30～55℃的催化温度。本发明还提供了一种编码所述的酰胺酶突变体的编码基因以及包含所述编码基因的重组基因工程菌。作为优选，所述编码基因克隆至表达载体pet28b，转化至宿主细胞大肠杆菌escherichiacolibl21获得重组基因工程菌。本发明的另一个目的是提供所述的酰胺酶突变体在催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸中的应用。所述的应用包括：以包含酰胺酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后获得的湿菌体或者湿菌体破碎后提取的酶作为生物催化剂，以2-氯烟酰胺为底物，以ph为7.5～8.5的缓冲液为反应介质，30～60℃、150～500r/min条件下进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得2-氯烟酸。本发明所述的酰胺酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，还可以是经部分纯化或完全纯化的酶蛋白形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的酰胺酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式进行使用。反应体系中，底物的初始浓度为50～300mm，每隔10～60min进行补料至终浓度50～200mm。催化剂的用量以菌体干重计为0.25～2.5g/l。作为优选，底物的初始浓度为200mm，每当底物残留低于20％时，补加终浓度100mm的2-氯烟酰胺。催化剂的用量以菌体质量(细胞干重)计，终浓度为2.5g/l反应体系。作为优选，反应介质为ph值为8.0的tris-hcl缓冲液，反应条件为40℃，200r/min。本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含酰胺酶突变体编码基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/l卡那霉素的lb培养基中，37℃、150r/min培养12h，随后以体积浓度1％接种量转接到新鲜的含终浓度50mg/l卡那霉素的lb培养基中，37℃、150r/min培养至菌体浓度od600为0.4～0.8，再向培养基中加入终浓度为0.1～1mm的iptg(优选0.1mm)，28℃、150r/min诱导培养12h，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体。lb液体培养基组成为(g/l)：蛋白胨10，酵母提取物5，nacl10，ph值为7.0；lb平板培养基组成为(g/l)：蛋白胨10，酵母提取物5，nacl10，琼脂15，溶剂为去离子水，ph值为7.0。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的酰胺酶突变体较亲本活力大幅提高，在使用该酶的粗提取物或工程菌全细胞进行催化时，反应酶活仍然保持较高状态。此外，本发明的酰胺酶突变体能够适应30～55℃的催化温度，为工业化酶法生产2-氯烟酸奠定了基础。附图说明图1为g175a和三重突变体a378v/v402l/l403v全细胞催化2-氯烟酰胺(初始浓度为200mm)制备2-氯烟酸的补料反应进程。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。具体实施例中采用的亲本酰胺酶为本课题组前期构建的泛生菌(pantoeasp.)来源酰胺酶pa-ami(genbankno.wp008109374)突变体g175a，并公开于中国专利申请文献(cn201710974605.4)，其氨基酸序列如seqidno.1所示，核苷酸序列如seqidno.2所示。实施例1.酰胺酶的诱导及表达纯化步骤一：重组菌的培养取10μl甘油管保藏菌液接种至10ml液体lb培养基(含kan50μg/ml)，37℃，200r/min培养12h后，以2％接种量转接至100ml含kan的新鲜lb培养基中继续培养至od600达到0.6，加入终浓度为0.1mm的iptg，于28℃诱导培养过夜(12h)。培养结束后，离心收集菌体，用0.85％生理盐水洗涤2次。步骤二：酰胺酶的纯化(1)取5g湿菌体悬浮于50mltris-hcl缓冲液(20mm，ph8.0)中，振荡摇匀后利用超声波细胞破碎仪破碎细胞(破碎功率40w，每次超声工作5s，间隔5s，共99个循环)；(2)破碎完成后，取破碎液于4℃，12,000r/min离心20min去除细胞碎片；(3)收集上清液(粗酶液)用于酶后续的分离纯化；(4)纯化柱为ni-nta，装柱体积为20ml，用5-10倍柱体积上样平衡缓冲液(20mmtris-hcl，300mmnacl和50mm咪唑，ph8.0)平衡，流速1.5ml/min；(5)以1.5ml/min的速率上样；(6)用上样平衡缓冲液洗脱除去未吸附的蛋白；(7)用洗脱缓冲液(20mmtris-hcl,300mmnacl，和250mm咪唑，ph8.0)进行洗脱，收集目标蛋白；(8)含目标蛋白的酶液在20mm，ph8.0的tris-hcl中透析过夜(更换2次缓冲液)。(9)用bradfold蛋白浓度试剂盒采用分光光度计法测定透析液的蛋白质浓度。实施例2.酰胺酶的定点饱和突变与筛选定点饱和突变技术参考(appliedmicrobiologyandbiotechnology,2014,98(6):2473-2483)的描述，阳性突变子的高通量筛选模型参考(cn100370034；appliedmicrobiologyandbiotechnology,2007,74:256-262)的描述。具体过程如下：步骤一：定点突变在亲本泛生菌酰胺酶突变体g175a氨基酸序列中的第378，402和403位点的氨基酸进行饱和突变，设计引物a378、v402和l403(见表1)，以克隆有泛生菌酰胺酶突变体g175a编码基因的质粒pet28-g175a为模板，进行全质粒扩增。表1定点饱和突变引物设计表注：n＝a/g/c/t，k＝g/t，m＝a/c。pcr体系为：2×phantamaxbuffer25μl，dntpmixture(10mm)1μl，如表1所示的突变引物10μm各1μl，质粒pet28-pa-ami0.5μl，phantamaxdna聚合酶0.5μl，ddh2o补至50μl。pcr条件为95℃预变性2min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸6.5min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。用0.9％琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物，取pcr产物20μl，加入1μl的dpnⅰ，37℃酶切3h去除模板质粒dna，于65℃下灭活10min。步骤二：酰胺酶突变体的转化取感受态细胞e.colibl21(de3)，加入10μl步骤一中的pcr产物，冰上静置30min，在42℃热激90s，加入600μl不含卡那霉素的lb培养基，37℃下以180r/min转速培养1h，涂布于含卡那霉素(50mg/l)的lb平板，37℃培养过夜。步骤三：菌体培养及高通量筛选挑取单菌落分别接种到96孔培养板(装有1ml含50mg/l卡那霉素的lb培养基)中，37℃、150r/min培养至od600约0.5左右，然后加入终浓度为0.1mm的iptg，28℃下培养12h。取新的96孔培养板，分别逐孔对应加入100μl培养的菌液，以2-氯烟酰胺和盐酸羟胺为双底物，以fecl3溶液为显色剂，以g175a工程菌细胞为参照，根据显色颜色变化(黄绿色→深红色)的速度来进行判定，筛选出变色速度快于对照组的菌株作为初筛阳性菌。实施例3.酰胺酶阳性突变体的复筛如实施例2所得阳性菌按实施例1培养条件培养，获得突变体全细胞。称取湿菌体加入缓冲液打匀，制成湿细胞浓度为40g/l的菌悬液。突变体活力测定的反应体系为：总体系10ml，细胞终浓度为0.25g/l，50mmtris-hcl(ph8.0)，50mm2-氯烟酰胺。在55℃，150r/min振荡，反应10min后取1ml加入100μl2m盐酸终止反应，稀释10倍后使用液相色谱检测。液相色谱检测条件：流动相：乙腈：水：磷酸＝250：750：1，流速1ml/min，2-氯烟酸检测波长270nm。酶活单位(u)定义：在55℃、ph8.0条件下，每分钟催化2-氯烟酰胺生成1μmol的2-氯烟酸所需的细胞作为一个活力单位(u)。取全细胞酶活高于g175a的突变体提取质粒进行测序。活力提高的阳性克隆dna测序显示其第378位的丙氨酸(密码子gca)替换为缬氨酸(密码子gta)或苏氨酸(密码子aca)，第402位的缬氨酸(密码子gtg)替换为亮氨酸(密码子ctg)，第403位的亮氨酸(密码子ctg)替换为缬氨酸(密码子gtg)或苏氨酸(密码子acg)，获得酰胺酶突变体工程菌e.colibl21(de3)/pet28-a378v、e.colibl21(de3)/pet28-a378t、e.colibl21(de3)/pet28-v402l、e.colibl21(de3)/pet28-l403v、e.colibl21(de3)/pet28-l403t。突变体酶活检测见表2。表2阳性突变体的全细胞酶活突变体全细胞酶活(u/g)g175a1100±57a378v1489±50a378t1357±47v402l1810±65l403v1427±34l403t1650±43实施例4.迭代突变文库的构建及活力测定将实施例3的正向单突变体进行迭代突变，设计引物(见表3)，以酰胺酶突变体的质粒为模板，按实施例2中步骤一进行全质粒扩增(见表4)后转化。挑取单菌落于含10ml含卡那霉素的lb试管中进行培养，测序并保藏。取迭代突变的重组菌按实施例1步骤一所述培养方式培养，按实施例3所述方式进行全细胞酶活的测定。各个突变体的全细胞酶活和序列见表5，其中三突变体a378v/l403v/v402l细胞酶活达2786u/g(湿细胞)，为出发菌株2.53倍。表3迭代突变的引物表4迭代突变的扩增表5迭代突变体的全细胞酶活实施例5.突变体比酶活的测定取实施例3和实施例4中的酶活提高的重组菌按实施例1的方式制备纯酶，测定酰胺酶突变体的比酶活。比酶活测定体系(10ml)：取适量酶液在50mm的2-氯烟酰胺，50mm(ph8.0)的tris-hcl缓冲液下反应10min，用2m盐酸终止反应，样品稀释10倍，进行高效液相色谱检测。比酶活单位(u)定义：在55℃、ph8.0条件下，每分钟催化2-氯烟酰胺生成1μmol的2-氯烟酸所需的酶量作为一个活力单位(u)。由表6可知，三突变体a378v/l403v/v402l比酶活达127.44u/mg，为g175a的2.4倍。表6突变体对2-氯烟酰胺的比酶活实施例6.酰胺酶突变体a378v/v402l/l403v全细胞催化2-氯烟酰胺合成2-氯烟酸以实施例3中获得的酰胺酶三重突变体e.colibl21(de3)/pet28-a378v/v402l/l403v细胞为催化剂，以2-氯烟酰胺为底物制备2-氯烟酸。反应体系为：200mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)，初始浓度为200mm的2-氯烟酰胺，1.25g/l细胞(细胞干重)，于40℃、200r/min下进行反应。每当底物残留低于20％时，补加100mm的2-氯烟酰胺，总共进行8次补料，体系中2-氯烟酸最终累计总量为930mm。而g175a在相同条件下只能积累570mm2-氯烟酸。补料反应进程见附图1。序列表<110>浙江工业大学<120>酰胺酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>471<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metasnasnleuhistyrlysserleuleugluileglyargleuile151015glnserglygluileserservalgluvalthrglnthrleuleuthr202530argileaspthrleuaspargaspleuhissertyrphetyrvalmet354045argaspseralaleuglnglnalaalaglualaaspalagluileala505560glnglylysmetargglyproleuhisglyvalproilealaleulys65707580aspleuiletrpthrlysaspalaprothrserhisglymetileile859095hislysaspargtyrprothrgluaspserthrvalvalgluargphe100105110argalaalaglyalavalileleuglylysleuthrglnthrgluser115120125alaphealaasphishisproaspilealaargproasnasnprotrp130135140glyseralaleutrpthrglyalaserserserglyserglyvalala145150155160thralaalaglyleucyspheglyserileglythraspthralagly165170175serileargpheproserasnalaasnglyleuthrglyilelyspro180185190thrtrpserargvalthrarghisglyalacysgluleualaalaser195200205leuasphisileglyprometalaargasnalaalaaspalaalaala210215220metleuglnalailealaglyargaspasplysaspprothrserser225230235240sergluprovalproasptyrleualaleumetthrargglyileser245250255lysmetargileglyvalasplyssertrpalaleuglulysvalasp260265270glugluthrargalaalaleuglnseralailealathrleuserser275280285leuglyalathrleuvalaspilethrleuproaspthrglulysala290295300alaalaglutrpseralaleucysalavalgluthralaleualahis305310315320gluaspthrtyrproalaglnlysaspglntyrglyproglyleuala325330335glyleuleuaspleuglyhisserilethralaleuglutyrglnarg340345350leuleuleuserargalaalaleuargglyaspileseralaleuphe355360365thrglnvalaspleuileleualaproalathralatyralaglyleu370375380thrtrpaspthrmetthrargpheglythraspglnalaleupheasn385390395400glyvalleuargtyrthrseralapheaspalaserglyhisprothr405410415ilethrleuprocysglylysthralaserglyalaproileglyphe420425430glnleuvalalaalahisphealagluthrthrmetileglnglyala435440445trpalapheglnglnvalthrasptrphislysglnhisproalaleu450455460hishishishishishishis465470<210>2<211>1416<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atgaataacctgcattacaaatctctgctggaaatcggtcgcctgatccaatctggtgaa60atctcctctgttgaagtgacgcaaaccctgctgacgcgtattgataccctggatcgcgac120ctgcatagctatttttacgtgatgcgtgattctgcactgcagcaagcggccgaagcagac180gctgaaatcgctcagggcaaaatgcgtggtccgctgcacggcgttccgattgcactgaaa240gatctgatctggaccaaagacgctccgacgtcacatggtatgattatccacaaagatcgt300tatccgaccgaagactcgacggtggttgaacgttttcgcgcagctggtgcggtgattctg360ggcaaactgacccagacggaaagtgcgtttgcggatcatcacccggacatcgcacgtccg420aacaatccgtggggtagcgccctgtggaccggtgccagctctagtggctctggtgttgcc480accgccgcgggtctgtgctttggcagcattggcaccgatacggcgggtagtatccgtttc540ccgtccaacgcgaatggcctgaccggtattaaaccgacgtggagtcgtgtcacccgtcat600ggcgcctgtgaactggcagcttccctggatcacattggcccgatggcacgtaatgccgcg660gatgcagctgcgatgctgcaggcaatcgctggtcgcgatgacaaagatccgaccagcagc720agcgaaccggttccggactatctggcgctgatgacccgtggtattagtaaaatgcgcatc780ggcgtcgataaatcctgggccctggaaaaagtggacgaagaaacccgtgccgcactgcag840agcgcgattgcgaccctgagctctctgggtgccaccctggtggatattaccctgccggac900acggaaaaagctgcggccgaatggtctgcactgtgcgctgtcgaaacggcactggctcat960gaagatacctatccggcgcagaaagaccaatatggtccgggtctggcgggtctgctggat1020ctgggccactccattaccgcactggaataccagcgcctgctgctgtcacgtgcagctctg1080cgcggtgatatttcggccctgtttacccaagttgacctgattctggccccggcaaccgcg1140tatgcgggtctgacctgggataccatgacgcgttttggtacggaccaggcgctgttcaat1200ggcgtgctgcgctacacctcagcgttcgatgcctcgggtcatccgaccattacgctgccg1260tgtggcaaaaccgcatctggtgctccgatcggctttcaactggtggcggcccacttcgcg1320gaaaccacgatgatccagggtgcgtgggccttccaacaggtcaccgattggcataaacag1380catccggcactgcatcatcatcaccatcatcactga1416当前第1页12