一株嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一株嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
：含油脂废弃物包括含油废水和含油固体垃圾，例如泔水、垃圾压滤液、餐厨垃圾等，其共同特点是高有机物含量，高油脂含量，高盐分。泔水指由餐饮业排放的未经处理的废水,它已成为城市的主要污染源,该废水主要来自饭店、食堂、酒店等餐饮场所排放的污水。垃圾压滤液是指生活垃圾机械压缩过程中受到挤压作用产生的高浓度污水。餐厨垃圾主要来自家庭、学校食堂及餐饮行业等进行食品生产的过程中所产生的食物残渣及边角料、餐后所剩残余的食物等，其成分非常复杂，不仅包含各种动植物油脂，还包含淀粉、动植物蛋白、时蔬纤维等。含高浓度油脂的污水量大幅度增长，已成为城市生活污水的重要组成部分。进入城市污水处理厂的油类物质包覆在填料外层，使氧的传质受阻，导致好氧微生物代谢紊乱。若油类物质进入水体，则漂浮于水体的表面，影响水体的溶氧及其自然净化过程，危害水体生态系统。人们常采用筛滤、沉淀、隔油、絮凝、电解等物理和化学方法处理含油废水，这些方法一般投资大、流程复杂、且化学法容易产生二次污染。在餐厨垃圾生物降解或堆肥处理上，由于大量油脂的存在，降解时间较长，且堆肥质量较差，对于油脂的快速降解需求迫切。由于餐厨垃圾除了含有油脂，还含有肉蛋白或角蛋白，以及盐分。角蛋白分子之间存在大量的二硫键、氢键和疏水基相互作用，分子结构紧密复杂，使其难以降解，而盐分会影响微生物生长的渗透压。因此，对于餐厨垃圾生物处理，蛋白降解和耐盐的能力也显得尤其重要。微生物能利用油脂作为生长的碳源和能源，使之水解成甘油和脂肪酸，最终降解为水和co2等代谢产物，这种方法成本低、无二次污染。因此，从自然环境中寻找高效降解油脂的菌株用于含油废水和餐厨垃圾的治理是一项非常有意义的工作，是极具发展前景的方法，受到国内外学者的重视。而目前已报道的功能微生物中，有降解油脂功能的菌株，有耐盐的菌株，有降解蛋白的菌株，却极少具有这三种功能于一体的菌株。利用多功能菌株处理含油废弃物，具有投入量少，成本低，效率高等特点，具有很好的应用前景。在生物表面活性剂中，鼠李糖脂是常用的一种阴离子表面活性剂，其在各种有机溶剂和水中具有良好的溶解性。另外，鼠李糖脂在各种温度、酸碱条件及盐度的环境下都很稳定，可显著的降低水的表面张力、改变固体表面的湿润性，并具有消泡、洗涤、乳化等多种功能，可应用于农业、食品、化妆品以及生物修复等领域，并且环境友好，对人类、动植物及微生物均不构成危害。利用废弃物生产诸如鼠李糖脂等高价值的生物表面活性剂是一种不错的选择。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供了一株嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌及其应用，该菌同时具有高浓度油脂降解、肉蛋白降解、角蛋白降解、油脂降解产鼠李糖脂以及耐盐的功能。为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：本发明提供了一株嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌，菌种名称为：嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7，aneurinibacillusthermoaerophilus，于2019年05月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17867。相应的，一株嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌，其16srdna序列如seqidno：1所示。相应的，嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌在降解餐厨垃圾中的应用。优选的，所述应用为温度为40～60℃；和/或；所述应用的ph值为4～10；和/或；所述应用的盐浓度为0～70g/l。优选的，所述嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌在降解高浓度油脂和/或降解油脂产鼠李糖脂中的应用。优选的，所述嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌降解高浓度油脂的过程为：将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7按2～10％的接种量接种到油脂降解培养基中，在温度为40℃～60℃，ph为4～10，120～240r/min的条件下振荡培养0～120h，使油脂降解；和/或，所述嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌降解油脂产鼠李糖脂的过程为：将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7按2～10％的接种量接种到发酵培养基中，在温度为40～60℃，转速为160～240r/min的条件下振荡培养，使油脂降解产鼠李糖脂。优选的，所述油脂降解培养基的配方为：蛋白胨10g/l，磷酸二氢钾2g/l，磷酸氢二甲2g/l，氯化钠2g/l，七水硫酸镁0.5g/l，油脂20g/l，ph自然；和/或，所述发酵培养基的配方为：磷酸二氢钾2g/l，磷酸氢二钾2g/l，氯化钠2g/l，七水硫酸镁0.5g/l，硫酸铵5g/l，油脂5～25g/l，ph自然。优选的，所述嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌在降解蛋白质中的应用。优选的，所述嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌降解蛋白质的过程为：将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7按2～10％的接种量接种到以蛋白质降解培养基中，40～60℃，160～240r/min振荡培养0～120h，使蛋白质降解，测定蛋白质降解率。优选的，所述蛋白质为牛奶蛋白、角蛋白或肉蛋白；所述蛋白质降解培养基为牛奶蛋白降解培养基、角蛋白降解培养基或肉蛋白降解培养基；所述牛奶蛋白降解培养基的配方为：氯化钠0.5g/l，磷酸二氢钾0.35g/l，磷酸氢二钾0.7g/l，蛋白质30g/l，ph自然；或；所述角蛋白降解培养基的配方为：氯化钠0.5g/l，磷酸二氢钾0.35g/l，磷酸氢二钾0.7g/l，羽毛10g/l，ph自然；或；所述肉蛋白降解培养基的配方为：氯化钠0.5g/l，磷酸二氢钾0.35g/l，磷酸氢二钾0.7g/l，动物肉蛋白80g/l，ph自然。本发明具备以下有益效果：本发明提供的菌株嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7是从餐厨垃圾处理厂采样，通过大量筛选获得。该菌株具有耐盐性，能降解高浓度油脂，此外，可快速降解蛋白质，对含高盐高油高蛋白的餐厨垃圾降解具有良好的应用前景。将该菌株接种到盐浓度为0～70g/l的培养基中，能生长良好；接种到以大豆油为唯一碳源的培养基中，能使培养基中的高浓度大豆油快速降解；接种到以蛋白质(牛奶蛋白、羽毛角蛋白和动物肉蛋白)为唯一碳氮源的培养基中，可以快速降解培养基中的蛋白质。将该菌投入到餐饮废油中，能将餐饮废油降解生成高附加值的表面活性剂鼠李糖脂。附图说明图1为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的菌落形态图；图2为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的电镜扫描图；图3为不同温度对嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的影响示意图；图4为不同ph对嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的影响示意图；图5为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的系统进化树；图6为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的生长曲线；图7为不同盐浓度对嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的影响示意图；图8为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7对大豆油降解的接种量优化图；图9为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7对大豆油降解的温度优化图；图10为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7对大豆油降解的ph优化图；图11为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7对大豆油降解的转速优化图；图12为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7对大豆油降解的时间优化图；图13为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7对大豆油的降解率；图14为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7降解大豆油的过程图；图15为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7降解餐饮废油产鼠李糖脂图；图16为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7降解牛奶蛋白的过程图；图17为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7降解羽毛的过程图；图18为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7降解动物肉蛋白的过程图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。若未特别指明，实施举例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明涉及到培养基如下：1、富集培养基：k2hpo42.0g/l，nacl0.5g/l，mgso40.5g/l，蛋白胨5.0g/l，牛肉膏0.5g/l，大豆油10.0g/l，ph7.0～7.2。2、驯化培养基：k2hpo42.0g/l，nacl0.5g/l，mgso40.5g/l，(nh4)2so45.0g/l，kh2po42.0g/l，蛋白胨5.0g/l，牛肉膏0.5g/l，大豆油按逐次递增加入(分别为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0g/l)，ph7.0～7.2。3、中性红初筛培养基：蛋白胨10.0g/l，牛肉膏5.0g/l，nacl5.0g/l，大豆油10.0g/l，0.6％中性红水溶液2.0ml，琼脂18.0g/l，ph7.0～7.2。4、复筛培养基：(nh4)2so45.0g/l，k2hpo42.0g/l，kh2po42.0g/l，nacl2.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，大豆油10g/l，ph7.0～7.2。5、盐浓度梯度培养基：牛肉膏5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl0～150g/l，ph为7，121℃灭菌20min。6、大豆油降解培养基：蛋白胨10.0g/l，k2hpo42.0g/l，kh2po42.0g/l，nacl2.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，大豆油20g/l，ph自然。7、牛奶蛋白降解培养基：nacl0.5g/l，kh2po40.35g/l，k2hpo40.7g/l，蛋白质30g/l，ph自然。8、羽毛降解培养基：nacl0.5g/l，kh2po40.35g/l，k2hpo40.7g/l，羽毛10g/l，ph自然。9、动物肉蛋白降解培养基：nacl0.5g/l，kh2po40.35g/l，k2hpo40.7g/l，动物肉蛋白80g/l，ph自然。10、餐饮废油发酵培养基：k2hpo42.0g/l，kh2po42.0g/l，nacl2.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，(nh4)2so45.0g/l，餐饮废油5～25g/l，ph自然。11、牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10.0g/l，牛肉膏5.0g/l，nacl5.0g/l，ph7.0～7.2。12、试管斜面培养基：蛋白胨10.0g/l，牛肉膏5.0g/l，nacl5.0g/l，琼脂18.0g/l，ph7.0～7.2。在本发明中ph自然就是按照配方加各种物质形成的溶液，不调节溶液的ph。本发明的所有实验的所有ph自然的情况下，溶液的ph的范围为6～7。一、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌的筛选和鉴定1、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌的筛选本发明提供的菌株嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7是从餐厨垃圾处理厂堆放的餐厨垃圾中筛选获得，具体过程如下：(1)富集取5ml液态样品和5g固态样品，放入含有无菌玻璃珠和无菌水的150ml三角瓶内充分震荡混匀，制成样液。取10ml样液到90ml富集培养基中，50℃，160r/min条件下震荡培养至油脂基本降解，并同时做3个平行样，得到培养液。液态样品为从固体餐厨垃圾中流下来的液体，固态样品为餐厨垃圾处理厂中堆积的固体餐厨垃圾经过粉碎后的样品。(2)驯化从富集培养基中取上述培养液进行菌种油脂降解驯化实验。取10ml培养液到90ml驯化培养基中，以促进菌株的生长，每6d为1周期，培养一个周期，然后从中取出10ml培养液加入到驯化培养基中，培养一个周期。如此反复驯化，持续5个周期。初始加油量随周期逐次递增，分别为5、10、15、20、25g/l，每个浓度做3个平行样。(3)初筛取最后一次驯化的菌液1ml用无菌蒸馏水梯度稀释，分别取10-4、10-5、10-6、10-7梯度的菌液涂布中性红初筛培养基上，50℃恒温培养1～3d，观察菌落生长情况和菌落周围是否变红，若变红则表明菌株能够分解油脂产生脂肪酸。(4)分离挑取中性红初筛培养基上的菌落，多次划线分离，50℃培养24h，直至得到单菌落，接种试管斜面培养基保藏。(5)复筛将分离的菌株先在牛肉膏蛋白胨培养基中活化24h，然后以5％的接种量接种到以大豆油为唯一碳源的复筛培养基中，50℃，160r/min条件下培养3d，测定分离菌株的油脂降解率、生物量、脂肪酶酶活。挑选对大豆油有较好降解能力的菌株作为优势菌株，命名为h7。2、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌的鉴定(1)生理生化特征鉴定将菌株h7划线接种与牛肉膏蛋白胨固体培养基中，放入50℃培养箱中培养24h，然后观察菌落形态，具体见下表1和图1所示。菌株h7的电镜扫描图见图2所示。牛肉膏蛋白胨固体培养基的配方与试管斜面培养基的配方相同。表1菌株形态特征对该菌继续进行相关生理生化指标鉴定，具体结果见下表2所示，表2中所列出的测试项目是按照《常见细菌系统鉴定手册》中的方法，对该菌继续进行相关生理生化指标鉴定。表2菌株生理生化特征测试项目结果测试项目结果蛋白质+v-p+柠檬酸盐+甲基红-纤维素-吲哚-油脂+明胶+糖发酵+硝酸盐-注：“+”表示阳性，“-”表示阴性将菌株h7按5％的接种量接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，分别在温度为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，ph为4～9，盐浓度为0～70g/l的条件下振荡培养24h，测量菌体生物量。该菌的生长特征见下表3(图3～图4和图7)所示。表3菌株生长特征培养条件可生长范围最适条件温度40～60℃50℃ph4～106盐浓度0～70g/l10g/l(2)分子鉴定将活化的菌株h7接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，50℃、160rpm培养12h，取1.5ml菌液于4℃，10000rpm离心10min，取菌体于2ml离心管中，采用dna提取试剂盒提取dna。电泳检测后采用通用引物27f和1492r进行pcr扩增16srdna，引物序列如下：27f：5-agtttgatcctggctcag-31492r：5-ggttaccttgttacgactt-3pcr扩增条件为94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。对pcr扩增产物测序分析。测序结果(详见seqidno：1)经blast比对，与数据库中aneurinibacillusthermoaerophilus的16srdna序列具有99.93％的序列相似性。结合菌株形态特征(表1)、生理生化特征(表2)、生长特征(表3)和分子生物学特征，利用mega软件，制作该菌株的系统进化树，如图5所示；利用生长曲线仪测定该菌株的生长曲线如图6所示，确定菌株为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillusthermoaerophilus)，命名为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7，并于2019年05月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.17867。二、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的耐盐性(1)制备种子液：挑取斜面保存的嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7一环，接种到50ml牛肉膏蛋白胨培养基中50℃培养20h，即得到种子液。(2)将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7种子液按5％的接种量接种到盐浓度梯度培养基中，50℃，180r/min振荡培养24h，测量菌体生物量。结果如图7所示，当盐浓度为0～70g/l时，菌株h7生长良好，当盐浓度为100g/l～150g/l时，菌株h7几乎不生长。三、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7降解高浓度油脂和降解油脂产鼠李糖脂(1)降解高浓度油脂接种量的优化：将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7按2％、4％、5％、6％、8％、10％的接种量接种到以大豆油为唯一碳源的大豆油降解培养基中，在温度为50℃，ph自然，180r/min的条件下发酵72h，测量发酵液的生物量和脂肪酶酶活。结果如图8所示，当菌株h7的接种量为5％时，生物量和脂肪酶酶活均达到最大。发酵温度的优化：将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的种子液按照5％的接种量接到大豆油降解培养基中，在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，180r/min的条件下发酵72h，测量发酵液的生物量和脂肪酶酶活。结果如图9所示，当发酵温度为45℃～60℃时，菌株h7生长良好，在发酵温度为50℃时，脂肪酶酶活达到最大。发酵初始ph的优化：将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的种子液按照5％的接种量接到初始ph＝4、5、6、7、8、9、10的大豆油降解培养基中，在50℃，180r/min的条件下发酵72h，测量发酵液的生物量和脂肪酶酶活。结果如图10所示，当大豆油降解培养基的初始ph＝5～10时，菌株h7生长良好，在初始ph＝8时，脂肪酶酶活达到最大。转速的优化：将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的种子液按照5％的接种量接到大豆油降解培养基中，在50℃，初始ph＝8，摇床转速为120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min、240r/min的条件下发酵72h，测量发酵液的生物量和脂肪酶酶活。结果如图11所示，当摇床转速为220r/min时，生物量和脂肪酶酶活均达到最大。发酵时间的优化：将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的种子液按照5％的接种量接到大豆油降解培养基中，在50℃，初始ph＝8，摇床转速为220r/min的条件下发酵24h、48、72h、96h、120h，测量发酵液的生物量、脂肪酶酶活和油脂降解率。结果如图12和图13所示，当发酵时间为96h时，生物量、脂肪酶酶活和大豆油降解率均达到最大。如图14，发酵结束时，清澈的大豆油降解培养基表面的油花，降解至肉眼观察不到，发酵液呈乳白色。(2)降解油脂产鼠李糖脂将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的种子液按5％的接种量接种到含5～25g/l餐饮废油的餐饮废油发酵培养基中，50℃，200r/min振荡培养，以不接入菌的发酵培养基为对照，每隔24h测定鼠李糖脂产量。结果如图15所示，由于餐饮废油是菌株h7生长的能源物质，也是转化生成鼠李糖脂的底物，因此鼠李糖脂的含量随餐饮废油的浓度增大而增大，并且最高产量可达1119.87mg/l。图15中，5g/l、10g/l、25g/l为培养基中餐饮废油的含量。不同浓度的餐饮废油的降解率见下表4所示。表4不同浓度的实际餐饮废油降解率四、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7降解蛋白质(1)降解牛奶蛋白将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的种子液按5％的接种量接种到以牛奶蛋白质为唯一碳氮源的牛奶蛋白降解培养基中，50℃，200r/min振荡培养0～96h，每隔12h测定蛋白质降解率。以不接入菌的牛奶蛋白降解培养基样品中的蛋白质含量为对照，蛋白质降解率d的公式为：式中，d1-蛋白质降解率，％x-对照组蛋白质含量，g/ly-样品中的蛋白质含量,g/l。测得结果如下表5所示。表5蛋白质降解率培养时间(h)发酵前蛋白含量(g/l)发酵后蛋白含量(g/l)降解率(％)03023.32722.242123020.75130.829243019.71734.278363018.97736.742483018.49238.36603018.153939.487723018.00639.979843016.88743.71963016.14846.173结果表明，0h的样品，在4℃的保藏温度下，蛋白质降解率为22.242％，说明培养菌体种子液时，已经分泌了蛋白酶，并且在4℃条件下可以降解蛋白质。随着时间延长，营养物质逐渐减少，菌体生长缓慢，蛋白质的降解率增长也逐渐缓慢。如图16，发酵结束时，浑浊的牛奶蛋白降解培养基变澄清。4℃是短期保藏菌种和保存实验样品的温度。(2)降解角蛋白将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的种子液按5％的接种量接种到以羽毛为唯一碳氮源的羽毛降解培养基中，50℃，200r/min振荡培养72h、96h、120h，使角蛋白降解，对发酵液进行离心，去上清，烘干至恒重。羽毛降解率的计算公式为：式中，d2-羽毛降解率，％a-发酵前羽毛的重量，gb-发酵后羽毛的重量,g。测得结果如下表6所示。表6羽毛降解率培养时间发酵前干重(g)发酵后干重(g)降解率(％)对照组0.30.2990.30％72h0.30.08372.30％96h0.30.06877.30％120h0.30.05482.00％结果表明，将菌株h7接种到羽毛降解培养基中培养72h时，对羽毛的降解率达到72.3％，继续培养到120h，羽毛降解率达到82.0％。如图17，发酵结束时，完整羽毛已经完全脱落降解，降解液体为深色浑浊液。(3)降解肉蛋白将嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7的种子液按5％的接种量接种到以动物肉蛋白为唯一碳氮源的动物肉蛋白降解培养基中，50℃，200r/min振荡培养72h，观察降解前后的培养基变化。结果如图18，将菌株h7接种到动物肉蛋白降解培养基中培养72h时，菌株h7能将肉眼可见的大颗粒肉蛋白降解成能完全溶解于液体培养基中的小分子物质，因此培养基由清澈变得浑浊。以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。序列表<110>中微泽美环保科技（杭州）有限公司<120>一株嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1412<212>dna<213>嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌h7(aneurinibacillusthermoaerophilus)<400>1ttcggcggctggctccagaaggttacctcaccgacttcgggtgttgcaaactctcgtggt60gtgacgggcggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgat120tactagcgattccggcttcatgcaggcgagttgcagcctgcaatccgaactgagaacggt180ttttagggattggctcaccctcgcgggttggcacgcccgttgtaccgtccattgtagcac240gtgtgtagcccaggacataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccgtc300ttgtcgacggcagtctccttagagtgcccaactgaatgctggcaacaaaggacaagggtt360gcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcacc420acctgtcaccgctgtcccgaaggaaacctccatctctggaggggtcagcgggatgtcaag480ccctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcggg540tccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggagtgcttat600tgcgttagctgcggcactgaggaggtggactccccaacacctagcactcatcgtttacgg660cgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcag720ttacaggccagagagccgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcacc780gctacacgtggaattccgctctcctctcctgcactcaagctccccagtttcagatggccc840tccacggttgagccgtgggctttcacacctgacttaagaagccgcctgcgcgcgctttac900gcccaataattccggacaacgcttgccccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagt960tagccggggctttctcgtcaggtaccgtcagaccgggaggtcatcccggcggttcttccc1020tgacaacagagttttacgatccgaagaccttcctcactcacgcggcgttgctccgtcaga1080ctttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctggg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