本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种单个外泌体的分离方法和核酸测序方法。
背景技术：
外泌体(exosomes)是一种细胞向胞外空间分泌的直径大约为30～150nm的具有脂质双层膜的微小膜泡，不同来源外泌体大小也有一定的差异。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水、脑脊液等；外泌体还可通过体液循环等途径到达其他细胞或组织。外泌体携带和传递重要的信号分子，通过在细胞间传递各种信号分子，参与细胞间通讯，从而调控多种生理过程。研究表明外泌体可能与多种疾病的发生和进程有关系。外泌体中富含核酸(microrna、lncrna、circrna、mrna、trna等)、蛋白、胆固醇等物质，这些物质通过外泌体实现在体内的转运。
目前分离外泌体的方法有超速离心法和超过滤法。分离获得的外泌体纯度不高，并且获得的是批量的外泌体，并不能获得单个外泌体。而不同来源的外泌体之间存在一定的异质性，常规的外泌体分离方法不能实现单细胞水平的外泌体分析。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种单个外泌体的分离方法和核酸测序方法，所述方法操作简单，能够实现单个外泌体的分离以及核酸测序。
本发明提供了一种单个外泌体的分离方法，包括以下步骤：1)从体液中分离获得批量外泌体；2)将所述批量外泌体与油质液滴溶液混合获得混悬液；3)将所述混悬液用微流控通道进行分离获得单个液滴包裹的单个外泌体；所述油质液滴溶液中单个油质液滴的粒径为150～250nm。
优选的，步骤2)中所述的批量外泌体与油质液滴溶液的体积比为1:(8～12)。
优选的，步骤2)中所述的批量外泌体与油质液滴溶液的体积比为1:10。
优选的，步骤2)中所述混合的温度为20～25℃。
优选的，步骤2)中所述混合的时间为4～8min。
优选的，步骤3)中所述的微流控通道为300nm级通道。
优选的，所述体液包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水、脑脊液、鼻腔分泌物和阴道分泌物中的一种。
优选的，步骤1)中所述分离获得批量外泌体的方法包括超速离心法、超滤法、体积排阻色谱、微流控、亲和法和基于聚合物的共沉淀法中的一种。
本发明提供了一种单个外泌体的核酸测序方法，包括以下步骤：对所述的分离方法分离获得的单个外泌体进行建库测序或纳米孔测序。
本发明的有益效果：本发明提供了一种单个外泌体的分离方法，所述方法利用特定粒径的单个油质液滴包裹单个外泌体，然后再利用微流控技术分离单个油质液滴，实现单个外泌体的分离，操作简单，分离效果提升30％以上。
具体实施方式
本发明提供了一种单个外泌体的分离方法，包括以下步骤：1)从体液中分离获得批量外泌体；2)将所述批量外泌体与油质液滴溶液混合获得混悬液；3)将所述混悬液用微流控通道进行分离获得单个液滴包裹的单个外泌体；所述油质液滴溶液中单个油质液滴的粒径为150～250nm。
在本发明中，从体液中分离获得批量外泌体。在本发明中，所述体液优选的包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水、脑脊液、鼻腔分泌物和阴道分泌物中的一种。在本发明中，所述分离获得批量外泌体的方法优选的包括超速离心法、超滤法、体积排阻色谱、亲和法和基于聚合物的共沉淀法中的一种。本发明对所述超速离心法、超滤法、微流控、体积排阻色谱、亲和法和基于聚合物的共沉淀法的具体步骤没有特殊限定，参见文献：张玉星张响陈文杰张丽果外泌体分离方法研究进展，《转化医学电子杂志》2018年04期)。
本发明在获得所述批量外泌体后，将所述批量外泌体与油质液滴溶液混合获得混悬液。在本发明中，所述的批量外泌体与油质液滴溶液的体积比为1:(8～12)，更优选为1:10。在本发明中，所述混合的温度优选为20～25℃，所述混合的时间优选为4～8min，更优选为5min。在本发明中，所述混合优选的通过恒温旋转摇床实现，所述混合的转速优选为10rpm。在本发明中，所述油质液滴溶液中单个油质液滴的粒径优选为180～220nm，更优选为200nm。在本发明中，所述油质液滴优选的购自赛默飞旗下invitrogenlipofectamine3000，也可选择其他符合油质液滴粒径条件的脂质体。在本发明所述混悬液中，每一个油质液滴包裹单个外泌体。
在本发明获得所述混悬液后，将所述混悬液用微流控通道进行分离获得单个液滴包裹的单个外泌体。在本发明中，所述的微流控通道优选为300nm级通道。在本发明中，微流控通道可选择10xgenomics，fluidigmc1等仪器，或丰能医药科技(上海)有限公司自研的分离设备。
本发明提供了一种单个外泌体的核酸测序方法，包括以下步骤：对所述分离方法分离获得的单个外泌体进行建库测序或纳米孔测序。在本发明中，所述建库测序优选的采用smart-seq&smart-seq2、cel-seq、drop-seq和indrop测序的方法，优选的包括以下步骤：
获取的液滴经过细胞裂解处理，在裂解液中加入oligo(dt)的引物反转录合成cdna，由于逆转录酶在到达5’末端时遇到真核mrna特有的帽子结构，会连续在末端添加几个胞嘧啶核苷酸，生成第一链。然后添加还有olig(dg)的引物，退火后结合在第一链的3’端预poly(c)突出杂交，合成第二链。这样得到的cdna经过pcr扩增，获得纳克级的dna，纯化后用纳米孔测序仪测序，或者用illumina，neb等公司的见库试剂盒建库，然后上二代测序仪测序(参考http://www.360doc.com/content/19/0829/13/52645714_857742350.shtml)在本发明中，所述纳米孔测序优选的委托测序公司进行，详细步骤参见：新型纳米孔测序法，nanopore公司的产品介绍。(见https://nanoporetech.com/cn/)
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
从血液中分离单个外泌体
收集血液样本，分离血浆；利用磁珠抗体法分离血浆中的外泌体：
具体步骤如下：
将血液以1500rpm常温离心10min，取上清液。将上清液与100μlcd62抗体的磁珠进行旋转混合1h，再放置于磁力架10min，弃上清液，以500μl的pbs洗3遍。将分离获得的外泌体与油质液滴溶液按照体积比为1:10的比例在25℃混合5min获得混悬液；
将所述混悬液置于微流控仪中，利用300nm通道进行分离获得包裹单个外泌体的单个油质液滴。
实施例2
从血液中分离单个外泌体
收集血液样本，分离血清；利用超速超速离心法分离血清中的外泌体：
具体步骤如下：
将液体以300g/min常温离心10min，取上清液。将上清液2000g/min常温离心10min，取上清液。将上清液10000g/min常温离心30min，取上清液。将上清液200000g/min常温离心70min，取上清液。以100μl的pbs重悬。
将分离获得的外泌体与油质液滴溶液按照体积比为1:9的比例在25℃混合6min获得混悬液；
将所述混悬液置于微流控仪中，利用300nm通道进行分离获得包裹单个外泌体的单个油质液滴。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。