布鲁氏菌A19bvfA基因缺失株及其构建和应用的制作方法

本发明涉及一种基因缺失株的应用及其构建方法，具体地说，涉及布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株及其构建和应用。

背景技术：

布鲁氏菌病是一种世界性的人畜共患病，每年估计有50万新病例。感染后可出现急性或隐匿性起病，伴有持续性、间歇性或不规则发热性疾病、疲劳、厌食、体重减轻、头痛、关节痛或全身疼痛。病情可能发展为慢性疾病，并伴有严重并发症。目前有170多个国家报道有布鲁氏菌病。在我国有除了澳门和台湾剩下地区都有人、畜有布病存在。布鲁氏菌很少见细菌的特殊结构。其毒性主要是其生存和繁殖的能力在专业和非专业的吞噬细胞。为此，布鲁氏菌破坏吞噬体的成熟，在受感染的真核细胞内破坏囊泡运输，并创造一个独特的细胞内生态位，使其增殖。由布鲁氏菌操纵子编码的iv型分泌系统(t4ss)被认为是一种重要的毒力因子。缺乏t4ss的突变体无法在巨噬细胞和上皮细胞以及小鼠毒力模型中存活和繁殖。t4ss可能的作用是将诱导复制生态位建立的效应分子注入宿主细胞使含布鲁氏菌的吞噬小体逃脱经典的内体转运途径，避免与晚期内体融合。为了找到t4ss的效应因子，融合耶尔森菌毒素yopp作为报告基因，发现了一个新的毒力因子，由于大多数研究t4ss效应蛋白已显示具有c末端信号，而bvfa蛋白是n末端信号，反驳了是virb效应分子的结论，因此，bvfa基因不属于virb效应分子，单独将其命名为brucellavirulencefactora(bvfa)，布鲁氏菌毒力因子a(bvfa)是一种布氏杆菌属特有的小的胞质周围蛋白，对布鲁氏菌的毒力至关重要。

bvfa(brucellavirulencefactora)是在鉴定猪种布鲁氏菌(b.suis)t4ss底物的基因组扫描过程中发现的该属特有的一种分子量为11kda的胞质蛋白，bvfa基因在自然感染临床菌株中存在99％，对布鲁氏菌的毒力至关重要。布鲁氏菌毒力因子a(bvfa)是一种布氏杆菌属特有的小的胞质周围蛋白，对布鲁氏菌的毒力至关重要。经构建布鲁氏菌1330bvfa::kan突变体bvfa基因缺失株侵染thp1、j774和hela细胞均表现出减弱的表型，在感染后24小时和48小时细胞内增殖显著减少。布鲁氏菌1330bvfa::kan突变体腹腔感染小鼠模型在4周和8周时，bvfa突变体小鼠的脾脏中恢复的cfu数量分别比野生型小鼠低1.7和3.5log。布鲁氏菌bvfa突变体很快从脾脏中被清除，而野生型则保持在较高的水平。布鲁氏菌bvfa突变体在体内和体外模型中毒力都是高度减弱的，说明bvfa基因在布鲁氏菌体内体外生存扮演着重要的角色。但是bvfa没有在genbank中报道，在genbank中没有同源蛋白，也没有保守的结构域或结构特征(prosite[http://au.expasy.org/prosite/)。本专利根据文献报道的bvfa基因所在区域1283bp的碱基中预测开放性读码框，我们发现的三个开放性读码框中只有一个是111个氨基酸质量大约为11kda，于是把bvfa基因的全序列确定下来且提交在ncbi上。

因此，敲除bvfa基因，建立基因组型a19bvfa基因缺失株，探究bvfa基因在布鲁氏菌中的功能，具有很大的应用前景。

技术实现要素：

本发明旨在提供布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株及其构建和应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株的构建方法，包括如下步骤：

s1，利用引物mpp-5f和mpp-5r从布鲁氏菌基因组上扩增上游同源重组手臂，利用引物mpp-3f和mpp-3r扩增下游同源重组手臂，利用引物mpp-knf和mpp-knr从pkd4质粒上扩增卡那霉素抗性基因，利用引物mpp-5f和mpp-3r将mpp基因上、下游同源重组手臂与卡那霉素抗性基因通过融合pcr技术连接，得到完整打靶片段δmpp::kn；所述引物mpp-5f、mpp-5r、mpp-3f、mpp-3r、mpp-knf和mpp-knr的核苷酸序列如seqidno.1-6所示；

s2，将打靶片段δmpp::kn克隆入自杀质粒pcvd442，获得打靶质粒pcvd442-δmpp::kn；

s3，将打靶质粒pcvd442-δmpp::kn电转化进入大肠杆菌β2155菌株，培养至单克隆形成，即得到供体菌株β2155/pcvd442-δmpp::kn；

s4，将供体菌株β2155/pcvd442-δmpp::kn与受体菌布鲁氏菌bab进行接合，将接合后的菌液培养至单克隆形成，得到目的菌株bab/δmpp::kn，即布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株。

本发明的目的之二在于提供利用上述方法构建的布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株。

本发明的目的之三在于提供利用上述布鲁氏菌a19bvfa缺失株制备的布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株疫苗。

本发明的有益效果：

1.本发明同源上下游臂质粒转化不用电转化仪，不需做感受态，省时间，转化率高。

2.本发明构建的的布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株较原始布鲁氏菌a19的毒性减弱，安全性高。

3.本发明构建的的布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株疫苗，可区分自然感染和疫苗免疫的疫苗。因为bvfa基因的缺失，疫苗注射动物产生没有针对这个基因的抗体，因此只需要检测动物血液有无抗bvfa基因的抗体，有则为自然感染，无则为疫苗免疫。

附图说明

图1为打靶质粒序列电泳图，图中，m:dna分子量标准。从上到下分子量依次为：10000、8000、6000、5000、4000、3000、2500、2000、1500、1000、750、500、250bp，其中1000、3000bp加亮。1：打靶序列(上游同源重组臂-kn抗性基因编码序列-下游同源重组臂)，长度3186bp。

图2为外侧引物扩增产物电泳图，图中，m:dna分子量标准。从上到下分子量依次为：8000、5000、3000、1500、1000、500bp，其中3000bp加亮。1-5:第2-8号克隆外侧引物的扩增结果；+：原始菌阳性对照；-：无模板阴性对照。

图3为内部引物扩增产物电泳图，图中，m:dna分子量标准。从上到下分子量依次为：2000、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮。1-18：第1-18号克隆的内部引物扩增结果，产物长度：202bp；+：原始菌株的内部引物扩增结果；-：无模板阴性对照扩增结果。

图4为布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株与布鲁氏菌a19菌株bvfa基因引物扩增结果，图中，m:dna分子量标准。从上到下分子量依次为：2000、1000、750、500、250、100bp，其中750bp加亮。1:布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株bvfa基因扩增结果(未见bvfa基因，bvfa基因已经敲除)；2：布鲁氏菌a19bvfa基因扩增结果(可见bvfa基因)。

图5为布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株与布鲁氏菌a19菌株的生长曲线，图中可见a19bvfa基因缺失株明显减弱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株的构建

(1)利用引物mpp-5f和mpp-5r从布鲁氏菌基因组上扩增上游同源重组手臂，利用引物mpp-3f和mpp-3r扩增下游同源重组手臂，利用引物mpp-knf和mpp-knr从pkd4质粒上扩增卡那霉素抗性基因，利用引物mpp-5f和mpp-3r将mpp基因上、下游同源重组手臂与卡那霉素抗性基因通过融合pcr技术连接，得到完整打靶片段δmpp::kn，(上游同源手臂-卡那霉素抗性基因-下游同源手臂)，如图1所示。

所述引物序列如下：

mpp-5f:gctcttgcatccgggcatc；seqidno.1；如seqidno.1所示；

mpp-5r:tccgattatcgcgaagaagaatacg；如seqidno.2所示；

mpp-3f:ggccgtgcactccagattg；如seqidno.3所示；

mpp-3r:gctgctctatcacaaggacacg；；如seqidno.4所示；

mpp-knf:cgtattcttcttcgcgataatcggacatatgaatatcctccttagttcctattc；

如seqidno.5所示；

mpp-knr:caatctggagtgcacggccgagctgcttcgaagttccta；如seqidno.6所示。

其中，上、下游同源重组臂的扩增的pcr扩增体系：bab菌液0.2μl，mpp-5f/3f(50pmol/μl)0.2μl，mpp-5r/3r(50pmol/μl)0.2μl，dh2o9.4μl，primestarmaxpremix(2×)，takara10μl，total20μl。程序：1.95degree

5min，(95degree30sec，60degree30sec，72degree60sec；10cycles)72degree7min。

卡那霉素抗性基因的pcr扩增体系：pkd4(10ng/ul)0.2μl，mpp-knf(50pmol/μl)0.2μl，mpp-knr(50pmol/μl)0.2μldh2o9.4μl，primestarmaxpremix(2×)10μl，total20μl。程序：1.95degree5min，(95degree30sec，60degree30sec，72degree60sec；10cycles)72degree7min。

融合pcr扩增体系：mpp-5f/5rpcr产物3.2μl，mpp-3f/3rpcr产物3.2μl，mpp-knf/rpcr产物3.2μl，mpp-5f(50pmol/μl)0.2μl，mpp-3r(50pmol/μl)0.2μl，primestarmaxpremix(2×)10μl，total20μl。

程序：1.95degree5min，(95degree30sec，60degree30sec，72degree60sec；25cycles)72degree7min。

(2)打靶质粒pcvd442-δmpp::kn的构建：pcvd442质粒经smai酶切后，割胶纯化。pcvd442(～100ng/μl)10μl，10tangobuffer(mbi)5μl，smai(10u/μl，mbi)2μl，ddh2o33μl，total50μl。37度反应2小时。酶切反应结束后，载体和融合pcr产物分别经1％琼脂糖电泳分离，柱离心纯化，洗脱于50μl去离子水。连接和转化：pcvd442/smai(～50ng/μl)2μl，mpp::kn(～50ng/μl)6μl，10×t4buffer1μl，t4dnaligase(5u/μl，mbi)

1μl，total10μl。16度反应过夜。

连接产物经异丙醇沉淀后，70％乙醇洗涤，溶解于5μl去离子水。通过电转化方法将其转入大肠杆菌dh5αλpir，在lb平板(含氨苄青霉素50μg/ml，卡那霉素20μg/ml)上于37℃培养至单克隆形成。阳性克隆鉴定和打靶质粒的制备：在氨苄青霉素、卡那霉素双抗性平板上生长的克隆含有打靶片段，随机选择1个克隆进行后续实验，命名为pcvd442-δmpp::kn。接种此克隆入3mllb(含氨苄青霉素50μg/ml，卡那霉素20μg/ml)，37℃培养过夜，次日柱离心法纯化质粒dna。

(3)打靶质粒pcvd442-δmpp::kn电转化进入大肠杆菌β2155菌株，铺lb平板(含氨苄青霉素100μg/ml，0.5mmdap(二氨基庚二酸，阿拉丁))，37℃培养至单克隆形成。此克隆即为用于接合实验的供体菌株β2155/pcvd442-δmpp::kn。

(4)接合实验

a.在tsb平板上划线接种受体菌布鲁氏菌bab，30℃培养至单克隆形成。挑单克隆入3mltsb，30℃，220rpm培养至对数生长期。

b.挑β2155/pcvd442-δmpp::kn单克隆入3mllb(含amp100μg/ml，0.5mmdap)。37℃，220rpm培养过夜。

c.取500μl供体菌β2155/pcvd442-δmpp::kn菌液与500μl受体菌菌液混合进行接合实验。

d.取适量接合后菌液涂布于含有卡那霉素(25μg/ml)的tsb平板，30℃培养至单克隆形成。

(5)mpp基因敲除菌株筛选

在抗性抗性平板上，随机挑选5个克隆，依次用10μl枪头挑入20μltsb培养基。取微量菌液用mpp基因外侧引物进行pcr鉴定。外侧引物原始菌株的扩增产物长度为2161bp，当目标基因被卡那霉素抗性基因取代后，扩增产物长度增长为3292bp；结果(图2)显示：第1和5号克隆有近3200bp的特异性产物扩增，它们的mpp已被替换。

所述外侧引物序列如下：

mpp-outf:ttgttgcggcttatgtagattgcg；seqidno.7所示；

mpp-outr:acaatccgcaggactatgtgacg；seqidno.8所示。

外侧引物鉴定pcr反应体系：菌液0.5μl，10dreamtaqbuffer5μl，dntp(2.5mm)4μl，mpp-outf(50pmol/μl)0.5μl，mpp-outr(50pmol/μl)0.5μl，dreamtaqdnapolymerase(5u/μl,mbi)0.5μl，dh2o39μl，total50μl。程序：95degree5min，95degree30sec，61degree30sec，72degree3.5min，35cycles，72degree7min。

取第1号克隆的少量菌液，划线接种含10％蔗糖的lb平板，此步为反向筛选，去除基因组上一次重组的中间状态克隆。单纯的二次重组阳性克隆再无mpp基因存在，基因内部引物扩增结果为阴性。随机挑选18个克隆，依次用10μl枪头挑入20μltsb培养基，取微量菌液用mpp基因内部引物进行扩增实验。结果(图3)显示：所有18个克隆均无特异产物扩增，表明mpp基因已从基因组上完整删除。取第1号克隆，接种3mltsb(含25μg/ml卡那霉素)，30℃，220rpm培养至对数生长中期，取微量菌液再行外侧引物扩增，并将扩增产物pcr(图4)验证并进行测序验证。结果显示，目标基因位置被卡那霉素抗性基因替代，与设计一致。确定此克隆为mpp基因敲除克隆，称为：bab/δmpp::kn。

内部引物序列如下：

mpp-inf:gctctgcatcgtatagagccagc；seqidno.9所示

mpp-inr:gcaggtccgcaaggatgtgag；seqidno.10所示。

内部引物鉴定pcr反应体系：菌液0.5μl，10taqbuffer5μl，dntp(2.5mm)4μl，mpp-inf(50pmol/μl)0.5μl，mpp-inr(50pmol/μl)0.5μl，taqdnapolymerase(5u/μl,mbi)0.5μl，

dh2o39μl，total50μl。反应95degree5min，95degree30sec，61degree30sec，72degree30sec，30cycles，72degree。

菌株保存：

取600μlbab/δmpp::kn的新鲜培养菌液，加入等体积50％无菌甘油作为菌株，置-80℃长久保存。

布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株与布鲁氏菌a19菌株的生长曲线：

按照od600≈0.08的接种量将布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株与布鲁氏菌a19菌株接种在tsb培养液中，30℃，5％co2培养，每隔2个小时测定od600的吸光值，制备生长曲线。可见布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株生长明显弱于布鲁氏菌a19原始菌株(图5)。

本发明构建的的布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株可用于制备布鲁氏菌a19bvfa基因缺失株疫苗，区分自然感染和疫苗免疫。因为bvfa基因的缺失，疫苗注射动物产生没有针对这个基因的抗体，因此只需要检测动物血液有无抗bvfa基因的抗体，有则为自然感染，无则为疫苗免疫。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>宁夏大学

<120>布鲁氏菌a19bvrfa基因缺失株及其构建和应用

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gctcttgcatccgggcatc19

<210>2

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<212>dna

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<212>dna

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<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

ttgttgcggcttatgtagattgcg24

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<212>dna

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<400>8

acaatccgcaggactatgtgacg23

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<212>dna

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<400>9

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<212>dna

<213>人工序列

<400>10

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