一种山田平脐蠕孢菌菌株、其筛选和鉴定方法及其用途与流程

本发明属于微生物应用于农业植物保护、防除农作物杂草的技术领域，具体涉及一种山田平脐蠕孢菌菌株bipolarisyamadae(y.nisik.)shoemaker(hxdc-1-2)、其筛选和鉴定方法及其用途。

背景技术：

草害是导致作物减产的最主要因素之一，每年导致全球农业950亿美元损失。中国农田草害面积约7880万公顷，在每年投入235亿元人民币杂草防除费用情况下，仍然造成粮、棉、油损失1460万t，直接经济损失近千亿元人民币。稗、野燕麦、看麦娘、马唐、千金子、牛筋草、狗尾草、藜、鸭舌草为农田十大害草，其中禾本科占80％。自从人类开始从事农业生产活动以来，尝试对其进行防除的努力从未停止，20世纪50年代初，化学除草剂因其使用方便、见效快等特点而得到迅速发展。随着化学除草剂的广泛使用，带来的负面影响也日益明显。大量施用化学除草剂带来了环境污染危机；长残效除草剂的应用引起了残毒药害，导致下茬作物减产甚至土地退化。全世界已有100余种化学除草剂在30余个国家被禁用或取消登记。抗药性杂草种群的形成，全球已发现188种杂草的324个生物型对19类化学除草剂产生了抗药性，使得药效降低、用药量增加、成本提高，也更加重了污染。后果是导致除草剂品种的单一化，增加了抗性演化风险，也增强了市场对研制广谱、高效、低毒新除草剂和发展生物除草的技术需求。发展绿色除草剂特别是生物除草剂替代化学除草剂，是解决这一矛盾的重要途径。此外，相对于每个新型化学除草剂高达1亿美元的研制成本，研制生物除草剂的成本要低数十倍甚至上百倍。世界许多国家实施的农业可持续发展战略推动了此项技术的发展，因而研制生物除草剂成为对抗这些禾本科杂草的新途径。但目前少有有效的生物除草剂来针对这些禾本科杂草。

生物除草剂是指在人工控制下施用人工培养繁殖的大剂量生物制剂杀灭杂草。具有二个显著的特点：一是经过人工大批量生产而获得大量生物接种体；二是淹没式应用，以达到迅速感染、并在较短时间里杀灭杂草。1981年，devine在美国被登记注册为第一个生物除草剂。devine是土生于美国佛罗里达州的棕榈疫霉(phytophthorapalmivora)致病菌株的厚垣孢子悬浮剂，用于防除杂草莫伦藤(morreniaodorata)，防效可达90％且持效期可达2年，被广泛用于该州橘园。随后，collego获得登记，并实用化。基因工程和细胞融合技术的介入，可以重组自然界存在的优良除草基因(如强致病和产毒素等)，给人们提供了改良生物除草剂品种、提高防效和改良寄主专一性的可能性。目前商业化的生物除草剂除了80年代研制外，90年代末推出的camperico和biochon，这些除草剂在控制相应的目标杂草上起到了重要作用，甚至是唯一的选择。在已被研究的候选生防真菌又相对集中在如下几个属：炭疽菌属(colletotrichum)有18种，镰刀菌属(fusarium)13种，链格孢菌属(alternaria)12种，尾孢菌属(cercospora)8种，柄锈菌属(puccinia)，核盘菌属(sclerotinia)，叶黑粉菌属(entyloma)，壳单胞菌属(ascochyta)。目前成功用于作物生产并申请专利的主要有炭疽菌属(colletotrichumspecies)(us3,849,104和us3,999,973)；镰刀菌属(fusariumspecies)(us4,419,120)；链格孢属(alternariaspecies)(us4,390,360)；壳单孢菌属(ascochytaspecies)(us4,915,724)以及核盘菌属(selerotiniaspecies)(caoz,292,233)；小菌核菌属(sclerotiumrolfsii)(sc64)等。目前国内对于平脐蠕孢属已有狗尾草平脐蠕孢、玉蜀黍平脐蠕孢和稷平脐蠕孢用于生物除草剂的专利，尚没有山田平脐蠕孢菌的申报，也没有其应用在作物田禾本科杂草和草坪杂草以及柔枝莠竹及其近缘种的生物防除报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对水稻、玉米、大豆、花生、芝麻、粟、蚕豆、豌豆、油菜、蔬菜、花卉、中药材、果树等作物田的杂草(稗草、狗尾草、马唐、牛筋草、千金子、虮子草、野燕麦、看麦娘、假高粱、柔枝莠竹等禾本科杂草，碎米莎草、旋鳞莎草、扁穗莎草等一年生莎草以及如葎草、合萌、藜、小藜等阔叶杂草)，筛选一种山田平脐蠕孢菌菌株，用于生物除草，高效、环保，成本低，无污染，对农作物安全，除草效果明显。

为达以上目的，本发明公开了一种山田平脐蠕孢菌菌株、其筛选和鉴定方法及其用途，采用的技术方案如下：

一种山田平脐蠕孢菌菌株，所述菌株为山田平脐蠕孢菌菌株hxdc-1-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17778。

优选地，所述菌株的菌落直径为50～60mm，灰黑色，菌落背面黑褐色，无水溶性色素；其分生孢子梗呈橄榄绿或黄褐色，单生或少数丛生，顶端色浅，屈膝状弯曲，宽4.5～9.5μm；其分生孢子呈黄褐色至深褐色，拟纺锤形或倒棍棒形，直或微弯，中部略宽，两端略窄，基细胞钝圆，光滑，6～9个假隔膜，54.5～92.5×12.5～17.5μm。

一种山田平脐蠕孢菌菌株的筛选和鉴定方法，包括以下步骤：

步骤1)将该菌株于28℃黑暗培养箱培养四天，采用真菌gdna提取试剂盒提取dna，分别利用rdnaits序列、gpdh序列和ef1α序列进行pcr扩增，其通用引物分别为its4、its5、gpd1、gpd2、ef1-983f、ef1-2218r；

its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’

its5：5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’

gpd1：5’-caacggcttcggtcgcattg-3’

gpd2：5’-gccaagcagttggttgtgc-3’

ef1-983f：5’-gcyccygghcaycgtgayttyat-3’

ef1-2218r：5’-atgacaccracrgcracrgtytg-3’

步骤2)将步骤1)得到的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收，连接至pmd19载体，转化大肠杆菌dh5α，经过蓝白斑筛选，挑取白色菌落，摇菌，得到菌液；

步骤3)对步骤2)制得的菌液进行测序，所测结果在genbank中核酸数据库的its、gpdh和ef1α相关序列进行同源性比较；

步骤4)经扩增测序比对后，ef1α扩增序列mk026429、ky905693分别与bipolarisyamadae模式菌株accc36334、cbs127087同源性均为99％以上，its扩增序列mf490813与bipolarisyamadae模式菌株cpc28807的同源性为99％以上，gpdh扩增序列mf490835与bipolarisyamadae模式菌株cpc28807同源性为99％，可确定菌株为山田平脐蠕孢菌。

利用上述分子标记作为引物，也可以进行检测，检测出上述分子标记序列与bipolarisyamadae模式菌株cpc28807同源性为99％，可以确定为该菌株，是本专利保护的范围。

优选地，所述its扩增序列mf490813如seqidno：1所示，所述gpdh扩增序列mf490835如seqidno：2所示，所述ef1α扩增序列mk026429、ky905693如seqidno：3所示。但不限于以上分子标记。

山田平脐蠕孢菌菌株用作生物除草剂的用途。

山田平脐蠕孢菌菌株用作生物除草剂的用途：用所述山田平脐蠕孢菌菌株的分生孢子的浓度为每毫升10²个以上，接种于作物田的目标杂草上。

优选地，所述杂草包括禾本科杂草、莎草科杂草、阔叶杂草，其中，所述禾本科杂草包括稗草、狗尾草、马唐、牛筋草、千金子、虮子草、野燕麦、看麦娘、假高粱、柔枝莠竹及其近缘属植物；所述莎草科杂草包括碎米莎草、旋鳞莎草、扁穗莎草；所述阔叶杂草包括葎草、合萌、藜、小藜。但不限于以上杂草。

优选地，所述柔枝莠竹近缘属植物包括莠竹、刚莠竹、日本莠竹、荩草。

优选地，所述作物包括水稻、玉米、大豆、花生、芝麻、粟、蚕豆、豌豆、油菜、蔬菜、花卉、中药材、果树。但不限于以上作物。

优选地，所述蔬菜包括青菜、白菜、萝卜、丝瓜、茄、辣椒；所述中药材包括紫苏、荆芥、活血丹；所述果树包括杨梅。但不限于以上蔬菜、中药材和果树作物。

本发明具有以下优点和积极效果：

1、山田平脐蠕孢菌柔枝莠竹专化型菌剂用于生物除草可以在作物与禾本科杂草间进行安全地选择。本发明的除草剂对环境友好，可抑制杂草的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对农作物安全。在供试的30科103种作物或经济植物中，对山田平脐蠕孢菌敏感的有33种，稍敏感的有15种，不敏感的有5种，其中有敏感性的植物大都集中在禾本科，对于其他科植物如豆科、十字花科、胡麻科、部分禾本科等植物敏感性较弱。因此该菌株可用于水稻、玉米、大豆、花生、芝麻、粟、蚕豆、豌豆、油菜、蔬菜、花卉、中药材、果树等作物田，用于控制农田杂草包括稗草、狗尾草、马唐、牛筋草、千金子、虮子草、野燕麦、看麦娘、假高粱、柔枝莠竹等禾本科杂草，碎米莎草、旋鳞莎草、扁穗莎草等一年生莎草以及如葎草、合萌、藜、小藜等阔叶杂草。

2、本发明的山田平脐蠕孢菌菌株应用于生物除草，是利用活的生物本身，该生物是直接采集于自然环境，是目标作物田及其环境中发生的目标杂草的天然致病菌，由于环境中已经存在，故没有在使用过程中的生态风险，加之，该菌株专化性强，对作物及其它非目标植物安全性高，不会导致对环境的残留危害，其菌体死亡后迅速腐化降解，降解产物均为可循环有机物，不会导致污染，因而，对环境安全，可用于生产出绿色或有机农产品。

3、该菌株对目标杂草控制效果可以达到80％以上，特别是苗期的植株。

4、根据测试，山田平脐蠕孢菌hxdc-1-2对大多数作物安全，仅对高粱有中度敏感性，棉花、小麦和大麦具有弱的敏感性，在水稻、玉米、大豆、花生、芝麻、粟、蚕豆、豌豆、油菜、蔬菜、花卉、中药材、果树作物田可以安全使用，并能用于控制上述田间的杂草(包括稗草、狗尾草、马唐、牛筋草、千金子、虮子草、野燕麦、看麦娘、假高粱、柔枝莠竹等禾本科杂草，碎米莎草、旋鳞莎草、扁穗莎草等一年生莎草以及如葎草、合萌、藜、小藜等阔叶杂草)。这再次表明山田平脐蠕孢菌hxdc-1-2具有开发为防除柔枝莠竹及禾本科杂草生物除草剂的潜力。

附图说明

图1为hxdc-1-2山田平脐蠕孢菌菌株菌落形态图；

图2为hxdc-1-2山田平脐蠕孢菌菌株的分生孢子形态；

图3为hxdc-1-2山田平脐蠕孢菌菌株的凝胶电泳图；

图3中1、2为ef1α序列，3、4为its序列，5、6为gpdh序列。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明做进一步详细描述。

一种山田平脐蠕孢菌菌株bipolarisyamadae(y.nisik)shoemaker(hxdc-1-2)(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2019年5月10日；保藏号：cgmccno.17778)，山田平脐蠕孢菌菌株属于真菌界(fungi)，子囊菌门(ascomycota)，座囊菌纲(dothideomycetes)，格孢腔菌亚纲(pleosporomycetidae)，格孢腔菌目(pleosporalesluttrellexbarr)，格孢腔菌科(plesporaceaenitschke)，旋孢腔菌属(cochliobolusdrechsler)[无性阶段：平脐蠕孢属(bipolarisshoemarke)]，山田平脐蠕孢菌(bipolarisyamadae(y.nisik)shoemaker)。在马铃薯葡萄糖培养基上生长较快，28℃黑暗条件下培养5天，菌落直径50～60mm，灰黑色，菌落背面黑褐色，无水溶性色素。如图1所示为山田平脐蠕孢菌培养5天后的菌落形态图。分生孢子梗橄榄绿或黄褐色，单生或少数丛生，顶端色浅，屈膝状弯曲，宽4.5～9.5μm。分生孢子黄褐色至深褐色，拟纺锤形或倒棍棒形，直或微弯，中部略宽，两端略窄，基细胞钝圆，光滑，6～9个(多数7～8个)假隔膜，54.5～92.5×12.5～17.5μm(平均69.5×14.7μm)。如图2所示为山田平脐蠕孢菌在高倍显微镜下的分生孢子形态图。

实施例1

本发明的新菌株是通过下述途径获得的，发明人对安徽、福建、广东、广西、贵州、河南、湖北、湖南、江苏、江西、四川、山东、台湾、云南、西藏和浙江省等地的森林边缘、草原、旷野、湿地、作物田边缘、沟渠、树篱、峡谷和农田的柔枝莠竹发病情况进行调查并采集发病的柔枝莠竹叶片，记录植株发病症状及有关信息并带回实验室，对其寄生真菌进行分离研究并严格按照柯赫式法则(koch’spostulate)进行了致病性验证。

首先山田平脐蠕孢菌菌株(bipolarisyamadae(y.nisik.)shoemaker)hxdc-1-2自然条件产生的孢子在柔枝莠竹上的致病症状为：柔枝莠竹罹病植株叶片上均可见大小不同的病斑，在发病早期，植物叶片表面出现深棕色或黑色病斑，圆形(直径0.25～0.40cm)或椭圆形(宽度0.25～0.3cm×长度0.4～0.5cm)病斑，边缘有黄色或绿色晕圈，叶尖和叶边缘部分黄化。在发病中期，病斑逐渐扩大，病叶边缘枯黄至棕色且轻微卷曲，部分叶片中心变成黄色至棕色。后病斑连成一片呈大片棕色或黑色，叶片枯黄或卷曲，直至叶片整株死亡。

于病叶的病健交界处切取组织块，用75％酒精和1％次氯酸钠溶液进行表面消毒。将这些组织小块接种在pda培养基上，28℃黑暗培养2天，对分离得到的菌株进行纯化培养，观察到的菌丝生长情况以及孢子产生情况也与前面相似，且为柔枝莠竹的强致病菌。将其保存于斜面培养基上，置于4℃备用。

在光学显微镜下观察分生孢子、分生孢子梗形态，同时显微照相测定分生孢子的大小。根据《中国真菌志》、《真菌鉴定手册》描述的形态特征进行病原鉴定。经鉴定，菌株hxdc-1-2的形态特征与《中国真菌志》第三十卷对山田平脐蠕孢菌(bipolarisyamadae(y.nisik.)shoemaker)的描述基本一致，鉴定为bipolarisyamadae。描述如下：分生孢子梗黄褐色，单生或簇生，有时分支，顶端色浅，屈膝状弯曲，宽4.5～9.5μm。分生孢子黄褐色至深褐色，拟纺锤形或有时倒棍棒形，直或微弯，中部略宽，基细胞钝圆，光滑，6～9个(多数7～8个)假隔膜，54.5～92.5×12.5～17.5μm(平均69.5×14.7μm)；脐部明显，略突出。

采用真菌gdna提取试剂盒(biomiga)提取致病真菌dna，分别利用rdnaits序列、gpdh序列和ef1α进行pcr扩增。其通用引物分别为its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)、its5(5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’)、gpd1(5’-caacggcttcggtcgcattg-3’)、gpd2(5’-gccaagcagttggttgtgc-3’)、ef1-983f(5’-gcyccygghcaycgtgayttyat-3’)、ef1-2218r(5’-atgacaccracrgcracrgtytg-3’)。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收，连接至pmd19载体，转化大肠杆菌dh5α，经过蓝白斑筛选，挑取白色菌落，摇菌。并进行pcr扩增，经电泳和凝胶分析仪检测，2％的琼脂糖凝胶上显示单一的明亮条带，如图3所示，图中1、2为ef1α扩增序列，目的条带大小约为800bp；3、4为its扩增序列，目的条带大小约为500bp；5、6为gpdh扩增序列，目的条带大小约500bp。将菌液委托上海生工公司进行测序，所测结果在genbank中核酸数据库的ef1α、its和gpdh相关序列进行同源性比较(blast软件分析)。经扩增测序比对后，ef1α扩增序列(mk026429，ky905693)分别与bipolarisyamadae模式菌株(accc36334，cbs127087)同源性均为99％，its扩增序列(mf490813)与bipolarisyamadae模式菌株(cpc28807)的同源性为99％，gpdh扩增序列(mf490835)与bipolarisyamadae模式菌株(cpc28807)同源性为99％以上，确定菌株为山田平脐蠕孢。its扩增序列(mf490813)如seqidno：1所示，gpdh扩增序列(mf490835)如seqidno：2所示，ef1α扩增序列(mk026429，ky905693)如seqidno：3所示。

山田平脐蠕孢菌hxdc-1-2纯培养产生的孢子在柔枝莠竹上的致病症状为：叶片表面出现明显的深褐色或黑色病斑，圆形或椭圆形，部分叶尖或叶缘出现黄化，随着时间的推移，病斑逐渐扩大且颜色加深，严重时叶片病斑密集成片，叶片顶端枯死，接种后期叶片大部分黄化或枯死，叶片卷曲。从病叶部位重新分离病菌，病斑表面的孢子与所喷施的山田平脐蠕孢菌孢子一致，符合柯赫式法则。

以上实验条件下的发病症状与自然病症相似。

本发明的山田平脐蠕孢菌菌株hxdc-1-2分离自柔枝莠竹，但它具有广谱的禾本科杂草致病力，同样它的另一个优点在于可以有效杀死很多一年生和多年生禾本科杂草，而不影响周边的作物，从这一点看，山田平脐蠕孢菌hxdc-1-2具有与化学除草剂芳香苯氧丙酸类除草剂同样的专一性，但却对环境安全。

按其特征鉴定为：子囊菌门(ascomycota)，座囊菌纲(dothideomycetes)，格孢腔菌亚纲(pleosporomycetidae)，格孢腔菌目(pleosporalesluttrellexbarr)，格孢腔菌科(plesporaceaenitschke)，旋孢腔菌属(cochliobolusdrechsler)[无性阶段：平脐蠕孢(bipolarisshoemarke)]，山田平脐蠕孢菌(bipolarisyamadae(y.nisik.)shoemaker)。该专化型菌株主要侵染柔枝莠竹及其近缘种，以及禾本科杂草，而对水稻、玉米、大豆、花生、芝麻、粟、蚕豆、豌豆、油菜、蔬菜、花卉、中药材、果树等主要作物高度免疫，在供试的30科103种作物或经济植物中，对山田平脐蠕孢菌敏感的有33种，稍敏感的有15种，不敏感的有5种，其中有敏感性的植物大都集中在禾本科，对于其他科植物如豆科、十字花科、胡麻科、部分禾本科等植物敏感性较弱。因此该菌株可用于水稻、玉米、大豆、花生、芝麻、粟、蚕豆、豌豆、油菜、蔬菜、花卉、中药材、果树等作物田，用于控制农田杂草，包括稗草、狗尾草、马唐、牛筋草、千金子、虮子草、野燕麦、看麦娘、假高粱、柔枝莠竹等禾本科杂草，碎米莎草、旋鳞莎草、扁穗莎草等一年生莎草以及如葎草、合萌、藜、小藜等阔叶杂草。

实施例2

本发明的山田平脐蠕孢菌hxdc-1-2用于生物除草，具体的应用方法为：将菌种接种于下列培养基，诱导产生分生孢子后喷施于田间或杂草发生地，使用剂量为10²～10⁶个/ml。

其培养方法为：山田平脐蠕孢菌在黑暗条件下生长约4天，将培养皿在无菌条件下置于黑光灯或紫外灯(24h)下照射，培养基在照射过程中会产生孢子。

pda培养基——马铃薯葡萄糖琼脂培养基

目前，国内外尚无关于柔枝莠竹的真菌除草剂的报道，这方面的研究为解决柔枝莠竹以及禾本科杂草的防除提供了一个新的优良的途径。本发明的除草组合物可以与其它适合的化学除草剂配合使用，从而降低化学除草剂的用量，减少对环境的污染。

根据需要，本发明的除草组合物可使用表面活性剂、稳定剂等助剂，表面活性剂如吐温20、吐温80等，稳定剂可使用抗氧化剂等。

实施例3

从野外采集到患病柔枝莠竹的叶片，记录植株发病症状，镜检。用柔枝莠竹浸汁琼脂培养基进行病原真菌的分离。在显微镜下挑取个菌株的单孢子，分别接种在pda培养基上，于黑暗，28℃下培养，观察病原真菌纯培养的菌落特征并测量菌落直径。另取直径5mm的各菌落圆片接种在pda平板中央，于4天后测量各菌落直径。

表1柔枝莠竹病原真菌菌落特征的比较

注：d1表示单孢子5天后形成的菌落直径，

d2表示5mm菌落圆片4天后形成的菌落直径。

实施例4

从自然发生于贵州贵阳的柔枝莠竹病害植株上采集分离出致病真菌，对其致病性进行了实验。分别用不同浓度的各种病原真菌孢子悬浮液(其中表面活性剂为吐温20、吐温80，稳定剂为抗氧化剂)，于自然条件下喷施柔枝莠竹，观察各真菌的致病特性。

表2从柔枝莠竹植株上分离的几种致病真菌对柔枝莠竹的致病力比较

注：10⁵、10⁴分别表示喷施的孢子悬浮液浓度为每毫升10⁵、10⁴个孢子(下同)。

小写字母为0.05显著水平，大写字母为0.01显著水平(下同)。

由表2可知，山田平脐蠕孢菌菌株hxdc-1-2致病率高于其他菌株。

实施例5

将hxdc-1-2菌株在pda培养基上培养4天，置于28℃黑光灯下照射，以无菌水配置孢子悬浮液(同实施例4)。另外在9cm的盆钵中培养柔枝莠竹幼苗，待其长至3～4叶期，用手持喷雾器喷施孢子悬浮液，28℃保湿48h，湿度80％，在处理一周后，可以完全杀死该草。

实施例6

将供试植物(见表3、4)种子播种于直径9cm的盆钵中，设置4组重复，在温度为28℃的温室中培育，当供试植物达到3～4叶期时进行接种(同实施例4、5)，每盆保留5～10株，测试hxdc-1-2菌株对于各供试植物的敏感性情况。安全性试验结果表明，hxdc-1-2菌株对高粱和豇豆有致病性，对水稻、玉米、大豆、花生、芝麻、粟、蚕豆、豌豆、油菜、蔬菜、花卉、中药材、果树等作物均无致病性。杀草谱试验结果表明，hxdc-1-2菌株对禾本科杂草稗草、狗尾草、马唐、牛筋草、千金子、虮子草、野燕麦、看麦娘、假高粱、柔枝莠竹、莠竹、日本莠竹、刚莠竹，莎草科杂草碎米莎草、旋鳞莎草、扁穗莎草以及阔叶杂草葎草、合萌、藜、小藜具有较强的致病性，此外，对马唐、牛筋草、异型莎草等具有中等水平的致病性。因此，hxdc-1-2菌株可以应用于水稻、玉米、大豆、花生、芝麻、粟、蚕豆、豌豆、油菜、蔬菜、花卉、中药材、果树等作物田，防治稗草、狗尾草、马唐、牛筋草、千金子、虮子草、野燕麦、看麦娘、假高粱、柔枝莠竹等禾本科杂草，碎米莎草、旋鳞莎草、扁穗莎草等一年生莎草以及如葎草、合萌、藜、小藜等阔叶杂草。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种山田平脐蠕孢菌菌株、其筛选和鉴定方法及其用途

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>572

<212>dna

<213>山田平脐蠕孢(bipolarisyamadae)

<400>1

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<213>山田平脐蠕孢(bipolarisyamadae)

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