一种新金分枝杆菌及其用途的制作方法

本发明属于生物工程领域，涉及一种新金分枝杆菌及其在制备甾体化合物中间体hil中的用途。

背景技术：

甾体激素类药物是我国医药领域的重要门类，在临床上被广泛使用。但是，因为甾体化合物结构复杂，合成步骤多，生产工艺复杂，污染大，收率低，导致其成本很高，经济效益薄弱。近年来，发现一些微生物，如诺卡氏菌、假单胞菌、分枝杆菌、节杆菌等能以甾醇为唯一碳源生长，随后又发现细菌、放线菌、酵母、霉菌中的某些菌株可以使甾体化合物的特定部位发生转化，其反应专一性表现出了巨大优势。因此，微生物降解甾醇生产甾体药物中间体已逐渐成为现代医药工业生产甾体激素类药物的主流，占据着极其重要的地位。

甾体类物质在上述菌中的降解为有氧降解，以分支杆菌降解胆固醇为例，其降解过程为：一、胆固醇(i，cholesterol)转化为胆甾-4-烯-3-酮(cholest-4-en-3-one)；二、侧链降解：与第一步的氧化同时进行，过程类似于脂肪酸的β-氧化，在一系列酶的催化下，生成一种重要的甾体激素前体物质雄甾-4-烯-3,17-二酮(ii，androst-4-ene-3,17-dione，简称ad)；三、中心环的降解：在一系列酶作用下，ad分裂为2-羟-2,4-二烯己酸(iii，2-hydroxyhexa-2,4-dienoicacid)和9,17二氧代-1,2,3,4,10,19-六降雄甾烷-5-羧酸(iv，9,17-dioxo-1,2,3,4,10,19-hexanorandrostan-5-oicacid，简称hip)；四、下游降解途径：2-羟-2,4-二烯己酸经过一系列酶逐步分解，能量进入三羧酸循环，而hip被转化为3aα-h-4α-(3’-丙酸)-5α-羟基-7aβ-甲基六氢-1-印酮-δ-内酯(v，3aα-h-4α-(3’-propionicacid)-5α-hydroxy-7aβ-methylhexahydro-1-indanone-δ-lactone，简称hil)，进一步被完全降解为co2和h2o。

其中，hil即本申请的δ-内酯，又称为a环降解物等，cas号：64053-02-7，是合成雌酚酮、雌二醇及其衍生物等重要药物或中间体。

现有技术中存在利用微生物降解植物甾醇直接制备hil的报道，具体地us4,042,459中公开的nrrlb-8128和cn103756940a中公开的nk-xhx-103，虽然可以降解植物甾醇积累hil，但同时产生大量的副产物，hil收率较低，重量收率为8.05-39％，生产成本高，产业化困难。

因此，当前对生产成本低，工艺简单的hil的生产方法存在需求。

技术实现要素：

因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种新金分枝杆菌突变株。本发明提供的新金分枝杆菌突变株能够将植物甾醇大量转化为hil。本发明还提供了基于该新金分枝杆菌制备hil的方法。使用本发明的新金分枝杆菌制备hil的方法与已有方法相比，hil得率高、副产物少，并且对环境没有污染。此外，本发明的菌株mnhil-4具有高产、性状稳定的特点，该菌株经过6个月的传代，性能保持稳定。

根据本发明提供的一种新金分枝杆菌的突变株，可将植物甾醇转化为hil，并且能够减少hip、hk等副产物。

其中，在本申请中，除非特别说明，hip、hil及hk分别为如下所示的化合物：

hip为9,17二氧代-1,2,3,4,10,19-六降雄甾烷-5-羧酸，由下式iv表示：

hil，又称为δ-内酯，为3aα-h-4α-(3’-丙酸)-5α-羟基-7aβ-甲基六氢-1-印酮-δ-内酯，由下式v表示：

hk，为3aα-h-4α-(3’-丙醇)-7aβ-甲基六氢-1,5-印二酮半缩酮，由下式vi表示：

具体地，本发明是通过以下技术方案实现的：

一方面，本发明提供一种用于将植物甾醇转化为hil的新金分枝杆菌(mycobacteriumneoaurum)mnhil-4，该新金分枝杆菌的保藏编号为cgmccno.17948。

该菌株已于2019年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为新金分枝杆菌：(mycobacteriumneoaurummnhil-4)，保藏号为cgmccno.17948。

该菌株具有下述性质：

1、菌落形态学特征：

将本发明的菌株于32℃下，在营养固体培养基上培养生长，3-5天后，得到直径约为3～10mm的金黄色菌落，菌落呈圆形，表面光滑。

2、菌株形态学特征：

本发明的菌株显微镜下呈现圆杆状，与分枝杆菌属镜下形态一致。

3、生理与生化特性：

本发明的菌株培养温度为28-32℃，最适生长温度为32℃，并且在ph为7.0-7.6的条件下生长较好。

4、营养特征：

本发明的菌株无需特殊营养素，使用基础培养基例如营养肉汤培养基培养，专性需氧。

另一方面，本发明提供了所述菌株的制备方法，所述方法包括使用亚硝基胍诱变新金分枝杆菌。

具体地，所述方法包括使用亚硝基胍诱变新金分枝杆菌菌株mnpj-1(保藏号为cgmccno.14181)获得。

再一方面，本发明提供了上述新金分枝杆菌mnhil-4的种子培养物。

其中，所述种子培养物通过培养新金分枝杆菌mnhil-4制备获得，是该新金分枝杆菌mnhil-4的种子培养物。

再一方面，本发明提供了一种制备新金分枝杆菌mnhil-4的种子培养物的方法，所述方法包括以下步骤：

将新金分枝杆菌mnhil-4接种于种子培养基，振荡培养36～60小时，收集发酵液，得到种子培养物；

其中，所述种子培养基包含以下组分：

牛肉膏0.1～0.5g/l，蛋白胨0.5～1.5g/l，酵母粉0.2～0.4g/l，甘油1.0～2.0g/l，吐温1.5～2.5g/l，ph7.0～7.4；

优选地，所述种子培养基包含：牛肉膏0.3g/l，蛋白胨1.0g/l，酵母粉0.3g/l，甘油1.5g/l，吐温2.0g/l，ph7.2。

优选地，所述种子培养基的制备中，将各组分与水混合后，调节ph，高压蒸汽121℃灭菌30分钟，冷却后使用。

更优选地，所述种子培养物通过包括以下步骤的方法获得：

将新金分枝杆菌mnhil-4(例如保存于1ml冷冻甘油管的菌株)接种于种子培养基，在28～32℃下、优选地在32℃下，以200～250转/分钟、优选220转/分钟振荡培养36～60小时，优选48小时，收集发酵液，得到种子培养物。

本发明提供的上述新金分枝杆菌mnhil-4或种子培养物均可用于制备hil。

再一方面，本发明提供新金分枝杆菌mnhil-4或者其种子培养物在制备hil中的用途。

还一方面，本发明提供一种制备hil的方法，所述方法包括使用本发明的新金分枝杆菌mnhil-4或其种子培养物将植物甾醇转化为hil。

其中，植物甾醇是从各种植物中提取的多种甾醇的混合物，主要包括谷甾醇、二氢谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇等，可直接购买得到。

优选地，所述方法包括以下步骤：

1)将新金分枝杆菌mnhil-4或其种子培养物接种于包含植物甾醇的转化培养基中发酵培养；

2)从步骤1)得到的发酵培养液中提取hil。

根据本发明所述的方法，其中，步骤1)中，所述转化培养基包含以下组分：

大豆蛋白胨1～5g/l，酵母提取物0.5～2.0g/l，葡萄糖0.5～2.0g/l，柠檬酸0.1～0.3g/l，柠檬酸铁铵0.01～0.05g/l，k2hpo40.5～1.5g/l，mgso4·7h2o0.01～0.1g/l，nh4no30.1～0.5g/l，植物甾醇5.0～8.0g/l(折纯)，吐温801～5g/l，ph7.0-7.6；

优选地，所述转化培养基包含以下组分：

大豆蛋白胨3g/l，酵母提取物1.0g/l，葡萄糖1.0g/l，柠檬酸0.2g/l，柠檬酸铁铵0.01g/l，k2hpo41.0g/l，mgso4·7h2o0.05g/l，nh4no30.3g/l，植物甾醇6.0g/l(折纯)，吐温802g/l，ph7.2。

本领域技术人员可以理解的是，本发明的转化培养基中的植物甾醇可以由包含植物甾醇的植物甾醇提取物代替，相应地，折纯后，植物甾醇在该转化培养基中的含量为5.0～8.0g/l。

本发明所述的转化培养基的制备中，先用50℃的水配制吐温80溶液，边搅拌边加入5.0～8.0g/l植物甾醇(折纯)或相应的植物甾醇提取物，再加入其它上述成分，调节ph，高压蒸汽灭菌。摇瓶灭菌条件为121℃灭菌30分钟。冷却后摇匀使用。

根据本发明所述的方法，其中，步骤1)中，将所述种子培养物以相对于转化培养基的体积比3～10％、优选4～6％、进一步优选5％的接种量接种于所述转化培养基中。

根据本发明所述的方法，其中，步骤1)中，所述发酵培养为摇瓶振荡培养；

优选地，步骤1)中，用于摇瓶振荡培养的转化培养基中，植物甾醇6g/l(折纯)；

更优选地，步骤1)中，所述摇瓶振荡培养为在28～32℃下，优选地在32℃下，以200～250转/分钟、优选220转/分钟摇瓶振荡培养5～13天。

根据本发明所述的方法，其中，所述步骤2)是通过包括以下步骤的方法实现的：

收获步骤1)中发酵培养得到的发酵液，离心，上清液过滤，滤液调ph值至2～3，加入0.2-0.6倍体积、优选0.4倍体积的二氯甲烷，混合，分层，收集有机相。

更优选地，所述方法还包括：

将收集的有机相过滤后，常压蒸馏浓缩至有机相原体积的1/10-1/6、优选1/8，加入0.2-0.6倍体积、优选0.4倍体积的正己烷，降温至12～14℃，养晶，过滤，洗涤和干燥，得到hil。

更优选地，所述过滤均使用5μm滤器进行。

根据本发明所述的方法，还包括检测步骤1)中发酵液中的产物积累的步骤，具体地包括以下：

取步骤1)中发酵培养的发酵液，经气相色谱分析，即得。

优选地，取200μl步骤1)中发酵液样品，使用hcl酸化至ph＝2后用4倍体积的乙酸乙酯萃取，涡旋震荡2min，12000rpm，离心10min，收集上清液，氮气吹干，将得到的产物用乙酸乙酯溶解，配制成1mg/ml的溶液，并通过0.22μl的有机膜过滤除杂，滤液送气相色谱检测。

所述气相色谱分析条件包括：

色谱柱为agilenthp-5；检测器为fid检测器；进样量1μl，进样口温度为240℃；检测器温度为280℃；

采用程序升温：初温180℃，7min，升温速率30℃·min^-1，升到240℃，6min。

根据本发明提供了一种新金分枝杆菌mnhil-4及其应用，该菌株的保藏编号为cgmccno.17948。该菌株以植物甾醇为底物，利用该突变株首次实现了hil的高效转化，摇瓶发酵液hil重量收率为53.83％(g/g％)植物甾醇(折纯)，比已有菌株(cn，103756940b，nk-xhx-103)hil重量收率提高了14.83-45.78％。发酵液产物中hil占全部产物比例达到99.29％，产物中无常见副产物hip和hk，副产物的产率大大低于已公开菌株。

本发明的有益效果包括：

1.本发明筛选获得可以植物甾醇为底物高产hil的新金分枝杆菌，利用该新金分枝杆菌首次实现了hil的高效转化，摇瓶发酵液hil重量收率为53.83％(g/g％)植物甾醇(折纯)，hil的产率是已公开菌株(nrrlb-8128)hil产率的7.88倍，发酵液产物中hil占全部产物比例达到99.29％；

2.本发明的方法为微生物转化法，反应条件温和，对环境没有污染；

3.本发明的新金分枝杆菌具有高产性状稳定的特点，该菌株经过6个月的传代，性能保持稳定；

4.本发明只需使用本发明的菌株进行转化，生产成本低，工艺简单，经济效益可观。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1a为使用对照菌株nrrlb-8128摇瓶发酵制备hil的发酵产物气相图谱；

图1b为使用本发明的新金分枝杆菌mnhil-4摇瓶发酵制备hil的产物气相图谱；

图2为hip、hil和hk标准品的气相图谱，其中图2a是标准品hip的检测结果，保留时间为5.205min；图2b是标准品hil的检测结果，保留时间为6.440min；图2c是标准品hk的检测结果，保留时间为3.321min。

图3显示了分枝杆菌内胆固醇的代谢途径。

生物材料的保藏

该新金分枝杆菌mnhil-4，分类命名为新金分枝杆菌(mycobacteriumneoaurum)已经于2019年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.17948。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的菌株、质粒、试剂盒等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

下述实施例中采用的新金分支杆菌mnhil-4，已于2019年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为新金分支杆菌(mycobacteriumneoaurum)mnhil-4，cgmccno.17948。

下述实施例中采用的新金分支杆菌nrrlb-8128得自美国农业研究菌种保藏中心(agriculturalresearchserviceculturecollection)。

下述实施例中，发酵液中的产物积累情况如下进行分析：

取200μl发酵液样品，hcl酸化至ph＝2后用4倍体积的乙酸乙酯萃取，涡旋震荡2min，12000rpm，离心10min，收集上清液，氮气吹干，将得到的产物用乙酸乙酯溶解，配制成1mg/ml的溶液，并通过0.22μl的有机膜过滤除杂，滤液利用气相色谱检测。

固体样品的制备方法：将得到的产物用乙酸乙酯溶解，配制1mg/ml的溶液，并通过0.22μm的有机膜过滤除杂，滤液利用气相色谱法分析产物的含量；

气相色谱测定法：

取样品1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图；另取hip、hil和hk样品25mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算出供试品中hip、hil和hk的浓度。

计算公式：

ax为供试品中hil峰面积

ar为对照品中hil峰面积

cr为对照品中hil的浓度(mg/ml)

hip、hk的计算方式同hil。

进样要求：含量测定的样品，单样双针，平行测定。

气相色谱测定条件：

色谱柱为agilenthp-5；

检测器为fid检测器；

进样量1μl，进样口温度为240℃；

检测器温度为280℃；

分流比：20:1；

载气：高纯n2，流速3.0ml/min；

采用程序升温：初温180℃，7min，升温速率30℃·min^-1，升到240℃，6min。

利用各物质的出峰时间不同，对比hip、hil及hk标准品来检测产物的生成，其中hil购买自保定九孚生物科技有限公司，hip和hk由实验室分离获得。各物质的出峰时间：hip保留时间t＝5.205min；hil保留时间t＝6.440min；hk保留时间t＝3.321min，如图2a、2b和2c所示。

下述实施例中采用植物甾醇含量为85％的植物甾醇提取物。

实施例1：制备本发明的菌株

以新金分枝杆菌mnpj-1(保藏号为cgmccno.14181，从保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心获得)作为出发菌株，采用以下方法制备得到本发明的新金分枝杆菌：

1)称取6mg亚硝基胍(简称ntg，购自sigma)于无菌离心管中，再加0.05ml丙酮助溶，加入0.2mm的ph6.0的磷酸缓冲液1ml使其完全溶解；

将新金分枝杆菌mnpj-1制成浓度在10^8-9个细胞/ml的菌悬液，将5ml菌悬液与上述亚硝基胍溶液混合；

2)将步骤1)得到的混合液立即置于30℃水浴振荡处理10min～1h；

3)通过离心收集菌体，然后使用5ml上述磷酸缓冲液洗涤菌体两次以终止ntg的诱变作用，最后向离心管中加5ml无菌生理盐水，摇匀；

4)将诱变处理的菌悬液进行10倍稀释后涂营养琼脂培养基平板，培养4-6天得单菌落；

5)挑取单菌落进行以植物甾醇为底物的转化试验，从中筛选得到本发明的突变菌株新金分枝杆菌mnhil-4。

实施例2：新金分枝杆菌mnhil-4的种子培养与传代

种子培养基配方为：牛肉膏0.3g/l，蛋白胨1.0g/l，酵母粉0.3g/l，甘油1.5g/l，吐温2.0g/l。各成分与水配制后，调节ph至7.2，高压蒸汽121℃灭菌30分钟，冷却后使用。

将新金分枝杆菌mnhil-4接种于上述种子培养基，在32℃下，以220转/分钟振荡培养48小时，收集发酵液，得到种子培养物。

菌株经过6个月的平板培养基传代，接种于营养肉汤固体培养基，32℃进行活化培养48h。传代后的菌株形态与母代菌株一致，具有下述性质：

1、菌落形态学特征：

将本发明的菌株于28℃下，在营养固体培养基上培养生长，3-5天后，得到直径约为3～10mm的金黄色菌落，菌落呈圆形，表面光滑。

2、菌株形态学特征：

本发明的菌株显微镜下呈现圆杆状，与分枝杆菌属镜下形态一致。

3、生理与生化特性：

本发明的菌株培养温度为28-32℃，最适生长温度为32℃，并且在ph为7.0-7.6的条件下生长较好。

实施例3：摇瓶振荡培养新金分枝杆菌mnhil-4制备hil

(一)种子培养：

按照实施例2所述进行，分别制备本发明新金分支杆菌mnhil-4和对照菌株nrrlb-8128的种子培养物。

(二)转化培养：

转化培养基配方为：大豆蛋白胨3g/l，酵母提取物1g/l，葡萄糖1.0g/l，柠檬酸0.2g/l，柠檬酸铁铵0.01g/l，k2hpo41.0g/l，mgso4·7h2o0.05g/l，nh4no30.3g/l，吐温802.0g/l，植物甾醇6.0g/l(外标含量85％折纯后)，ph7.2。配制时，用50℃的水先配制吐温80溶液，边搅拌边加入植物甾醇提取物，再加入上述成分并用水补足体积，调节ph7.2，分装摇瓶为100ml/500ml摇瓶，高压蒸汽121℃灭菌30min，冷却后使用。

将制备的种子培养物以5％的接种量接种于上述转化培养基中，在32℃下，220转/分钟摇瓶振荡培养13天。

此外，比较两株菌株的发酵液中产物积累情况，分析结果参见表1。

表1本发明菌株与对照菌株主要产物积累比较

注：1.产率为产物g/g植物甾醇(折纯)；数值经四舍五入。

2.本表仅计算了常见产物hil、hip、hk三者的产量比例。

结果发现，对照菌株nrrlb-8128发酵液可产生hil0.41g/l，除含有hil外，还积累大量的副产物hip和hk，产物中hil的比例只占18.64％。本发明的菌株新金分枝杆菌mnhil-4，发酵液中可产生hil3.23g/l，hil比例占产物的100％，产物中副产物比例远远低于原专利菌株。本发明的菌株新金分枝杆菌mnhil-4与原专利菌株nrrlb-8128相比，本发明菌株以植物甾醇为底物转化hil的重量收率为53.83％(g/g％)植物甾醇(折纯)，是对照菌株重量收率的7.88倍；hil的重量收率提高了47.00％，发酵液中hil比例提高81.36％。

以上结果证明，利用本发明的菌种新金分枝杆菌mnhil-4发酵生产hil比美国专利us4,062,729的方法具有明显优势。

nrrlb-8128摇瓶发酵气相色谱结果见图1a，mnhil-4摇瓶发酵结果见图1b。

实施例4：hil的提取

收获转化培养后的发酵液，8000rpm离心10min，分离得上清液。再使用5μm滤器过滤，滤液入提取罐。将滤液用硫酸调ph至2～3，加入0.4倍体积的二氯甲烷，充分混合，静止分层，收集下部有机相。有机相使用5μm滤器过滤后，常压蒸馏至有机相原体积的1/8，浓缩至料液粘稠，挂壁明显。

向浓缩料液中加入0.4倍体积的正己烷，逐渐降温至12-14℃，养晶1小时。晶体过滤，正己烷洗涤。晶体干燥，并送样检测，不合格产品重结晶。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。