一种基于适配体-G四链体纳米导线的检测多巴胺的方法与流程

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种基于适配体-g四链体纳米导线的检测多巴胺的方法。

背景技术：

多巴胺（da）作为一种儿茶酚胺类神经递质，在维持机体正常生理功能和在中枢神经、内分泌、肾脏和心血管等系统中都发挥着重要作用。人体多巴胺水平过高过低都会引发许多疾病。例如，帕金森氏病的主要神经化学紊乱与纹状体中多巴胺水平的显着降低有关。艾滋病患者的运动功能障碍等症状与纹状体中缺乏多巴胺有关。还有亨廷顿舞蹈症，注意力缺陷多动障碍，精神分裂症，神经节旁瘤和嗜铬细胞瘤与多巴胺水平异常有关。由于体液中多巴胺含量低且干扰物质多，因此迫切需要一种高选择性和高灵敏度的检测方法。因此，检测多巴胺等神经递质对于保障国民健康及疾病的治疗与预防都具有重要意义。但由于此物质在血液中含量较低，现有检测方法不易实现灵敏检测。另一方面体液中通常存在着多种物质，例如抗坏血酸、肾上腺素、五羟色胺等，这些物质都有可能会影响多巴胺的测定。因此，研究一种选择性好的识别探针很有必要。其次，采样问题也是一个亟待解决的方面。多巴胺的采集多通过取血，也有脑脊液取样。这些部位的取样存在着对机体创伤大，病人依从性差等特点。随着超微量检测、无创或微创检测在医疗领域中的发展，研究出一种高灵敏度、高选择性、微创地检测多巴胺新方法具有重要意义。

目前，测定多巴胺（da）的主要方法有分光光度法，化学发光法，荧光光度法，高效液相色谱法，毛细管电泳法以及电化学方法等。光学方法检测虽然方便、快捷，但检测的灵敏度较差。色谱法虽相对于光学方法灵敏度较高，但前处理繁琐，仪器昂贵、试剂消耗大，运行成本较高。电化学方法虽然设备简单，但是检测灵敏度不高，且电极的使用寿命较短，检测结果的重现性较差。尽管经过几十年的研究，但这些方法仍然存在一些缺点，例如前处理过程复杂，选择性差，灵敏度低，并且需要专门的仪器设备和训练有素专业的人才。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种基于适配体-g四链体纳米导线的检测多巴胺的方法，以解决现有检测方法灵敏度差，操作复杂，创伤大的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种基于适配体-g四链体纳米导线的检测多巴胺的方法，包括以下步骤：

（a）配制多巴胺适配体溶液，多巴胺适配体序列如序列表中的序列1所示；

（b）配制发夹dna溶液，所述发夹dna包含g-四链体形成序列，且发夹dna的5’端部分碱基与多巴胺适配体互补配对，发夹dna序列如序列表中的序列2所示；

（c）将多巴胺适配体溶液与发夹dna溶液等摩尔量混合，同时加入待测样品进行孵育；

（d）孵育完成后，加入核酸外切酶ⅲ进行酶切反应，之后加入含有mg²⁺和k⁺的缓冲溶液，混合完全后静置，使反应体系内形成g四链体纳米导线；

（e）反应完成后，用荧光分光光度计检测反应溶液的rrs信号，并根据预先制作的标准曲线得到待测样品中多巴胺的含量。

步骤（c）中，孵育条件为在4℃孵育2小时。

步骤（d）中，酶切反应条件为：加入60u核酸外切酶ⅲ，于4℃孵育1小时。

步骤（d）中，所述缓冲溶液为含150mmkcl、200mmmgcl2，且ph为7.4的tris–hcl缓冲溶液。

步骤（e）中，共振瑞利散射光谱的波长设置是同步扫描λex=λem，同步荧光波长扫描范围为220nm-650nm，激发和发射狭缝为10.0nm，温度为4℃。

本发明设计了多巴胺适配体与发夹dna适当的结合能力，使其在多巴胺存在时能够及时地从发夹dna脱离。同时设计能形成g-四链体的发夹dna序列，以实现在mg²⁺存在情况下形成g-导线纳米结构。其主要具有以下优势：

（1）利用核酸适配体识别多巴胺，构建了多巴胺的rrs检测平台；

（2）首次利用g-四链体纳米导线结构进行信号放大，建立了对多巴胺的超灵敏检测的新方法；

（3）利用g-导线纳米结构增强rrs信号，无需荧光标记进行检测，大大降低了成本，且具有出色的灵敏度；常规方法检测灵敏度多为几百至几千纳摩尔浓度，而采用本方法，灵敏度可达到0.01纳摩尔级别。灵敏度提高了数十万倍，方便了多巴胺含量很低的血液、尿液样品的测定。

（4）用样量少，用电化学、液相色谱等方法用样量多为几百微升至几毫升，取样量大，往往给病人造成沉重的负担。而采用此方法则需样量极少，仅需要几微升即可满足测定要求，不仅减轻了病人的负担，也为将来的家居服务创造了可能；

（5）取样简单，临床上为了获得较高的准确度，常使用含量较高的脑脊液作为检测样品。但脑脊液取样困难，病人受创伤大，且依从性差。采用本方法由于灵敏度超高，故可采用含量很低的血液和尿液样品，取样简单、方便。

附图说明

图1为本发明方法的示意图。图中，ab曲线是有目标物和无目标物存在时响应的结果对比图。

图2为本发明实施例1不同浓度多巴胺的共振瑞利光谱图。图中，(a)0.0nm，(b)0.05nm，(c)0.07nm，(d)0.09nm，(e)0.2nm，(f)0.4nm，(g)0.6nm，(h)0.6nm，(i)0.8nm，(j)1.0nm，(k)3.0nm，(l)5.0nm，(m)8.0nm，(n)10.0nm。

图3为本发明实施例1测定的标准曲线。

图4为g导线纳米结构的凝胶电泳图。图中，(a)适配体传感器的rrs谱图，其中(a)发夹dna+适配体+exoш+mg²⁺，(b)发夹dna+适配体+da+exoш+mg²⁺；（b）聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，其中，(1)dnamarker，(2)发夹dna(3.0μm)，(3)适配体(3.0μm)，(4)发夹dna(3.0μm)+适配体(3.0μm)+da(10.0nm)+exoш(6.0u/µl)+mg²⁺(200.0mm)。(da、发夹dna、适配体、exoш和mg²⁺的浓度分别是10.0nm、3.0μm、3.0μm、6.0u/µl、200.0mm)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。本发明中涉及的dna序列均采用常规的方法合成，本发明实施例中未提到的试验条件和操作均按本领域常规方法进行。

实施例1标准曲线的绘制

（a）配置浓度分别为0.0nm、0.05nm、0.07nm、0.09nm、0.2nm、0.4nm、0.6nm、0.6nm、0.8nm、1.0nm、3.0nm、5.0nm、8.0nm、10.0nm的多巴胺标准溶液。

（b）根据多巴胺溶液的浓度梯度，分组进行检测试验，每组试验操作相同，具体为：首先将制备好的发夹dna加热至95℃5分钟，然后缓慢冷却至室温后备用。混合杂交反应是多巴胺适配体（3μm，20μl），发夹dna（3μm，20μl），20μl不同浓度的多巴胺溶液在tris–hcla（20mmtris，ph7.4）缓冲溶液中进行，将混合溶液在4℃孵育2小时，发夹dna与适配体的互补碱基个数为3个。随后加入10μlexo-ⅲ(6u/μl)4℃孵育1小时。之后用tris–hclb缓冲溶液(150mmkcl，200mmmgcl2，ph7.4)混合至300μl，于4℃静置2小时促进g-纳米导线的形成。用荧光分光光度计检测溶液的rrs光谱强度，结果如图2所示。配备低温控制恒温槽，控制检测温度为4℃。共振瑞利散射光谱的波长设置是同步扫描λex=λem（δλ=0nm）。同步荧光波长扫描范围为220nm-650nm，狭缝(ex/em)10/10nm。实验中，光电倍增管的电压选择为400v。变化的rrs强度（δi）被定义为δi=i1-i0，i1和i0分别代表多巴胺存在和缺失时rrs强度。将每组测得的荧光信号变化量与对应的多巴胺浓度绘制标准曲线，如图3所示。

多巴胺适配体序列如序列表中的序列1所示，适配体是在体外通过指数富集配体的系统进化技术（selex），从寡核苷酸文库中筛选，在体外合成的片段，用于对目标物的特异性识别。发夹dna包含g-四链体形成序列，且发夹dna的5’端部分碱基与多巴胺适配体互补配对，发夹dna序列如序列表中的序列2所示。

本发明的方法如图1所示，使多巴胺适配体与等摩尔量的发夹dna通过碱基互补配对原则结合形成稳定的双链dna。在多巴胺存在的情况下，适配体与之结合，从而使适配体从发夹dna中释放出来，进而激活exoiii的消化，形成g-四链体结构，在mg²⁺和k⁺的诱导下形成长丝状的g-导线纳米结构。g-导线具有明显的rrs增强特性。多巴胺浓度越高，单位时间g-导线形成越多，rrs检测信号越强。用荧光分光光度计检测上述溶液的rrs信号。在此基础上，本发明考察了发夹dna与适配体反应时间，发夹dna与适配体互补配对碱基数，mg²⁺浓度，exo-ⅲ活性以及mg²⁺反应时间的影响对适配体传感器构建的影响，找到了rrs适配体传感器最佳的构建条件。并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法验证了g导线纳米结构的形成，聚丙烯酰胺凝胶电泳图如图3所示。

实施例2小鼠脑组织中多巴胺含量检测

本实施例将小鼠(25-28g)随机分为4组：高脂饲料全氟辛烷磺酸钾给药组，普通饲料全氟辛烷磺酸钾给药组，高脂饲料羧甲基纤维素钠对照组，普通饲料羧甲基纤维素钠对照组。连续灌胃8周，处死小鼠，取脑组织，加入7.5ml/g的组织裂解液，匀浆30s，然后14000r/min离心4℃15min，取上清，按照2∶1的比例加入高氯酸沉淀剂之后以14000r/min，4℃离心15min，取上清液进行rrs分析和elisa实验。检测结果如表1所示，两种方法具有较好的一致性。

表1：

将本发明检测方法与现有技术中其他方法的灵敏度进行比较，如表2所示。

表2：

由表2可以看出，本发明实现了超灵敏检测，相对于现有技术具有显著进步性。

序列表

<120>一种基于适配体-g四链体纳米导线的检测多巴胺的方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>58

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtctctgtgtgcgccagagaacactggggcagatatgggccagcacagaatgaggccc58

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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