莱克多巴胺半抗原和抗原的制备方法及其在量子点免疫荧光试剂盒中的应用

莱克多巴胺半抗原和抗原的制备方法及其在量子点免疫荧光试剂盒中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种半抗原、抗原及其制备方法和应用，具体涉及一种莱克多巴胺半 抗原和抗原的制备方法及其在量子点免疫荧光试剂盒中的应用，用于检测动物组织和尿液 中的莱克多巴胺残留量，属于免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002] 莱克多巴胺是一种医药原料，具有广泛的生理效应，可用于治疗充血性心力衰竭 症的强心药，且常用于支气管哮喘、支气管痉挛和产科疾病的治疗。当其用量增加到临床用 量的5-10倍时，可增加肌肉生长，减少脂肪蓄积，是良好的营养分配剂和生长促进剂。美国 FDA在2000年批准，可以用于动物营养重新配剂，广泛地用于畜牧业和养殖业。可以同时提 1?动物的日增重，提1?词料利用率，提1?动物的蛋白质含量。但是其在动物体内的残留一旦 经食物链进入人体，会对食用者产生巨大危害，特别对心脏病、糖尿病、高血压、甲亢、青光 目艮、前列腺肥大等病人危害更大，甚至死亡，如瘦肉精(莱克多巴胺是"瘦肉精药物"中的一 种）在上海曾经引发几百人的中毒事件；在台湾由于从美国进口的猪肉里含有瘦肉精，几乎 挑起一场政治争端。目前我国禁止将β-激动剂等药物作为动物促生长剂使用。但长期以 来，各种因非法使用β-激动剂而造成的中毒事件时有发生。为打击非法用药，保护消费者 的健康与安全，迫切需要健全相关的检测方法。
[0003] 目前，兽药残留检测常用的方法有气相色谱、高效液相色谱以及气质联用等理化 分析方法。虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是样品前处理操作步骤繁琐，成本较高，也 不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析鉴于在抗原抗体的定性定量方面独特的优 势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足，在 莱克多巴胺的残留检测中起着越来越重要的作用。
[0004] 影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于 免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分 子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种莱克多巴胺半抗原和抗原的制备方法及其在量子点免 疫荧光试剂盒中的应用。
[0006] 本发明提供的莱克多巴胺半抗原，为式（I)所示的化合物；
本发明还公开了式I所示化合物的制备方法，包括如下步骤： 1、取500mg莱克多巴胺，溶于45ml甲醇中，加入348. 8mg6-溴己酸和233mg氢氧化钾， 加热至80度回流反应40~72小时。点板确定原料大部分转化。
[0007] 2、减压浓缩。使用15ml复溶，使用制备薄层色谱板分离纯化，展开剂DCM:ME=4:1， 以莱克多巴胺标准定位，取比其极性大的点，使用甲醇提取，浓缩即得RAC-BBAR。
[0008] 本发明提供的莱克多巴胺抗原，是将式I所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联 物。
[0009] 常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（0VA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲状腺蛋白（TG)或血蓝蛋白（KLH)等。
[0010] 所述式I所示化合物与BSA偶联得到的莱克多巴胺抗原的结构见式II:
本发明还公开了所述莱克多巴胺抗原的制备方法，包括如下步骤： 1、取RAC-BHAR半抗原160mg溶于10. 7mlDMF中，搅拌使之充分溶解。加入EDC221.75mg和NHS191.4mg，室温反应 3h。
[0011] 2、称取144.lmgBSA溶于15ml0· 1M碳酸缓冲溶液（ρΗ=9· 6)中，搅拌lOmin，充 分溶解。
[0012] 3、将步骤1的活化液3. 6ml，在冰水浴环境下逐滴加入到蛋白溶液中，边加边搅 拌，室温磁力搅拌（400rpm)反应24h。
[0013] 4、将反应产物装入一个蒸馏水冲洗干净的透析袋（15cm)，1LPB(IX，pH7. 2)室温 搅拌（lOOrpm)透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物4500rpm 离心6min，0. 5ml/管分装，将抗原编号，-20°C保存备用。
[0014] OVA代替BSA，同法制备可得包被原。
[0015] 所述莱克多巴胺抗原可以作为免疫原制备莱克多巴胺特异性抗体，也可以作为包 被原制备微孔板。
[0016] 应用莱克多巴胺抗原制备得到的特异性抗体具体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
[0017] 所述莱克多巴胺抗原、所述特异性抗体均可应用于检测莱克多巴胺。
[0018] 本发明还保护一种用于检测莱克多巴胺的量子点免疫荧光试剂盒，包括量子点标 记的所述抗体。
[0019] "量子点标记的所述抗体"的制备方法具体如下： ① 取2. 5mg量子点，用pH4. 7、0. 1M的MES缓冲液洗涤，然后用lmlpH4. 7、0. 1M的MES 缓冲液重悬，加入〇· 96mgEDC和1. 15mgNHS，37°C反应30分钟，20000rpm离心5min，收集 沉淀，即为活化后的量子点； ② 取步骤①得到的活化后的量子点，用pH8. 5、50mM的硼砂缓冲液洗涤，然后将2. 5mg 活化后量子点、所述抗体(蛋白质含量为〇. 15mg)和pH8. 5、50mM的硼砂缓冲液混匀（总体积 为0· 8ml)，25°C反应3. 5小时； ③ 取完成步骤②的液相，加入BSA并使其质量百分含量为5%，37 °C反应30分钟， 20000rpm离心5min，收集沉淀，用pH7. 4、0. 02M的PBS缓冲液洗涤，用lmlpH7. 4、0. 02M的 PBS缓冲液重悬； ④取步骤③得到的液相，用pH7. 4、0. 02M的PBS缓冲液稀释至150000倍体积。
[0020] 所述量子点荧光免疫试剂盒，包括：包被有莱克多巴胺抗原的微孔板、抗体工作 液、莱克多巴胺标准溶液、稀释液、浓缩洗涤液等。
[0021] 本发明还保护以上所述试剂盒在检测待测样本中是否含有莱克多巴胺中的应用。
[0022] 本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目 标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物 的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样品中微量小分子目标分 析物。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明克服了现有检测技术 中对莱克多巴胺样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中要用 到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本发明的莱克多巴胺抗原，通过免疫动 物可产生了针对莱克多巴胺的特异性抗体，用于快速检测食品中的莱克多巴胺残留，具有 操作简单、快速，处理样品量大，灵敏度高，特异性强等诸多优点。
【附图说明】
[0023] 图1为量子点的扫描图。
[0024] 图2为莱克多巴胺量子点免疫荧光试剂盒标准曲线图。
【具体实施方式】
[0025] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值。实施例1中的搅拌都是采用磁力搅拌器进行的，所用的试验材料，如无特殊说 明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0026] 莱克多巴胺的结构式如下：
头施例1、免疫原和包被原的制备 一、半抗原的制备 1、取500mg莱克多巴胺，溶于45ml甲醇中，加入348. 8mg6-溴己酸和233mg氢氧化钾， 加热至80度回流反应40~72小时。点板确定原料大部分转化。
[0027] 2、减压浓缩。使用15ml复溶，使用制备薄层色谱板分离纯化，展开剂DCM:ME=4:1， 以莱克多巴胺标准定位，取比其极性大的点，使用甲醇提取，浓缩即得RAC-BBAR，得到的干 物质即为半抗原。
[0028] 半抗原的结构式见式（I)。
[0029]
[0030] 二、免疫原的制备 1、取RAC-BHAR半抗原160mg溶于10. 7mlDMF中，搅拌使之充分溶解。加入EDC221.75mg和NHS191.4mg，室温反应 3h。
[0031] 2、称取144.lmgBSA溶于15ml0· 1M碳酸缓冲溶液（ρΗ=9· 6)中，搅拌lOmin，充 分溶解。
[0032] 3、将步骤1的活化液3. 6ml，在冰水浴环境下逐滴加入到蛋白溶液中，边加边搅 拌，室温磁力搅拌（400rpm)反应24h。
[0033] 4、将反应产物装入一个蒸馏水冲洗干净的透析袋（15cm)，1LPB(IX，pH7. 2)室温 搅拌（lOOrpm)透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物4500rpm 离心6min，0. 5ml/管分装，将抗原编号，-20°C保存备用。
[0034] 免疫原的结构式见式（II)
[0035] 三、包被原的制备 用0VA代替BSA，其它同步骤二，得到包被原溶液。
[0036] 实施例2、多克隆抗体的制备 取实施例1制备的免疫原溶液，采用pH7. 4、0. 01M的PBS缓冲液稀释，得到免疫原稀释 液，用于多克隆抗体的制备。采用新西兰大白兔作为免疫动物。
[0037] 免疫过程如下(免疫剂量以蛋白量计）： 首次免疫：将免疫原稀释液与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多 点注射，免疫剂量为lmg/kg·b.w.; 加强免疫：首次免疫4周后、8周后和12周后，各进彳丁一次加强免疫，将免疫原f布释液 与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，单次免疫剂量为lmg/kg·b. w.; 末次免疫：首次免疫16周后进行末次免疫，直接颈背部皮下多点注射免疫原稀释液， 免疫剂量为lmg/kg·b.w.。
[0038] 末次免疫1周后，采血并分离血清，即为免疫原对应的多克隆抗体(简称多克隆抗 体甲）。
[0039] 实施例3、量子点免疫荧光检测试剂盒的组装 量子点购自深圳市泰勒、斯科技有限公司，产品目录号为TLS\umiQD?20。该量子点的 表征如下：粒径为20nm、粒径的CV为15%，量子产率为60%，表面羧基含量为5X10 3mmol/ mg，水溶性，CdSe/ZnS核壳结构，激发光波长为345nm，发射波长是620nm;红色荧光量子点。 量子点的扫描图如图1所示。量子点上的羧基与蛋白质上的氨基形成肽键并连接起来。
[0040] 量子点免疫突光检测试剂盒包括如下组件： 1、包被了包被原的微孔板 取实施例1制备的包被原溶液，