本发明涉及微生物发酵技术领域，更具体的说是涉及一种用于发酵生产头孢菌素c的方法。
背景技术：
头孢菌素c(英文全称为cephalosporinc，缩写为cpc)，是由顶头孢霉菌(cephalosporiumacremonium)产生的一类β～内酰胺抗生素，分子式为c16h21n3o8s，分子量为415.4，结构式为：
头孢菌素c的结构与青霉素的结构相似，不同的是头孢菌素c的母核是7～氨基头孢烷酸(7～aca)，而青霉素的母核则是6～氨基青霉烷酸，正是由于这种结构上的差异，使得头孢菌素c有着更强的稳定性。头孢菌素类c因其抗菌谱广和不良反应发生率低的特点，是临床上广泛使用的消炎、抗菌药物，也是生产各种注射用半合成头孢菌素的基本原料。
目前国内头孢菌素c的发酵生产行业竞争激烈，如何提高头孢菌素c发酵产量,降低发酵成本，对提高企业效益、增强企业竞争力至关重要。但是，头孢菌素c发酵生产原辅料成本占比较高，其中尤其以大豆油成本最高，大豆油所占原辅料总成本50％以上。
新疆产大量优质玉米，玉米油经制糖后，用于头孢菌素c发酵生产，可以有效解决当地玉米的销路问题，同时大幅度降低企业成本，具有良好的经济和社会效益。
因此，如何采用质优价廉的液糖替代成本高昂的大豆油发酵生产头孢菌素c成为目前企业迫切需要解决的课题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种用于发酵生产头孢菌素c的方法，在发酵过程中进行补料，加快了菌体的代谢，提高了头孢菌素c的发酵效价。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于发酵生产头孢菌素c的方法，具体包括以下步骤：
(1)制备一级种子
取顶头孢霉菌置于茄子瓶斜面，制备质量体积比为20～25％的菌悬液，按照1％～2％的接种量接种至一级种子培养基中，在ph为6.5～7.4、温度为27～29℃的条件下培养45～50h，得到一级种子；
(2)制备二级种子
取步骤(1)所得一级种子，按照8％～10％的接种量接种于二级种子培养基中，在ph为6.5～7.4、温度为27～29℃的条件下培养45～50h，得到二级种子；
(3)制备三级种子
取步骤(2)所得二级种子，按照8％～10％的接种量接种于三级种子培养基中，在ph为6.5～7.4、温度为27～29℃的条件下培养45～50h，得到三级种子；
(4)发酵
取步骤(3)所得三级种子，按照25～33％的接种量接种至发酵培养基中发酵培养120～140h，在发酵过程中分别补入豆油、液糖和硫酸铵，发酵培养，得到发酵液；
(5)过滤
取步骤(4)所得发酵液，依次经过陶瓷膜过滤、纳滤浓缩、树脂吸附和解析分离纯化，即得头孢菌素c。
进一步，上述步骤(1)中，顶头孢霉菌的保藏编号为atcc36225。
进一步，上述步骤(1)中，一级种子培养基的组成为：葡萄糖浆18～32g/l、大豆油8～15g/l、玉米浆50～100g/l、糊精7.5～15g/l、白砂糖18～36g/l、黄豆饼粉20～40g/l、花生饼粉20～40g/l、轻质碳酸钙3.6～7.2g/l。
进一步，上述步骤(2)中，二级种子培养基的组成为：黄豆饼粉22～32g/l、白砂糖22～32g/l、糊精8～12g/l、花生饼粉22～32g/l、轻质碳酸钙4～6g/l、玉米浆50～100g/l、葡萄糖浆18～32g/l、大豆油8～15g/l。
进一步，上述步骤(3)中，三级种子培养基的组成为：硫酸铵9～13g/l、无水硫酸钙4～6g/l、谷朊粉9～13g/l、dl～蛋氨酸2～4g/l、玉米粉8～12g/l、糊精12～18g/l、花生饼粉12～16g/l、轻质碳酸钙4～7g/l、玉米浆50～100g/l、葡萄糖浆14～18g/l、大豆油20～30g/l。
进一步，上述步骤(4)中，发酵培养基的组成为：硫酸铵10～26g/l、无水硫酸钙10～13g/l、谷朊粉20～26g/l、dl～蛋氨酸5～6g/l、玉米粉15～20g/l、糊精17～22g/l、花生饼粉16～20g/l、轻质碳酸钙5～8g/l、玉米浆50～100g/l、大豆油10～60g/l、棉籽油10～60g/l。
进一步，上述步骤(4)中，补入豆油、液糖和硫酸铵的具体步骤为：
补豆油：50～80h，0.1～1.0l/m3·h；80～110h，0.2～1.5l/m3·h；110～140h，0.2～1.5l/m3·h；
补液糖：20～80h，0.8～2.2l/m3·h；80～110h，2.0～6.1l/m3·h；110～140h，1.5～6.1l/m3·h，液糖的浓度为58～64g/l；
补硫酸铵：10～20h，0.1～1.0l/m3·h；20～70h，1.0～2.0l/m3·h；硫酸铵的浓度为10～20g/l。
优选地，上述步骤(4)中，补入豆油、液糖和硫酸铵的具体步骤为：
补豆油：50～80h，0.2～0.9l/m3·h；80～110h，0.3～1.4l/m3·h；110～140h，0.3～1.4l/m3·h；
补液糖：20～80h，0.9～2.1l/m3·h；80～110h，2.1～6.0l/m3·h；110～140h，1.4～6.0g/m3·h；液糖的浓度为60～64g/l；
补硫酸铵：10～20h，0.2～0.9l/m3·h；20～70h，0.19～0.9l/m3·h，硫酸铵的浓度为11～19g/l。
更优选地，上述步骤(4)中，补入豆油、液糖和硫酸铵的具体步骤为：
补豆油：50～80h，0.3l/m3·h；80～110h，0.7l/m3·h；110～140h，0.6l/m3·h；
补液糖：20～80h，1.4l/m3·h；80～110h，2.5l/m3·h；110～140h，3l/m3·h，液糖的浓度为62g/l；
补硫酸铵：10～20h，0.3l/m3·h；20～70h，0.8l/m3·h；硫酸铵的浓度为18g/l。
进一步，上述步骤(4)中，发酵培养的条件为：发酵时间为130h；0～40h的温度为28℃，40～130h的温度为24℃。
进一步，上述步骤(4)中，发酵培养的ph为5.6。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
用于发酵生产头孢菌素c的方法，具体包括以下步骤：
(1)制备一级种子
取保藏编号为atcc36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液为25％(mg/ml)，按照1％的接种量接种至一级种子培养基中，在ph为7.0、温度为27℃的条件下培养50h；
一级种子培养基：葡萄糖浆22g/l、大豆油9g/l、玉米浆60g/l、糊精8g/l、白砂糖25g/l、黄豆饼粉25g/l、花生饼粉25g/l、轻质碳酸钙5g/l。
(2)制备二级种子
取一级种子，按照8％的接种量接种于二级种子培养基中，在ph为6.5、温度为27℃的条件下培养50h，得到二级种子；
二级种子培养基：黄豆饼粉25g/l、白砂糖26g/l、糊精10g/l、花生饼粉25g/l、轻质碳酸钙5g/l、玉米浆60g/l、葡萄糖浆20g/l、大豆油9g/l。
(3)制备三级种子
取二级种子按照8％的接种量接种于三级种子培养基中，在ph为6.5、温度为27℃的条件下培养50h；
三级种子培养基：硫酸铵10g/l、无水硫酸钙5g/l、谷朊粉11g/l、dl～蛋氨酸2g/l、玉米粉10g/l、糊精16g/l、花生饼粉12g/l、轻质碳酸钙6g/l、玉米浆70g/l、葡萄糖浆16g/l、大豆油25g/l。
(4)发酵
取三级种子按照25％的接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h为28℃，40～130h为24℃，ph为5.6，得到发酵液；
发酵培养基：硫酸铵15g/l、无水硫酸钙12g/l、谷朊粉24g/l、dl～蛋氨酸5g/l、玉米粉16g/l、糊精19g/l、花生饼粉17g/l、轻质碳酸钙7g/l、玉米浆60g/l、大豆油30g/l、棉籽油30g/l。
补入豆油、液糖和硫酸铵的具体步骤为：
补豆油：50～80h，0.2l/m3·h；80～110h，0.4l/m3·h；110～140h，1.0l/m3·h；
补液糖：20～80h，0.8l/m3·h；80～110h，2.01l/m3·h；110～140h，4.0l/m3·h；其中液糖的浓度为58g/l；
补硫酸铵：10～20h，0.5l/m3·h；20～70h，1.1l/m3·h；其中硫酸铵的浓度为10g/l。
(5)过滤
取发酵液依次经过陶瓷膜过滤、纳滤浓缩、树脂吸附和解析分离纯化，即得头孢菌素c。
实施例2
用于发酵生产头孢菌素c的方法，步骤(1)～(5)的操作均同实施例1。补入豆油、液糖和硫酸铵的具体步骤为：
补豆油：50～80h，0.3l/m3·h；80～110h，0.5l/m3·h；110～140h，1.5l/m3·h；
补液糖：20～80h，0.9l/m3·h；80～110h，2.11l/m3·h；110～140h，4.2l/m3·h，其中液糖的浓度为64g/l；
补硫酸铵：10～20h，0.6l/m3·h；20～70h，1.2l/m3·h；其中硫酸铵的浓度为20g/l。
实施例3
用于发酵生产头孢菌素c的方法，步骤(1)～(5)的操作均同实施例1。补入豆油、液糖和硫酸铵的具体步骤为：
补豆油：50～80h，0.4l/m3·h；80～110h，0.7l/m3·h；110～140h，1.3l/m3·h；
补液糖：20～80h，0.9l/m3·h；80～110h，2.01l/m3·h；110～140h，4.5l/m3·h；其中液糖浓度为60g/l；
补硫酸铵：10～20h，0.5l/m3·h；20～70h，1.4l/m3·h；其中硫酸铵浓度为15g/l。
实施例4
用于发酵生产头孢菌素c的方法，步骤(1)～(5)的操作均同实施例1。补入豆油、液糖和硫酸铵的具体步骤为：
补豆油：50～80h，0.8l/m3·h；80～110h，0.5l/m3·h；110～140h，0.7l/m3·h；
补液糖：20～80h，2.0l/m3·h；80～110h，2.51l/m3·h；110～140h，1.5l/m3·h；其中液糖浓度为60g/l；
补硫酸铵：10～20h，1.0l/m3·h；20～70h，1.5l/m3·h；其中硫酸铵浓度为15g/l。
实施例5
用于发酵生产头孢菌素c的方法，步骤(1)～(5)的操作均同实施例1。补入豆油、液糖和硫酸铵的具体步骤为：
补豆油：50～80h，0.6l/m3·h；80～110h，1.2l/m3·h；110～140h，0.8l/m3·h；
补液糖：20～80h，1.0l/m3·h；80～110h，2.5l/m3·h；110～140h，2.5l/m3·h；其中液糖浓度为60g/l；
补硫酸铵：10～20h，0.4l/m3·h；20～70h，1.3l/m3·h；其中硫酸铵浓度为15g/l。
实施例6
用于发酵生产头孢菌素c的方法，步骤(1)～(5)的操作均同实施例1。补入豆油、液糖和硫酸铵的具体步骤为：
补豆油：50～80h，0.3l/m3·h；80～110h，0.7l/m3·h；110～140h，0.6l/m3·h；
补液糖：20～80h，1.4l/m3·h；80～110h，2.5l/m3·h；110～140h，3l/m3·h；其中液糖浓度为62g/l；
补硫酸铵：10～20h，0.3l/m3·h；20～70h，0.8l/m3·h；其中硫酸铵浓度为18g/l。
性能测试
效价检测:
各取1g实施例1～6生产的头孢菌素c发酵液于50ml的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素c混合液，分别检测其效价(μg/ml)、菌浓(％)、放罐透光率(％)、杂质docpc和dcpc含量(％)以及头孢菌素c(cpc)含量(％)。
色谱条件如下：
色谱柱：hypersilods5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1体积份/min，进样量：20ul。
试验结果如表1所示。
表1实施例1～6生产的头孢菌素c性能检测结果
由表1可以看出：
本发明通过头孢菌素c培养基补料工艺的优化，对比现有技术中发酵生产水平26000μg/ml提高6.3％，最佳条件实施6放罐效价可达到28645μg/ml，较正常生产工艺大幅度提高；放罐菌浓在52～56％之间，放罐透光率在40～44％之间，杂质含量docpc及dcpc基本相差不大，主要成分cpc均在80％以上。
因此，综合考虑生产成本及发酵收益，本发明实施例的各项工艺参数取值更适合于工业化生产，可以显著降低生产成本，增加产量，具有非常良好的工业应用前景。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。