一种调控棉花纤维呈色的融合基因及其表达载体和应用的制作方法

本发明属于植物转基因育种技术领域，具体涉及一种调控棉花纤维呈色的融合基因及其表达载体和应用。

背景技术：

天然彩色棉是一种能在纤维发育过程中合成和积累天然色素，从而使成熟纤维具有天然色彩的棉花材料。与常规白色棉和化学纤维相比，彩色棉由于具有天然色彩，在纺织加工过程中不需要漂白和印染处理，避免了染料、有机溶剂、重金属等有毒有害残留物对纺织品的污染和人体的危害，能显著提高纺织品的绿色生产水平。目前应用于纺织的彩色棉材料只有绿色和棕色两种，还不能满足消费者和纺织业对色彩多样性的需求。因此拓展成熟纤维的色彩范围，是彩色棉产业进一步发展的必要条件。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于一种调控棉花纤维呈色的融合基因及其表达载体和应用，显著提高棉纤维花色素含量，从而获取天然紫红色棉纤维。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种调控棉花纤维呈色的融合基因，所述融合基因的结构包括5’-玉米叶片颜色基因lc-肽段2a的核苷酸序列-棉花花色素合成调控基因ghpap1d-3’；

所述玉米叶片颜色基因lc的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述肽段2a的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述棉花花色素合成调控基因ghpap1d的核苷酸序列如seqidno.3所示。

优选的，所述玉米叶片颜色基因lc的编码氨基酸序列如seqidno.4所示；所述肽段2a的氨基酸序列如seqidno.5所示；所述棉花花色素合成调控基因ghpap1d的编码氨基酸序列如seqidno.6所示。

优选的，扩增所述玉米叶片颜色基因lc的引物包括lc-2a-u和lc-2a-d；所述lc-2a-u的核苷酸序列如seqidno.7所示，所述lc-2a-d的核苷酸序列如seqidno.8所示。

优选的，扩增所述棉花花色素合成调控基因ghpap1d的引物包括ghpap1d-u和ghpap1d-d；所述ghpap1d-u的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述ghpap1d-d的核苷酸序列如seqidno.10所示。

本发明的另一个目的是提供一种包含上述融合基因的表达载体，所述表达载体的t-dna区的基因结构，包括：t-dna的右边界-重组酶识别位点loxpfrt-串联两个增强子的花椰菜花叶病毒35s启动子-报告基因gus和标记基因nptii的融合基因表达盒-农杆菌冠瘿碱合成酶基因终止子nos-重组酶识别位点loxpfrt-棉花纤维次生壁合成时期特异启动子pfbl2a-融合基因-农杆菌冠瘿碱合成酶基因终止子nos-t-dna左边界；

所述棉花纤维次生壁合成时期特异启动子pfbl2a的核苷酸序列如seqidno.11所示。

优选的，所述表达载体的基础载体包括植物表达载体plgn。

优选的，扩增所述棉花纤维次生壁合成时期特异启动子pfbl2a的引物包括pfbl2a-f和pfbl2a-r；所述pfbl2a-f的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述pfbl2a-r的核苷酸序列如seqidno.13所示。

本发明的另一个目的在于提供一种上述融合基因或上述表达载体在构建转基因棉花中的应用，所述转基因棉花的成熟纤维呈现紫红色。

本发明的另一个目的在于提供一种构建成熟纤维呈现紫红色的转基因棉花的方法，包括以下步骤：在转基因棉花的棉纤维中超表达上述融合基因。

优选的，所述超表达的方法，包括将上述表达载体转化入农杆菌lba4404中，通过根癌农杆菌介导的方法进行棉花的遗传转化。

本发明提供了一种控棉花纤维呈色的融合基因，利用一种可以自裂解为小片段肽的2a肽，将lc和ghpap1d基因组合成融合基因，采用纤维次生壁特异启动子pfbl2a启动所述融合基因在棉纤维中超量表达，使转基因棉花产生紫红色纤维。在本发明实施例中，对转基因棉花进行花青素含量测定，结果表明，转基因纤维中花青素的相对含量较白色棉增长了4093倍。

附图说明

图1为plgn-pfbla2-lc-2a-ghpap1d的表达载体t-dna区的基因结构图；

图2为纤维特异性表达载体plgn-pfbl2a-lc-2a-ghpap1d的构建流程；

图3为棉花开花后25天和50天的纤维色泽比较图，其中wf为白色纤维，rf为转基因红色纤维，dpa为开花后天数。

具体实施方式

本发明提供了一种调控棉花纤维呈色的融合基因，所述融合基因的结构包括5’-玉米叶片颜色基因lc-肽段2a的核苷酸序列-棉花花色素合成调控基因ghpap1d-3’；

所述玉米叶片颜色基因lc的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述肽段2a的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述棉花花色素合成调控基因ghpap1d的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明所述玉米叶片颜色基因lc的编码氨基酸序列如seqidno.4所示：malsasrvqqaeellqrpaerqlmrsqlaaaarsinwsyalfwsisdtqpgvltwtdgfyngevktrkisnsveltsdqlvmqrsdqlrelyeallsgegdrraaparpagslspedlgdtewyyvvsmtyafrpgqglpgrsfasdehvwlcnahlagskafprallaksasiqsilcipvmggvlelgttdtvpeapdlvsrataafwepqcpssspsgranetgeaaaddgtfafeeldhnngmddieamtaagghgqeeelrlreaealsddaslehitkeieefyslcdemdlqalplpledgwtvdasnfevpcsspqpapppvdratanvaadasrapvygsratsfmawtrssqqsscsddaapaavvpaieepqrllkkvvagggawescggatgaaqemsgtgtknhvmserkrreklnemflvlksllpsihrvnkasilaetiaylkelqrrvqelessrepasrpsetttrlitrpsrgnnesvrkevcagskrkspelgrddverppvltmdagtsnvtvtvsdkdvllevqcrweellmtrvfdaikslhldvlsvqasapdgfmglkiraqfagsgavvpwmisealrkaigkr。本发明所述肽段2a的氨基酸序列如seqidno.5所示：qllnfdllklagdvesnpgp，所述肽段2a可以自裂解为小片段。本发明所述小片段肽2a肽的基因和叶片颜色基因lc优选由华大优化融合合成，并基于合成的片段设计引物lc-2a-u和lc-2a-d，且lc-2a-u的核苷酸序列优选如seqidno.7所示：ggatccatggctctttctgcttct，lc-2a-d的核苷酸序列优选如seqidno.8所示：gagccttccataggaccagggttagattca。本发明对利用上述扩增得到的lc-2a片段的5’端优选加上bamhⅰ酶切位点，3’端加上2a肽的同源臂。本发明所述扩增的体系优选为10μl体系，包括：2×primestarmaxpremix5μl，引物(5μmol/l)各1μl，模板dna约60ng，加入ddh2o至10μl。本发明所述扩增的程序优选为：98℃预变性5min；然后98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明所述融合基因中棉花花色素合成调控基因ghpap1d的编码氨基酸序列如seqidno.6所示：megsslrvrkgawteeedlllkkciekygegkwhqvparaglnrcrkscrlrwlnylkpnikrgyfaadevdliirlhnllgnrwsliagrlpgrtandvknywnthllkknidtsgknskpksyqpnpntkiikprphilskhsflisldeynnnnnnnhaeasnnvalandgnndygycfpndhdemmwwenmminekevdgyqlqcsandfdqsmldqpmneenygstidevfldeelwnvfnp。本发明优选利用扩增的方法，以棉花红色株系t586叶片cdna为模板，扩增获得目标片段，扩增引物包括ghpap1d-u和ghpap1d-d；所述ghpap1d-u的核苷酸序列如seqidno.9所示：ccctggtcctatggaaggctcatctttaag，所述ghpap1d-d的核苷酸序列如seqidno.10所示：cgggccctatgggttgaacacat。本发明对利用上述扩增得到的ghpap1d片段的5’端优选加上2a肽的同源臂，3’端加上apaⅰ酶切位点。本发明所述扩增的体系优选为10μl体系，包括：2×primestarmaxpremix5μl，引物(5μmol/l)各1μl，模板dna约60ng，加入ddh2o至10μl。本发明所述扩增的程序优选为98℃预变性3min；然后98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；最后72℃延伸10min。。

本发明将上述两个基因融合的方法优选包括lc-2a、ghpap1d两个片段进行重叠pcr，扩增的体系优选为10μl体系，包括：2×primestarmaxpremix5μl，引物lc-2a-u和ghpap1d-d(5μmol/l)各1μl，模板dna约60ng，加入ddh2o至10μl。扩增程序为：98℃预变性5min；然后98℃变性15s，52℃退火30s，72℃延伸90s，10个循环；最后72℃延伸10min，取出扩增产物，加入引物lc-2a-u和ghpap1d-d(5μmol/l)各1μl，再次扩增，扩增程序为：98℃预变性5min；然后98℃变性15s，68℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物取出后加入2×taqmix10μl，72℃延伸10min，在片段两端加上a尾。最后将扩增产物电泳后胶回收。回收后连接到pgem-t-easy载体上，送至华大基因公司测序。测序正确后用hindⅲ和apaⅰ酶切，酶切后胶回收。得到lc-2a-pap1d融合dna片段。

本发明提供一种包含上述融合基因的表达载体，所述表达载体的t-dna区的基因结构，包括：t-dna的右边界-重组酶识别位点loxpfrt-串联两个增强子的花椰菜花叶病毒35s启动子-报告基因gus和标记基因nptii的融合基因表达盒-农杆菌冠瘿碱合成酶基因终止子nos-重组酶识别位点loxpfrt-棉花纤维次生壁合成时期特异启动子pfbl2a-融合基因-农杆菌冠瘿碱合成酶基因终止子nos-t-dna左边界；所述棉花纤维次生壁合成时期特异启动子pfbl2a的核苷酸序列如seqidno.11所示。

本发明所述表达载体的t-dna区的基因结构优选如图1所示，所述表达载体的基础载体优选包括植物表达载体plgn。本发明所述plgn优选由传统的植物表达载体pbi121改造而来的一个双元植物表达载体，其t-dna区段(rb和lb之间区域，图2)替换为了组成型的2×35s启动子(2×35s-p)控制的报告基因gus和标记基因nptii的融合基因表达盒。

本发明所述棉花纤维次生壁合成时期特异启动子pfbl2a优选通过扩增的方式获得，从棉花株系冀棉14号的基因组中扩增克隆所述启动子pfbl2a，且扩增的引物优选包括pfbl2a-f和pfbl2a-r；所述pfbl2a-f的核苷酸序列优选如seqidno.12所示：aagcttgatatcgaattcctgcag，所述pfbl2a-r的核苷酸序列优选如seqidno.13所示：ggatcctgtaattgtaaatagtaattgtaa，为方便后续连接载体，在所述启动子的5’端加上hindⅲ酶切位点，启动子的3端加上’bamhⅰ酶切位点。本发明所述扩增的体系优选为10μl体系，包括：2×primestarmaxpremix5μl，引物(5μmol/l)各1μl，模板dna约60ng，加入ddh2o至10μl。本发明所述扩增的程序优选为：98℃预变性5min；然后98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物取出后加2×taqmix10μl，72℃延伸10min，在片段两端加上a尾。最后将扩增产物电泳后胶回收。回收后连接到pgem-t-easy载体上，送至华大基因公司测序。测序正确后用hindⅲ和bamhⅰ酶切，酶切后胶回收，得到启动子pfbl2a的dna片段。

本发明还提供了上述融合基因或上述表达载体在构建转基因棉花中的应用，所述转基因棉花的成熟纤维呈现紫红色。本发明所述转基因棉花的纤维中超表达所述融合基因，转基因棉花纤维种花色素含量可达白色棉的4093倍。

本发明还提供了构建成熟纤维呈现紫红色的转基因棉花的方法，包括以下步骤：在转基因棉花的棉纤维中超表达上述融合基因。本发明所述超表达的方法，优选包括将上述表达载体转化入农杆菌lba4404中，通过根癌农杆菌介导的方法进行棉花的遗传转化。本发明对所述遗传转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规遗传转化方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的调控棉花纤维呈色的融合基因和表达载体及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

玉米叶片颜色基因lc基因、小片段肽2a肽基因、棉花花色素色素合成调控基因ghpap1d的获得

小片段肽2a肽基因和lc基因由华大优化融合合成，以合成片段为模板，设计引物(表1，lc-2a-u和lc-2a-d)，引物lc-2a-u的5’端加上bamhⅰ酶切位点，lc-2a-d的5’端加上ghpap1d基因10bp同源臂。扩增的体系优选为10μl体系，包括：2×primestarmaxpremix5μl，引物lc-2a-u和lc-2a-d(5μmol/l)各1μl，模板dna约60ng，加入ddh2o至10μl。扩增程序为：98℃预变性5min；然后98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸10min。

以gohir.d7g082100的cds序列为参考设计引物(表1，ghpap1d-u和ghpap1d-d)，引物ghpap1d-u的5’端加上2a肽基因10bp同源臂，引物ghpap1d-d的5’端加上apaⅰ酶切位点。以棉花红色株系t586(李鑫.棉花ghpap1的转基因功能研究.西南大学硕士学位论文.2014中已经公开)叶片cdna为模板。扩增的体系优选为10μl体系，包括：2×primestarmaxpremix5μl，引物ghpap1d-u和ghpap1d-d(5μmol/l)各1μl，模板dna约60ng，加入ddh2o至10μl。本发明所述扩增的程序优选为：98℃预变性3min；然后98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；最后72℃延伸10min。。

lc-2a、ghpap1d两个片段进行重叠pcr，扩增的体系：2×primestarmaxpremix5μl，引物lc-2a-u和ghpap1d-d(5μmol/l)各1μl，模板dna约60ng，加入ddh2o至10μl。扩增程序为：98℃预变性5min；然后98℃变性15s，52℃退火30s，72℃延伸90s，10个循环；最后72℃延伸10min，取出扩增产物，加入引物lc-2a-u和ghpap1d-d(5μmol/l)各1μl，再次扩增，扩增程序为：98℃预变性5min；然后98℃变性15s，68℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物取出后加入2×taqmix10μl，72℃延伸10min，在片段两端加上a尾。最后将扩增产物电泳后胶回收。回收后连接到pgem-t-easy载体上，送至华大基因公司测序。

表1实施例中所用的引物信息

实施例2

纤维次生壁合成时期特异表达lc和ghpap1d融合基因的植物表达载体的构建

lc-2a、ghpap1d基因的编码序列构建入植物表达载体plgn的流程见图2。plgn是由传统的植物表达载体pbi121改造而来的一个双元植物表达载体。其t-dna区段(rb和lb之间区域，图2)替换为了组成型的2×35s启动子(2×35s-p)控制的报告基因gus和标记基因nptii的融合基因表达盒。用引物pfbl2a-f和pfbl2a-r(序列见表1)，从棉花株系冀棉14号的基因组中扩增克隆启动子fbl2a，启动子的5’端加上hindⅲ酶切位点，启动子的3’端加上bamhⅰ酶切位点。本发明所述扩增的体系优选为10μl体系，包括：2×primestarmaxpremix5μl，引物pfbl2a-f和pfbl2a-r(5μmol/l)各1μl，模板dna约60ng，加入ddh2o至10μl。本发明所述扩增的程序优选为：98℃预变性5min；然后98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物取出后加2×taqmix10μl，72℃延伸10min，在片段两端加上a尾。最后将扩增产物电泳后胶回收。回收后连接到pgem-t-easy载体上，送至华大基因公司测序。测序正确后用hindⅲ和bamhⅰ酶切，酶切后胶回收。得到启动子pfbl2a的dna片段。

连接到pgem-t-easy载体上的lc-2a-pap1d融合dna片段，测序正确后用hindⅲ和apaⅰ酶切，酶切后胶回收。得到lc-2a-pap1d融合dna片段。

将plgn载体用hindⅲ/apaⅰ酶切并电泳胶回收线性载体片段，与启动子pfbl2a、lc-2a-pap1d融合dna片段用t4dna连接酶连接,连接体系为20μl，包括：t4dnaligase1μl，10×t4dnaligasebuffer2μl，plgn-pfbl2a载体约50ng，启动子pfbl2a约50ng，lc-2a-pap1d融合dna片段约50ng，加入ddh2o至20μl。20℃恒温反应6h。连接产物转化入大肠杆菌(escherichiacoli)感受态dh5α，提取质粒酶切验证。最后获得lc-2a-ghpap1d的特异表达载体plgn-pfbl2a-lc-2a-ghpap1d。

参考bio-radmicropulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌lba4404。

实施例3

棉花的遗传转化

通过根癌农杆菌介导的方法进行上述表达载体的棉花遗传转化，所用培养基配方见表2。具体方法如下：对野生型陆地棉yz-1的饱满棉花种子脱壳处理，将少量(约20～40颗)去壳后的种子置于灭菌后的100ml三角瓶中，先用75％酒精预洗种子1min，轻轻倒出酒精再加入0.1％hgcl2灭菌约12min(不断摇动三角瓶进行灭菌)，轻轻倒出升汞，加入无菌水充分漂洗种子，漂洗10次左右。将灭好的种子放置于萌发培养基上，待胚根长出1cm左右后(约36～48h)，将胚根轻轻插进萌发培养基中，30℃左右暗培养下胚轴至7cm左右(约7天)。侵染下胚段约20h前，将携带遗传转化载体的农杆菌单菌落接种于含有50mg/lkm和125mg/lsm的液体yeb培养基中，置于28℃摇床(200rpm)，培养约20h后测量菌液的od值(od600)，od600在0.4～0.6适宜转化。收集活化后的农杆菌液，8000rpm离1min，弃上清后用相同体积mgl液体培养基(含100μmo1/las，乙酰丁香酮)重悬菌体，用无菌的100ml三角瓶收集重悬菌体，置于摇床(28℃、100rpm)培养约40min。将下胚轴用无菌手术刀切成长0.8～1cm的小段，然后置于重悬液中并在摇床(28℃、100rpm)上侵染40min，弃液体再取出下胚段轻轻放入固体共培养基表面，暗培养48h左右。暗培养后将下胚段转入固体一筛培养基中培养(30℃、16h光照/8h黑暗，下同)，30天后再转入固体iba培养基，每隔30天左右继代一次至愈伤上有绿色体胚形成，将绿色体胚转到固体分化培养基上培养。待体胚长至3cm左右后，插入生根培养基中直至幼苗长出。以上操作必须在严格的无菌条件下完成。

生长健壮的再生棉花幼苗移栽至种植钵，在温室中常规管理至棉花纤维和种子成熟。收获t0代转基因棉花种子，继续种植t1代并进行gus染色。筛选出纯合的转基因t1代株系(全部为gus阳性或gus阴性植株)。并检测靶标基因ghpap1和lc的表达水平以及比较纤维花色素含量和纤维颜色的变化。

表2根癌农杆菌介导的棉花遗传转化用培养基

实施例4

棉花纤维色泽观察和花色素含量检测及基因表达量检测

棉花纤维色泽取开花后25天和50天的纤维进行观察照相(图3)。

将开花后25天的白色纤维及红色纤维送迈维代谢公司进行转录组和代谢组检测，其中代谢组数据采集仪器系统主要包括高效液相色谱和串联质谱，基于迈维代谢公司自建数据库mwdb(metwaredatabase)及代谢物信息公共数据库，对质谱检测的一级谱、二级谱数据进行定性分析。代谢物的定量是利用三重四极杆质谱的多反应检测模式(multiplereactionmonitoring,mrm)分析完成，通过三重四极杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度(cps)，用multiaquant软件打开样本下机文件，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积(area)代表对应物质的相对含量。由反馈的数据得出花色素含量和基因表达量，结果如表3所示，共检测到8种花色素，相较于白色棉均有显著提高，花色素的总量是白色棉的4093倍。如表4所示，合成花色素前体物质的苯丙烷途径和花色素合成途径的部分结构基因以及调控基因表达量相较于白色棉均有显著提升。

表3开花后25天的白色纤维和转基因红色纤维中花色素相对含量

表4开花后25天的白色纤维和转基因红色纤维中花色素合成相关基因的表达水平

rf:红色棉；wf:白色棉；fpkm:每1百万个map上的reads中map到外显子的每1k个碱基上的reads个数；ghpal:苯丙氨酸裂解酶；ghchs：查尔酮合成酶；ghdfr：二氢黄酮醇还原酶；ghans：花色素合成酶；ghufgt：花青素葡糖基转移酶；ghgst：谷胱甘肽转移酶。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>西南大学

<120>一种调控棉花纤维呈色的融合基因及其表达载体和应用

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1830

<212>dna

<213>zeamaysl.

<400>1

atggctctttctgcttctagagttcaacaagctgaagagcttcttcaaagacctgctgaa60

agacaacttatgaggtcacaacttgctgctgctgctagatctatcaattggtcttacgct120

cttttctggtctatctctgatactcaacctggtgttcttacttggactgacggtttctat180

aacggtgaggtgaagactagaaagatctccaactctgtggaacttacttctgatcagctt240

gtgatgcaaagatctgaccagcttagagaactttacgaggctcttctttctggtgaaggt300

gatagaagagctgctcctgctagacctgctggttctctttctcctgaagatcttggtgat360

actgaatggtattacgtggtgtctatgacttatgctttcagacctggtcaaggtcttcct420

ggtagatctttcgcttctgatgaacatgtttggctttgcaatgctcatcttgctggttct480

aaggctttccctagagctcttcttgctaagtctgcttctatccagtctattctctgtatc540

cctgttatgggtggtgttcttgaacttggtaccactgatactgttcctgaagctcctgat600

cttgtttctagagctactgctgctttctgggaacctcaatgtccttcttcttctccttct660

ggtagagctaatgaaactggtgaagctgctgctgatgatggtactttcgctttcgaagaa720

cttgatcacaacaatggtatggatgacatcgaagctatgactgctgctggtggtcatggt780

caagaagaagagcttagacttagagaagctgaagctctttctgatgatgcttctcttgag840

cacattactaaggaaatcgaggagttctattctctttgtgacgagatggatcttcaagct900

cttcctcttcctcttgaagatggttggactgttgatgcttctaacttcgaagttccttgt960

tcttctcctcaacctgctcctcctcctgttgatagagctactgctaatgttgctgctgat1020

gcttctagagctcctgtttatggttctagagccacttctttcatggcttggactagatct1080

tctcaacagtcttcttgctctgatgatgctgctcctgctgctgttgttcctgctattgaa1140

gaacctcagagacttcttaagaaggttgttgctggtggtggtgcttgggaatcttgtggt1200

ggtgctactggtgctgctcaagaaatgtctggtaccggtactaagaatcacgtgatgtct1260

gaaagaaagaggcgcgagaagcttaatgagatgttcctcgtgcttaagtctcttcttcct1320

tctattcacagggttaacaaggcttctatccttgctgaaactatcgcttatctcaaggag1380

cttcaaagaagggttcaggaacttgaatcttctagagaacctgcttctagaccttctgaa1440

actactactaggcttatcactaggccttctagaggtaataacgagtctgttcgcaaggaa1500

gtttgtgctggttctaagagaaagtctcctgaacttggtagagatgatgttgaaagacct1560

cctgttcttactatggatgctggtacttctaacgttactgtgactgtttctgataaggac1620

gtgcttcttgaagttcaatgtagatgggaggaacttcttatgactagagtgttcgacgct1680

attaagtctcttcaccttgatgtgctttctgttcaagcttctgctcctgatggtttcatg1740

ggtcttaagatcagagctcaattcgctggttctggtgctgttgttccttggatgatttct1800

gaagctctcaggaaggctattggtaagagg1830

<210>2

<211>60

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

caattgcttaacttcgatttgcttaagttggctggtgatgttgaatctaaccctggtcct60

<210>3

<211>750

<212>dna

<213>gossypiumspp

<400>3

atggaaggctcatctttaagagttagaaaaggtgcatggactgaagaagaagaccttctt60

cttaagaaatgtattgagaaatatggtgaagggaaatggcatcaagtgcctgctagagct120

ggcttgaatcgttgccggaaaagctgtagactgcggtggctgaattatttgaagcctaat180

atcaagagaggatattttgcagctgatgaagttgacctcattattcgcctccataacctc240

ctaggtaatagatggtcactgattgctggtagactgccaggaagaacagcaaacgatgtg300

aaaaactattggaacacccacttgcttaaaaaaaatatagatacgtccggtaaaaactca360

aaaccaaaatcttatcaaccaaatcccaataccaaaattatcaagcctcggcctcatatc420

ttatcaaagcacagttttcttataagtttggatgagtacaataataacaacaacaacaac480

catgcagaagcaagtaacaacgtggcattagctaacgacggtaataacgactatgggtat540

tgtttccctaatgaccacgatgagatgatgtggtgggaaaatatgatgataaatgaaaag600

gaggttgatggctatcagctacagtgttcagccaatgattttgatcaaagcatgttggac660

caacctatgaatgaagagaattatggcagtactatagatgaggtttttcttgatgaggaa720

ctgtggaatgtgttcaacccatagggcccg750

<210>4

<211>610

<212>prt

<213>zeamaysl.

<400>4

metalaleuseralaserargvalglnglnalaglugluleuleugln

151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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210215220

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340345350

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355360365

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370375380

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420425430

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435440445

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450455460

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465470475480

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485490495

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>11

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