一种皮肤鳞癌原代肿瘤细胞的分离提取方法与流程

本发明属于细胞分离提取技术领域，涉及一种皮肤鳞癌原代肿瘤细胞的分离提取方法。

背景技术：

皮肤鳞状细胞癌(cutaneoussquamouscellcarcinoma，cscc)是起源于表皮或附属器角质形成细胞的一种恶性肿瘤，是非黑色素瘤皮肤肿瘤致死的首要原因。虽然手术切除病变是cscc管理的金标准，通常是肿瘤的完全根除，但约8％的cscc患者在治疗后复发和/或转移扩散，近年来发病率呈增高趋势，也越来越引起人们的广泛关注。

目前对于皮肤鳞状细胞癌的体外研究模型主要是皮肤鳞癌细胞株，如a431、scl-1等，考虑皮肤鳞癌细胞株不能完全反映皮肤鳞癌的真实体内环境状态，研究人员开始着手于皮肤鳞癌原代细胞的分离培养，以期能够解决皮肤鳞癌在致病机制、临床诊疗、药物筛选及新药研发方面的具体应用。

限制其深入研究的根源在于皮肤鳞癌原代细胞的分离提取技术上。现有的分离培养技术主要包括有组织块贴壁法和酶消化法，而这两种技术方法在获得原代细胞方面的成功率都非常的低，即使有幸获得了少量的皮肤鳞癌原代细胞，其质量也是非常差，导致皮肤鳞癌原代细胞获得率低。质量差的原因总结有皮肤鳞癌样本的深度污染、分离培养的原代细胞污染发生比例的程度高等。有研究发现167例临床皮肤鳞癌标本中共有139例培养出细菌，细菌培养阳性率为83.2％。共培养出细菌25种149株，其中革兰阴性菌84株(占56.4％)，革兰阳性菌63株(占42.3％)，真菌2株(占1.3％)。检出率最高的五种病原菌依次为金黄色葡萄球菌(占23.5％)、大肠埃希菌(占16.8％)、表皮葡萄球菌(占12.1％)、肺炎克雷伯菌(占10.1％)和铜绿假单胞菌(占8.7％)。另有研究发现20份皮肤鳞癌患者的新鲜手术标本中仅有3个样本培养出皮肤癌细胞。

技术实现要素：

为了解决皮肤鳞癌原代细胞获得困难、培养易污染，且质量低下的问题，本发明建立了一种皮肤鳞癌原代肿瘤细胞的分离提取方法。

本发明解决其技术问题所采用的方案是：

一种皮肤鳞癌原代肿瘤细胞的分离提取方法，包括以下步骤：

1)取新鲜采集的皮肤鳞癌组织样本，在无菌条件下，用含青霉素、链霉素、两性霉素b、雷帕霉素、维生素c的0.9％nacl或者pbs清洗，直至血污去除干净；

2)剪去非肿瘤组织及坏死组织，再用含青霉素、链霉素、两性霉素b、雷帕霉素、维生素c的0.9％nacl或者pbs清洗；

3)75％酒精处理1-5min，再用含青霉素、链霉素、两性霉素b、雷帕霉素、维生素c的0.9％nacl或者pbs清洗；重复该步骤一次；

4)无菌剪刀修剪样本组织切碎呈1mm³小块，加入含i型胶原酶、iv型胶原酶、透明质酸酶、中性蛋白酶和溶菌酶的混合酶消化液进行消化处理；

5)消化完成后吹散组织，按照1:1-1:10的比例加入含2％-20％胎牛血清的1640基础培养基混匀；过滤，收集滤液；

6)滤液按800-2500r/min，离心5-30min，收集细胞沉淀，重悬于完全培养基中，接种及培养。

进一步地，所述的含青霉素、链霉素、两性霉素b、雷帕霉素、维生素c的0.9％nacl或者pbs中，青霉素的浓度为50-300u/ml，链霉素的浓度为5-20mg/ml，两性霉素b的浓度为5-50μg/ml，雷帕霉素的浓度为0.1-0.5μg/ml，维生素c的浓度为1-5μg/ml。

进一步地，所述的含i型胶原酶、iv型胶原酶、透明质酸酶、中性蛋白酶和溶菌酶的混合酶消化液中，i型胶原酶的使用浓度为0.5-3mg/ml，iv型胶原酶的使用浓度为0.5-3mg/ml，透明质酸酶的使用浓度为0.5-3mg/ml，中性蛋白酶的使用浓度为0.1-3mg/ml，溶菌酶的使用浓度为1-100mg/ml。

进一步地，步骤1)-3)中，分别用含青霉素、链霉素、两性霉素b、雷帕霉素、维生素c的0.9％nacl或者pbs清洗1-5次。

进一步地，步骤4)进行消化处理的方式包括：37℃水浴消化1-5h，或4℃过夜消化处理。

进一步地，步骤5)中采用100μm筛网过滤。

进一步地，所述的完全培养基为含青霉素、链霉素、两性霉素b、雷帕霉素、维生素c、fbs、脐带间充质干细胞上清液、its、egf的1640培养基。

更进一步地，所述的完全培养基中，青霉素的浓度为50-300u/ml，链霉素的浓度为5-20mg/ml，两性霉素b的浓度为5-50μg/ml，雷帕霉素的浓度为0.1-0.5μg/ml，维生素c的浓度为1-5μg/ml，fbs的浓度为2％-20％，脐带间充质干细胞上清液的添加比例为5％-30％，its的浓度为0.5-5％；egf的浓度为2-30ng/ml。

更进一步地，所述的脐带间充质干细胞上清液的制备方法为：取培养的脐带间充质干细胞培养基上清，置于2个50ml无菌离心管中，配平，2000rpm/min，离心10min，收集上清；再置于2个50ml无菌离心管中，配平，2000rpm/min，离心10min，收集上清，分装。

进一步地，步骤6)包括置于37℃，5％co2培养箱中进行培养，培养7-10天时，观察并传代培养，传代比例为1:4。

在皮肤鳞癌样本的处理上，除了采用青霉素、链霉素、两性霉素b来抑制微生物污染之外，还采用雷帕霉素、维生素c来加强对微生物的抑制作用，以减少在样本处理时的微生物污染概率。此外还采用两步75％酒精处理，为的是进一步的灭杀样本表面的微生物，通过延长处理时间来深入灭杀样本的浅表层微生物污染，进一步的提高原代细胞的提取成功率。在皮肤鳞癌样本的酶消化上，我们采用了五种不同的酶，其中i型胶原酶、iv型胶原酶、透明质酸酶、中性蛋白酶是使样本组织尽可能地在损伤小的情况下，更多的获得皮肤鳞癌的单细胞，而添加溶菌酶的目的是进一步地抑制和灭杀因酶解过程中的深层微生物污染。在皮肤鳞癌原代细胞培养时，采用专用的完全培养基，一方面添加青霉素、链霉素、两性霉素b、雷帕霉素、维生素c可以有效的在培养阶段阻断并降低微生物的污染，另一方面添加脐带间充质干细胞上清液是为了提供一个多因子的细胞生长微环境有效扩增获得皮肤鳞癌原代细胞，再一方面添加了its和egf，这两个组分可以促进皮肤鳞癌原代细胞的生长和快速繁殖，有效降低细胞倍增时间，获得大量的原代细胞。

本发明的有益效果如下：

通过本发明获得的皮肤鳞癌原代细胞不仅分离提取的成功率高，培养污染的发生程度低，而且获得原代细胞数量多，质量高。经传代培养可获得大量的皮肤鳞癌细胞。显微镜下皮肤鳞癌原代细胞有典型的上皮样细胞和成纤维样细胞。相比于常规培养的皮肤鳞癌细胞，本发明的所获得皮肤鳞癌细胞生物活性更高，生长速率更快。

附图说明

图1为本发明实施例中培养7天时的皮肤鳞癌原代细胞显微观察。

图2为本发明实施例中传代培养3天时的皮肤鳞癌p1代细胞显微观察。

图3为本发明实施例中传代培养5天时的皮肤鳞癌p1代细胞显微观察。

图4为本发明实施例中不同处理方法的皮肤鳞癌原代细胞分离培养成功率比较。

图5为本发明实施例中皮肤鳞癌传代细胞倍增时间比较。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

一.脐带间充质干细胞上清液的制备

1、采用已公开的技术(陈璇.人脐带间充质干细胞培养上清的免疫抑制作用研究[d].广东药学院,2014.)培养并取得脐带间充质干细胞培养液上清，置于2个50ml无菌离心管中，配平；

2、2000rpm/min，离心10min；

3、收集上清，再置于2个50ml无菌离心管中，配平；

4、2000rpm/min，离心10min；

5、收集上清，分装于15ml无菌离心管中，-20℃下存储，备用。

二.皮肤鳞癌组织样本的处理

1、取新鲜采集的皮肤鳞癌组织样本(该样本来源于北京大学第三医院成形外科患者术后肿瘤组织，已获得批准允许使用)，在无菌条件下，用含100u/ml青霉素、10mg/ml链霉素、25μg/ml两性霉素b、0.3μg/ml雷帕霉素、2μg/ml维生素c的0.9％nacl(或者pbs)清洗2次，直至血污去除干净；

2、剪去非肿瘤组织及坏死组织，再用含100u/ml青霉素、10mg/ml链霉素、25μg/ml两性霉素b、0.3μg/ml雷帕霉素、2μg/ml维生素c的0.9％nacl清洗2次；

3、75％酒精处理1min，再用含100u/ml青霉素、10mg/ml链霉素、25μg/ml两性霉素b、0.3μg/ml雷帕霉素、2μg/ml维生素c的0.9％nacl清洗2次；

4、再用75％酒精处理1min，再用含100u/ml青霉素、10mg/ml链霉素、25μg/ml两性霉素b、0.3μg/ml雷帕霉素、2μg/ml维生素c的0.9％nacl清洗2次。

三.皮肤鳞癌组织样本的酶消化处理

1、无菌剪刀修剪样本组织切碎呈1mm³小块，加入混合酶消化液(含1mg/mli型胶原酶、1mg/mliv型胶原酶、1mg/ml透明质酸酶、1mg/ml中性蛋白酶和10mg/ml溶菌酶)，37℃水浴消化2h；

2、消化完成后用轻轻吹散组织，按照1:3的比例加入含10％胎牛血清的1640基础培养基混匀；

3、经100μm筛网过滤，收集滤液。

四.皮肤鳞癌原代细胞的培养

1、滤液按1500r/min，离心10min，收集细胞沉淀，重悬于完全培养基中。

完全培养基的配方为：

含100u/ml青霉素、10mg/ml链霉素、25μg/ml两性霉素b、0.3μg/ml雷帕霉素、2μg/ml维生素c、10％fbs、15％脐带间充质干细胞上清液、1％its、10ng/mlegf的1640培养基。

2、接种于培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱中进行培养，培养7天时，100×显微镜下观察，如图1所示。结果显示皮肤鳞癌原代细胞生长良好，具有完整的克隆性。

五.细胞传代培养

1、取汇合度为80-90％的肿瘤原代细胞，用pbs/生理盐水冲洗残余培养基。

2、用1ml0.25％胰蛋白酶/edta溶液在室温下孵育2min。用相位对比显微镜密切监测。

3、当细胞变圆并开始从底物上分离时，轻轻地点击培养皿或培养瓶，并通过抽吸移除分离的细胞。

4、加入1640培养基终止消化，并将混合物转移到15ml的离心管中，1500rpm/min，离心10min；

5、离心后，将细胞颗粒重新悬浮在条件性培养基中，按照传代比例1:4进行传代培养。100×显微镜下观察，结果显示皮肤鳞癌p1代细胞有典型的上皮样细胞和成纤维样细胞(见图2)，且上皮样细胞呈聚集生长(见图3)。

六.不同因素对分离提取结果影响

1、不同抗生素及添加物对原代细胞分离成功率的影响

青链霉素处理组：采用含100u/ml青霉素、10mg/ml链霉素的0.9％nacl对皮肤鳞癌组织样本进行处理；

青链霉素+两性霉素b处理组：采用含100u/ml青霉素、10mg/ml链霉素、25μg/ml两性霉素b的0.9％nacl对皮肤鳞癌组织样本进行处理；

青链霉素+两性霉素b+雷帕霉素+维生素c处理组：采用含100u/ml青霉素、10mg/ml链霉素、25μg/ml两性霉素b、0.3μg/ml雷帕霉素、2μg/ml维生素c的0.9％nacl对皮肤鳞癌组织样本进行处理；

分离成功比例见表1。

表1.不同抗生素及添加物的皮肤鳞癌原代细胞分离成功比例

由表1可见，青链霉素+两性霉素b+雷帕霉素+维生素c处理组的原代细胞分离成功比例明显高于青链霉素处理组、青链霉素+两性霉素b处理组。

2、不同处理方法对原代细胞分离成功率的影响

取新鲜采集的皮肤鳞癌组织样本5份(该样本同样来源于北京大学第三医院成形外科患者术后肿瘤组织)，分别每份等体积分为3组，分别采用如下三种方法进行皮肤鳞癌原代细胞分离培养。

组织块贴壁法：取组织样本，修剪切碎呈1mm³小块，加入少许含fbs的培养基并用吸管轻轻吹打组织，取部分组织块均匀接种于另一培养瓶中，不加培养基。37℃，5％co2孵育2h以上，组织块贴壁牢固后补充足量培养基，细胞培养箱内静置培养2-4d。4d时更换培养基，8天时再次更换培养基。

常规酶消化法：取组织样本，修剪切碎呈1mm³小块，加适量体积的1mg/mli型胶原酶，37℃水浴消化2小时，消化过程中不断摇动离心管，消化结束后，加入等体积的含10％fbs的1640培养基终止消化，1500rpm/min，离心10min，收集沉淀，使用含10％fbs的1640培养基重悬计数，计数后，接种于培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱中进行培养。

混合酶消化法：取组织样本，修剪切碎呈1mm³小块，加适量体积的混合酶消化液(含1mg/mli型胶原酶、1mg/mliv型胶原酶、0.1mg/ml透明质酸酶、1mg/ml中性蛋白酶)，37℃水浴消化2小时，消化过程中不断摇动离心管，消化结束后，加入等体积的含10％fbs的1640培养基终止消化，1500rpm/min，离心10min，收集沉淀，使用含10％fbs的1640培养基重悬计数，计数后，接种于培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱中进行培养。

根据三种分离培养方法的结果，统计成功率，结果如图4所示，统计结果显示：采用组织块贴壁法分离培养的5份组织，全部污染，未获得成功；采用常规酶消化法分离培养的5份组织，4份污染，1份获得成功；采用混合酶消化法分离培养的5份组织，5份获得成功。结果表明采用混合酶消化法的分离成功率明显优于常规酶消化法、组织块贴壁法。

3、皮肤鳞癌传代细胞倍增时间比较

取汇合度为80-90％的肿瘤原代细胞，消化并计数，按照1×10⁶接种1个六孔板中，每3孔为一组，分别为普通培养组、完全培养组。

普通培养组为含100u/ml青霉素、10mg/ml链霉素、10％fbs的1640培养基组；

完全培养组为含100u/ml青霉素、10mg/ml链霉素、25μg/ml两性霉素b、0.3μg/ml雷帕霉素、2μg/ml维生素c、10％fbs、15％脐带间充质干细胞上清液1％its、10ng/mlegf的1640培养基组。

在培养72h之后，再次消化计数，根据倍增时间计算公式

t＝t×{lg2/(lgnt-lgn0)}，

其中t为培养的时间，nt为培养时间终止时的细胞总量，n0为细胞的接种量。计算两组的细胞倍增时间。

结果如图5所示，结果显示完全培养组的细胞倍增时间明显少于普通培养组，普通培养组的细胞倍增时间为34.3h，完全培养组的细胞倍增时间为24.6h，表明在完全培养条件下的细胞生长速率快。

因此，通过本发明获得的皮肤鳞癌原代细胞不仅分离提取的成功率高，培养污染的发生程度低，而且获得原代细胞数量多，质量高。经传代培养可获得大量的皮肤鳞癌细胞。显微镜下皮肤鳞癌原代细胞有典型的上皮样细胞和成纤维样细胞。相比于常规培养的皮肤鳞癌细胞，本发明的所获得皮肤鳞癌细胞生物活性更高，生长速率更快。