一种干细胞3d培养用多孔胶原微球载体及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及干细胞培养领域，尤其是涉及一种干细胞3d培养用多孔胶原微球载体及其制备方法 。
背景技术：
2.干细胞种类很多，已经在疾病治疗、医美、抗衰、药物筛选等众多领域大量应用。干细胞培养已经成为整个干细胞产业链发展的制约瓶颈，干细胞培养器已经成为干细胞培养领域的开发热点。按干细胞培养装置的特点，分为2d培养与3d培养两大类。2d培养主要通过增大皿进行，批量换液、扩散法供气。3d培养主要在立体容器中完成，可以自主调控培养液的组成，可以主动向培养液供气，对培养过程的调控手段更丰富，3d培养技术逐渐成为干细胞产业链的主流。
3.干细胞3d培养载体是影响干细胞3d培养产业链的关键要素，有众多厂家进行干细胞3d培养载体研究开发，但多数厂家在制造干细胞3d培养载体尤其是多孔微载体时都是采用有机溶剂，包括苯，作为致孔剂，对培养的干细胞有潜在的危害，迫切需要探索对干细胞友好的致孔剂。
4.同时，传统的干细胞培养都采用胰酶消化干细胞，从而使干细胞从不溶的载体上解离下来；这类干细胞分离方法对干细胞的损伤极大，干细胞产业急需可以温和裂解的干细胞培养载体，在载体裂解过程中最大限度地减少对干细胞的损伤。能够在不伤害干细胞条件下裂解的、多孔的、仿真干细胞生巢设计的、对干细胞友好的新型干细胞3d培养载体已经干细胞产业发展瓶颈。
技术实现要素：
5.针对上述不足，本发明提供一种干细胞3d培养用多孔胶原微球载体及其制备方法，其实质以对干细胞友好的碳酸钙材料为致孔剂，利用稀酸将碳酸钙溶解除去并形成载体内部孔道，整个干细胞3d培养用载体制造过程中不使用有机溶剂，有效避免利用挥发法去除致孔用有机溶剂造成的干细胞3d培养载体内有机溶剂残留问题。同时，制备的干细胞3d培养用多孔胶原微球载体能够用胶原蛋白酶温和裂解，有效避免多孔载体裂解并释放干细胞时对干细胞的损伤。
6.本发明克服现有干细胞培养载体的不足，发明的一种干细胞3d培养用多孔胶原微球载体及其制备方法的具体步骤如下：s1 将胶原（或胶原的降解物）与碳酸钙按比例混合后进行超微粉碎；s2 利用固体造粒技术获得固体颗粒；s3将固体颗粒置于高浓度戊二醛中固定后，在含有戊二醛的稀酸溶液中使碳酸钙溶解形成孔道，同时利用戊二醛进行微球内部胶原的固定；s4 将完成胶原固定与碳酸钙溶解的多孔微球充分洗净，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存。
7.优选地，将胶原（或胶原的降解物）与碳酸钙按比例混合后进行超微粉碎，将碳酸钙做为助磨剂使用保证胶原（或胶原的降解物）充分粉碎，同时促进两者的充分混合。
8.优选地，胶原（或胶原的降解物）与碳酸钙的质量混合比例范围1：0.1-2。
9.优选地，利用固体造粒技术获得固体颗粒，颗粒大小0.1-1mm。
10.优选地，将固体颗粒置于含有戊二醛的稀酸溶液中，颗粒形成过程中起到占位作用的碳酸钙在稀酸溶解后形成孔道形成未来细胞生长的空间，同时也是戊二醛进入颗粒内部的通道完成整个颗粒的固定。
11.优选地，戊二醛的浓度范围0.1%-5%。
12.优选地，稀酸的酸碱度范围ph 3-ph7。
13.优选地，将完成胶原固定与碳酸钙溶解的微球充分洗净，去除戊二醛、钙盐，洗到中性后用于低温干燥。
14.优选地，采用辐照技术完成干细胞3d培养载体的无菌处理。
15.优选地，干细胞3d培养用胶原载体不仅满足msc类干细胞3d培养制备，也适用hsc类干细胞3d培养制备。
16.有益效果：本发明提供一种干细胞3d培养用多孔胶原微球载体及其制备方法，其实质以对干细胞友好的碳酸钙材料为致孔剂，利用稀酸就可以把碳酸钙溶解除去，整个干细胞3d培养用胶原载体制造过程中不使用有机溶剂，有效避免利用挥发法去除致孔用有机溶剂造成的干细胞3d培养载体内有机溶剂残留问题。同时，能够用胶原蛋白酶温和裂解多孔胶原微球载体，有效避免制备的3d培养干细胞在多孔载体裂解释放时受到损伤。
17.下面结合实施例对本发明作进一步说明。本发明中涉及到研发团队已经申报专利的相关技术、方法与设备，在实施例中仅重点说明相关专利技术或方法或设备在干细胞3d培养制备过程中的主要用途，不再具体描述已申报专利的具体细节。
18.实施例1（1）干细胞3d培养用多孔胶原微球载体的制备s1 将医用明胶与碳酸钙按1：0.8的质量混合比例进行超微粉碎；s2 利用挤压造粒技术获得固体颗粒，颗粒大小0.3mm左右。；s3将固体颗粒先用10%的戊二醛溶液固定后，置于含有戊二醛的稀酸溶液中，戊二醛的浓度范围0.25%，稀酸的酸碱度范围ph 4.5，利用戊二醛进行胶原固定保留微球形态，利用稀酸使碳酸钙溶解形成孔道，形成内部多孔道的干细胞3d培养用胶原载体微球；s4 将完成胶原固定与碳酸钙溶解的多孔微球用超纯水充分洗净，去除戊二醛、钙盐，洗到中性后用于低温干燥。将干燥后的多孔微球进行辐照无菌处理，无菌处理后进行产品检测与保存。
19.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行msc干细胞3d培养s5利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：
s6将以干细胞3d培养用胶原载体与msc干细胞种子混合，按每百万个msc用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行msc干细胞3d培养增殖。
20.s7 对获得的msc干细胞进行相应的检测并保存。获得msc按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd29(99.87%)、cd 44(99.98%)、cd73 (99.89%)、cd90 (99.68%)、cd 105(99.56%); cd14 (0.13%)、cd19 (0.11%)、cd31 (0.18%)、cd34 (0.07%)、cd45 (0.09%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
21.实施例2（1）进行干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将医用明胶与碳酸钙按1：0.1的质量混合比例进行超微粉碎；s2 利用挤压造粒技术获得固体颗粒，颗粒大小0.1mm左右。
22.s3将固体颗粒置于含有戊二醛的稀酸溶液中，戊二醛的浓度范围0.1%，稀酸的酸碱度范围ph 6，利用戊二醛进行胶原固定保留微球形态，利用稀酸使碳酸钙溶解形成孔道，形成内部多微孔道的干细胞3d培养用胶原载体微球；s4 将完成胶原固定与碳酸钙溶解的多孔微球用超纯水充分洗净，去除戊二醛、钙盐，洗到中性后用于低温干燥。将干燥后的多孔微球进行辐照无菌处理，无菌处理后进行产品检测与保存。
23.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行msc干细胞3d培养s5利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s6将以干细胞3d培养用胶原载体与msc干细胞种子混合，按每百万个msc用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行msc干细胞3d培养增殖。
24.s7 对获得的msc干细胞进行相应的检测并保存。获得msc按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd29(99.97%)、cd 44(99.98%)、cd73 (99.95%)、cd90 (99.88%)、cd 105(99.94%); cd14 (0.13%)、cd19 (0.03%)、cd31 (0.04%)、cd34 (0.04%)、cd45 (0.07%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
25.实施例3（1）进行干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将胶原与碳酸钙按1：2的质量混合比例进行超微粉碎；s2 利用挤压造粒技术获得固体颗粒，颗粒大小1mm左右。
26.s3将固体颗粒置于含有戊二醛的稀酸溶液中，戊二醛的浓度范围5%，稀酸的酸碱度范围ph 3，利用戊二醛进行胶原固定保留微球形态，利用稀酸使碳酸钙溶解形成孔道，形成内部多微孔道的干细胞3d培养用胶原载体微球；s4 将完成胶原固定与碳酸钙溶解的多孔微球用超纯水充分洗净，去除戊二醛、钙盐，洗到中性后用于低温干燥。将干燥后的多孔微球进行辐照无菌处理，无菌处理后进行产品检测与保存。
27.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行msc干细胞3d培养
s5利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s6将以干细胞3d培养用胶原载体与msc干细胞种子混合，按每百万个msc用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行msc干细胞3d培养增殖。
28.s7 对获得的msc干细胞进行相应的检测并保存。获得msc按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd29(99.87%)、cd 44(99.88%)、cd73 (99.88%)、cd90 (99.97%)、cd 105(99.74%); cd14 (0.15%)、cd19 (0.05%)、cd31 (0.09%)、cd34 (0.04%)、cd45 (0.05%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
29.实施例4（1）进行干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将医用明胶与碳酸钙按1：1的质量混合比例进行超微粉碎；s2 利用挤压造粒技术获得固体颗粒，颗粒大小0.3mm左右。
30.s3将固体颗粒置于含有戊二醛的稀酸溶液中，戊二醛的浓度范围5%，稀酸的酸碱度范围ph 4.5，利用戊二醛进行胶原固定保留微球形态，利用稀酸使碳酸钙溶解形成孔道，形成内部多微孔道的干细胞3d培养用胶原载体微球；s4 将完成胶原固定与碳酸钙溶解的多孔微球用超纯水充分洗净，去除戊二醛、钙盐，洗到中性后用于低温干燥。将干燥后的多孔微球进行辐照无菌处理，无菌处理后进行产品检测与保存。
31.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行msc干细胞3d培养s5利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s6将以干细胞3d培养用胶原载体与msc干细胞种子混合，按每百万个msc用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行msc干细胞3d培养增殖。
32.s7 对获得的msc干细胞进行相应的检测并保存。获得msc按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd29(99.77%)、cd 44(99.88%)、cd73 (99.75%)、cd90 (99.978%)、cd 105(99.74%); cd14 (0.17%)、cd19 (0.27%)、cd31 (0.17%)、cd34 (0.12%)、cd45 (0.11%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
33.实施例5（1）进行干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将医用明胶与碳酸钙按1：0.8的质量混合比例进行超微粉碎；s2 利用挤压造粒技术获得固体颗粒，颗粒大小0.4mm左右。；s3将固体颗粒置于含有戊二醛的稀酸溶液中，戊二醛的浓度范围0.2%，稀酸的酸碱度
范围ph 4.5，利用戊二醛进行胶原固定保留微球形态，利用稀酸使碳酸钙溶解形成孔道，形成内部多微孔道的干细胞3d培养用胶原载体微球；s4 将完成胶原固定与碳酸钙溶解的多孔微球用超纯水充分洗净，去除戊二醛、钙盐，洗到中性后用于低温干燥。将干燥后的多孔微球进行辐照无菌处理，无菌处理后进行产品检测与保存。
34.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行nk细胞3d培养s5利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s6将以干细胞3d培养用胶原载体与nk细胞种子混合，按每百万个nk用200mg微载体的比例进行接种，接种后进行nk细胞3d培养增殖。
35.s7 对获得的nk细胞进行相应的检测并保存。获得nk细胞按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果:cd3
+
cd8
+
、cd3-cd（56+16）
+
、cd3
+
cd56
+
超过95%，抗原表征达到国内与国际标准要求。
36.本发明的一种干细胞3d培养用多孔胶原微球载体及其制备方法，包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案全部进行描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。