降低USP1表达的物质在制备治疗儿童T系急性淋巴细胞白血病的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及降低去泛素化酶usp1表达的物质在制备治疗儿童t系急性淋巴细胞白血病的药物中的应用。

背景技术：

急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,all)是儿童最常见的恶性肿瘤，也是儿童期疾病相关死亡的主要原因。t系急性淋巴细胞白血病(t-all)是all中极具侵袭性的一个亚型，目前仍有高达30％的t-all患儿治疗无效或发生复发。发生发展的机制未明是t-all治愈率进一步提高的瓶颈。因此，深入研究儿童t-all，特别是难治复发t-all发生发展的分子机制，对于探索新的靶向治疗方案，以及提高生存率都至关重要。

usp1(ubiquitin-specificpeptidase1)，即泛素特异性肽酶1，是一种半胱氨酸酶，属于去泛素化酶(deubiquitinases,dubs)的usps家族，与其他的usps成员一样，usp1包含高度保守的半胱氨酸结构域(cysbox)和组氨酸结构域(hisbox)。

研究发现usp1与靶蛋白相互作用，通过去泛素化调节靶蛋白的稳定性，从而影响dna损伤修复、基因组稳定性、细胞凋亡、衰老、分化、生长、周期进展、自噬、干细胞特征维持等重要的生物学过程。usp1在多发骨髓瘤、胶质母细胞瘤、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种人类肿瘤中存在高表达，并且与肿瘤的发生发展密切相关，其作为肿瘤治疗的靶点已受到广泛关注。但是目前usp1在t-all，特别是儿童t-all发生发展中的作用机制还未见报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种可促进t系急性淋巴细胞白血病(t-all)细胞凋亡、抑制该细胞增殖的短发夹rna(shrna，shorthairpinrna)及其相关生物材料。

本发明提供形成茎环结构的短发夹rna，其为以下shrna-1或shrna-2：

(1)shrna-1，所述shrna-1的茎环(stem-loop)结构中茎(stem)的一条链序列为seqidno:1，茎的另一条链序列为seqidno:2，其中seqidno:1和seqidno:2均由21个核糖核苷酸组成；

(2)shrna-2，所述shrna-2的茎环结构中茎的一条链序列为seqidno:3，茎的另一条链序列为seqidno:4，其中seqidno:3和seqidno:4均由21个核糖核苷酸组成。

所述短发夹rna(shrna-1和shrna-2)中的环(loop)只要满足使所述短发夹rna能产生由seqidno:1所示的单链rna和seqidno:2所示的单链rna组成的双链小干扰rna(sirna)或产生由seqidno:3所示的单链rna和seqidno:4所示的单链rna组成的双链小干扰rna即可。在本发明的一个实施方案中，所述shrna-1的核苷酸序列为seqidno:5，其中seqidno:5由48个核糖核苷酸组成，seqidno:5的第1-21位与seqidno:1相同，seqidno:5的第28-48位与seqidno:2相同。在本发明的一个实施方案中，所述shrna-2的核苷酸序列是seqidno:6，其中，seqidno:6由48个核糖核苷酸组成，seqidno:6的第1-21位与seqidno:3相同，seqidno:6的第28-48位与seqidno:4相同。

本发明还提供编码上述短发夹rna(shrna-1和shrna-2)的dna分子。在本发明的一个实施方案中，编码shrna-1的dna分子为seqidno:8和seqidno:9形成的双链dna分子。在本发明的一个实施方案中，编码shrna-2的dna分子为seqidno:10和seqidno:11形成的双链dna分子。

本发明还提供与上述短发夹rna(shrna-1和shrna-2)相关的生物材料，为如下1)-5)中的任一种：

1)含有上述任一所述的dna分子的表达盒；

2)含有上述任一所述的dna分子的重组载体、或含有1)所述的表达盒的重组载体；

3)含有上述任一所述的dna分子的重组微生物、或含有1)所述的表达盒的重组微生物或含有2)所述的重组载体的重组微生物；

4)含有上述任一所述的dna分子的转基因细胞系、或含有1)所述的表达盒的转基因细胞系或含有2)所述的重组载体的转基因细胞系；

5)小干扰rna，sirna-1和sirna-2，其中所述sirna-1由seqidno:1和seqidno:2两条链组成，所述sirna-2由seqidno:3和seqidno:4两条链组成。

经过细胞内dicer酶的酶切作用，shrna-1可以产生sirna-1，shrna-2可以产生sirna-2，sirna-1的靶位点为sh-1，sh-1为seqidno:14的第2574-2594位，sirna-2的靶位点为sh-2，sh-2为seqidno:14的第2030-2050位。

上述生物材料中，1)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述任一所述的dna分子的dna，该dna不但可以包括启动shrna-1或shrna-2基因转录的启动子，还可以包括终止shrna-1或shrna-2基因转录的终止子，进一步地，还可以包括增强子序列；2)所述重组载体具体为用编码shrna-1或shrna-2的dna分子替换gv493的ageⅰ和ecorⅰ之间的片段得到的gv493-usp1-sh-1或gv493-usp1-sh-2；3)所述重组微生物具体可为细菌、酵母、藻和真菌；4)所述转基因细胞不包括动物和植物的繁殖材料。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供治疗和/或预防t系急性淋巴细胞白血病的产品，所述产品的活性成分包括如下b1-b4中的至少一种：

b1、上述任一所述的短发夹rna；

b2、上述任一所述的dna分子；

b3、上述任一所述的生物材料；

b4、usp1抑制剂，优选ml323。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供促进t系急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的产品，所述产品的活性成分包括如下b1-b4中的至少一种：

b1、上述任一所述的短发夹rna；

b2、上述任一所述的dna分子；

b3、上述任一所述的生物材料；

b4、usp1抑制剂，优选ml323。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供抑制t系急性淋巴细胞白血病细胞增殖的产品，所述产品的活性成分包括如下b1-b4中的至少一种：

b1、上述任一所述的短发夹rna；

b2、上述任一所述的dna分子；

b3、上述任一所述的生物材料；

b4、usp1抑制剂，优选ml323。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供降低去泛素化酶usp1表达的物质的用途，所述用途为a1-a3中的任一种：

a1、治疗和/或预防t系急性淋巴细胞白血病；

a2、促进t系急性淋巴细胞白血病细胞凋亡；

a3、抑制t系急性淋巴细胞白血病细胞增殖。

在一个实施方案中，上述用途中，所述降低usp1表达的物质包括如下b1-b4中的至少一种：

b1、上述任一所述的短发夹rna；

b2、上述任一所述的dna分子；

b3、上述任一所述的生物材料；

b4、usp1抑制剂，优选ml323。

任选地，进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

在一个实施方案中，上述用途中，所述去泛素化酶usp1的氨基酸序列为seqidno:15所示，所述去泛素化酶usp1的基因序列如seqidno:14的第422-2779位所示。

在一个实施方案中，上述用途中，t系急性淋巴细胞白血病为儿童t系急性淋巴细胞白血病。

本发明证明，以去泛素化酶usp1的mrna为靶点，将rna干扰重组表达载体——表达shrna-1和shrna-2的重组表达载体gv493-usp1-sh-1和gv493-usp1-sh-2转入t淋巴细胞白血病的细胞系jurkat中获得的重组白血病细胞，其去泛素化酶usp1的表达水平明显低于对照组，细胞总体凋亡比率分别为24％和43％，是对照的10倍和17.9倍；白血病重组细胞的增殖速度显著低于对照组。本发明发现去泛素化酶usp1可以作为治疗t-all的新靶点，抑制usp1的表达可以促进t-all细胞凋亡、抑制t-all细胞增殖。本发明为t-all，尤其是儿童t-all的治疗提供了新的方向，去泛素化酶usp1有望成为抗t-all治疗的一个潜在靶点，在医学领域具有不可估量的应用价值。

附图说明

图1示出usp1在儿童t-all骨髓标本中的mrna及蛋白表达。图1中，(a)t-all患儿骨髓标本(n＝169)中usp1的mrna表达水平显著高于健康人骨髓标本(n＝73，p<0.0001)；(b)westernblot结果显示相对于对照itp标本，t-all患儿骨髓标本中usp1存在高表达；(c)westernblot结果显示1例t-all患儿初诊(nd)-缓解(cr)-复发(re)成对骨髓标本中，usp1在初诊和复发标本中表达上调，缓解期不表达。

图2示出敲降usp1对jurkat细胞增殖和凋亡的影响。图2中，(a)westernblot结果显示jurkat细胞中usp1的2个shrna靶点显著下调usp1的蛋白表达水平；(b)cck-8细胞增殖结果显示敲降usp1后jurkat细胞的增殖能力显著降低；(c)流式细胞仪检测usp1的rna干扰重组白血病细胞中的细胞凋亡比例；(d)重组白血病细胞细胞凋亡比例柱型统计图。

图3示出usp1抑制剂ml323对jurkat细胞增殖和凋亡的影响。图3中，(a)usp1抑制剂ml323(1μm和10μm)可以有效抑制jurkat细胞的增殖；(b)流式细胞仪检测usp1抑制剂ml323(50μm)处理细胞后的细胞凋亡比例；(c)usp1抑制剂ml323(50μm)处理细胞后的细胞凋亡比例柱型统计图。

图4示出jurkat细胞中敲降usp1后的转录组测序结果。图4中，(a)usp1sh-rna敲降组和sh-control对照组差异表达基因火山图；(b)gsea分析显示敲降usp1后促进细胞凋亡；(c)gsea分析显示敲降usp1后细胞增殖通路受抑制。

图1-4中，sh-control、usp1sh-1和usp1sh-2分别代表重组白血病细胞jurkat/gv493-sh-control、jurkat/gv493-usp1-sh-1和jurkat/gv493-usp1-sh-2。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

annexinv细胞凋亡检测试剂盒购自ebioscience，货号88-8007-72。

cck-8细胞增殖检测试剂盒购自日本同仁化学，货号ck04。

实施例1：去泛素化酶usp1在儿童t-all中过表达

1、mrna水平过表达

ncbigeo数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下载健康儿童及儿童t-all患儿骨髓标本的基因表达谱结果(gse13159)，采用t-test分析，我们发现在儿童t-all骨髓标本(n＝169)中usp1mrna表达水平显著高于健康儿童骨髓标本(n＝73,p<0.0001)，结果如图1中a所示。

2、蛋白水平过表达

采用肝素抗凝管抽取2mlt-all患儿的骨髓细胞，加入5ml的红细胞裂解液混匀，静置2分钟后100g离心5分钟，弃上清并重复上述步骤，然后用生理盐水将管底细胞洗两遍，去上清，收集细胞。

采用ripa裂解液(购自北京普利莱基因技术有限公司，货号c1053)提取总蛋白，以gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内参，进行westernblot检测，其中使用usp1多克隆抗体(购自proteintech，货号14346-1-ap)或gapdh单克隆抗体(购自上海康成生物工程有限公司，货号kc-5g5)进行一抗孵育，使用结合辣根过氧化物酶的羊抗兔二抗(anti-rabbitigg,hrp-linkedantibody，购自cellsignalingtechnology公司，货号7074)进行二抗孵育，最后使用superecl超敏发光液(购自北京普利莱基因技术有限公司，货号p1030)进行显色反应。usp1(分子量为110kda，100kda)，gapdh(分子量34kda)。结果如图1中b所示，结果表明，在4例t-all患儿骨髓标本(泳道1、2、3、5)中存在usp1的表达，而对照样品(特发性血小板减少性紫癜，itp)中不表达usp1。

对t-all患儿初诊(nd)-缓解(cr)-复发(re)成对骨髓标本进行westernblot检测，结果如图1中c所示，结果表明，初诊和复发样本中都有usp1的表达，而缓解期无表达，提示usp1蛋白表达上调有可能与t-all的复发相关。

实施例2：去泛素化酶usp1的rna干扰重组表达载体的构建

1、rna干扰靶序列的选择

针对去泛素化酶usp1编码基因usp1的全长cdna序列(seqidno:14)，选择如下两段dna序列为rna干扰的靶序列：

sh-1:seqidno:14的第2574-2594位(即5’-ccagtgaccaaacaggcatta-3’)

sh-2:seqidno:14的第2030-2050位(即5’-gctagtggtttggagtttgat-3’)

seqidno:14中第422-2779位为开放阅读框，编码seqidno:15所示的去泛素化酶usp1。

2、小干扰rna(sirna)

分别设计针对步骤1去泛素化酶usp1两种靶序列的两种sirna，sirna-1和sirna-2，其中，sirna-1的靶序列为sh-1，sirna-2的靶序列为sh-2。

sirna-1

sirna-1-f:5’-ccagugaccaaacaggcauua-3’(seqidno:1)

sirna-1-r:5’-uaaugccuguuuggucacugg-3’(seqidno:2)

sirna-2

sirna-2-f:5’-gcuagugguuuggaguuugau-3’(seqidno:3)

sirna-2-r:5’-aucaaacuccaaaccacuagc-3’(seqidno:4)

3、短发夹rna(shrna)

根据步骤2的两种sirna，设计产生sirna-1的shrna-1和产生sirna-2的shrna-2。

shrna-1和shrna-2的序列如下(大写字母为环序列，其余序列为茎序列，两段茎序列形成反向重复序列)：

shrna-1：5’-ccagugaccaaacaggcauuacucgaguaaugccuguuuggucacugg-3’(seqidno:5)

shrna-2：5’-gcuagugguuuggaguuugaucucgagaucaaacuccaaaccacuagc-3’(seqidno:6)。

同时，设计shrna-control作为对照，ncbi数据库中检索，该序列和人类基因组中的任何序列没有连续16个碱基的同源性，因此用来作为阴性对照。

shrna-control：5’-uucuccgaacgugucacguucucuugaaacgugacacguucggagaa-3’(seqidno:7)

4、编码sirna及shrna的dna分子的设计与合成

(1)以sh-1为靶点的表达shrna-1的双链dna分子(名称为usp1sh-1)的两条单链dna序列如下：

usp1-1-f:5’-ccggccagtgaccaaacaggcattactcgagttgtcacttgtatttggctgctttttg-3’(seq

idno:8)

usp1-1-r:5’-aattcaaaaaccagtgaccaaacaggcattactcgagttgtcacttgtatttggctgc-3’

(seqidno:9)。

(2)以sh-2为靶点的表达shrna-2的双链dna分子(名称为usp1sh-2)的两条单链dna序列如下：

usp1-2-f:5’-ccgggcagcccttagagatttgtttctcgagaaacaaatctctaagggctgctttttg-3’(seq

idno:10)

usp1-2-r:5’-aattcaaaaagcagcccttagagatttgtttctcgagaaacaaatctctaagggctgc-3’

(seqidno:11)。

(3)shrna-control的双链dna分子(名称为sh-control)的两条单链dna序列如下：

shrna-control-f:5’-ccggttctccgaacgtgtcacgtttcaagagaacgtgacacgttcggagaatttttg-3’(seqidno:12)

shrna-control-r:5’-aattcaaaaattctccgaacgtgtcacgttctcttgaaacgtgacacgttcggagaa-3’(seqidno:13)。

上述6条单链dna由上海吉凯基因医学科技股份有限公司合成，下划线部分分别为ageⅰ和ecorⅰ的粘性末端序列。

5、去泛素化酶usp1的rna干扰重组表达载体的构建

(1)载体酶切

配制50μl酶切体系(ageⅰ和ecorⅰ均购自neb公司，货号分别为r0552v和r0101v)，加入载体gv493纯化质粒(购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司)，置于37℃反应3h或过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，得到双酶切线性化的载体。

(2)引物退火形成双链dna

将上述步骤4互补的单链dna干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15分钟，自然冷却至室温，单链引物退火形成双链dna。

(3)退火产物与载体进行连接

通过t4dna连接酶(购自thermoscientific，货号el0016)将步骤(1)得到的双酶切线性化的载体和步骤(2)得到的双链dna连接，16℃连接1-3h或连接过夜。

(4)转化

将步骤(3)得到的10μl连接产物加入到100μltop10感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号cb104)中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μllb培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号rt501，终浓度为50μg/ml)的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。

(5)pcr鉴定

在超净工作台中，用无菌的枪头挑取单个菌落至20μl鉴定体系中(taqplusdnapolymerase，购自vazyme，货号p201-d3)，吹打混匀，置于pcr仪中进行反应。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。

通过上述过程，分别获得rna干扰重组表达载体gv493-usp1-sh-1、gv493-usp1-sh-2和gv493-sh-control。

实施例3：去泛素化酶usp1rna干扰重组表达载体慢病毒感染白血病细胞及westernblot检测重组白血病细胞中去泛素化酶usp1的表达

1、去泛素化酶usp1rna干扰重组表达载体慢病毒感染白血病细胞

(1)rna干扰重组表达载体慢病毒包装

采用目的基因gv493-usp1-sh-1、gv493-usp1-sh-2或对照序列gv493-sh-control质粒、病毒包装辅助质粒phelper1.0和phelper2.0(购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司)共转染293t细胞，转染完成后的48-72h提取上清液进行病毒收获。于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用pbs或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm、5min后，取上清按要求分装，得到目的基因gv493-usp1-sh-1、gv493-usp1-sh-2或对照序列gv493-sh-control的病毒液。

(2)感染用细胞的培养

转染前24h，用含有10％胎牛血清(fbs，购自thermofisher公司，货号10099141c)的rpmi-1640培养基(购自江苏凯基生物技术股份有限公司，货号kgm31800h-500)，在15ml培养皿、37℃和5％co2条件下培养t-all细胞系jurkat(购自国家实验细胞资源共享服务平台，货号3111c0001ccc000347)。

(3)慢病毒感染

用rpmi-1640完全培养基制备密度为5×10⁴个/ml的jurkat细胞悬液，取1ml加入6孔板中，moi为20，加入相应慢病毒(目的基因gv493-usp1-sh-1、gv493-usp1-sh-2或对照序列gv493-sh-control的病毒液)，37℃培养12小时后更换为新的rpmi-1640完全培养基，继续培养。感染96小时后，300g离心5分钟收集重组白血病细胞jurkat/gv493-usp1-sh-1、jurkat/gv493-usp1-sh-2和jurkat/gv493-sh-control进行细胞凋亡(采用annexinv细胞凋亡检测试剂盒，进行annexinv-apc单染，分别用流式细胞仪收集10000个细胞，对细胞的凋亡百分比进行t-test统计分析，观察白血病细胞系在凋亡方面的变化特点)和增殖检测(用rpmi-1640完全培养基制备密度为5×10⁴个/ml的细胞悬液，接种至96孔板，每孔5000个细胞，100μl，每种细胞三孔重复，检测5天，铺5张96孔板；每天取出一张96孔板，采用cck-8细胞增殖检测试剂盒，加入10μlcck-8试剂于每孔中，4小时后酶标仪450nm检测od值，并进行t-test分析)。结果如图2中b、c和d所示，结果表明，重组白血病细胞jurkat/gv493-usp1-sh-1、jurkat/gv493-usp1-sh-2和对照jurkat/gv493-sh-control的细胞凋亡比例分别为24％、43％和2.4％，说明rna干扰重组表达载体gv493-usp1-sh-1、gv493-usp1-sh-2能够有效降低/抑制usp1在细胞中的表达，jurkat/gv493-usp1-sh-1和jurkat/gv493-usp1-sh-2细胞凋亡比例是对照重组白血病细胞jurkat/gv493-sh-control的10倍和17.9倍，并且重组白血病细胞jurkat/gv493-usp1-sh-1、jurkat/gv493-usp1-sh-2的增殖速度显著低于对照jurkat/gv493-sh-control细胞。

2、westernblot检测重组白血病细胞中去泛素化酶usp1的表达

取慢病毒感染96小时后的三种重组白血病细胞jurkat/gv493-usp1-sh-1、jurkat/gv493-usp1-sh-2、jurkat/gv493-sh-control，按照实施例1中westernblot过程检测去泛素化酶usp1的表达。结果如图2中a所示，结果表明，含rna干扰重组表达载体的重组白血病细胞jurkat/gv493-usp1-sh-1和jurkat/gv493-usp1-sh-2中，去泛素化酶usp1表达水平均显著低于含对照载体的重组白血病细胞jurkat/gv493-sh-control。

实施例4：usp1抑制剂ml323促进t-all细胞凋亡并抑制细胞增殖

1、去泛素化酶usp1抑制剂ml323处理白血病细胞

用rmpi-1640完全培养基制备密度为10⁵个/ml的jurkat细胞悬液，取1ml加入6孔板中。然后加入ml323(购自selleck公司，货号s7529)，终浓度为1μm、10μm及50μm。对照组使用dmso，购自sigma公司，货号d2650。24h后收集细胞进行细胞凋亡和增殖检测。

2、白血病细胞的凋亡检测

300g离心5分钟收集dmso和usp1抑制剂ml323处理24h的白血病细胞jurkat，采用annexinv细胞凋亡检测试剂盒(购自ebioscience，货号88-8007-72)进行双染(annexinv-apc+7-aad)，分别用流式细胞仪收集10000个细胞，对细胞的凋亡百分比进行t-test统计分析，观察白血病细胞系在凋亡方面的变化特点。结果如图3中b和c所示，结果表明，usp1抑制剂ml323组和对照dmso组的凋亡比例分别为31.7％和1.3％，抑制剂组的细胞凋亡比例是对照组的24倍，说明usp1抑制剂ml323能够促进白血病细胞发生凋亡。

3、白血病细胞的增殖检测

按照实施例3的方法进行细胞增殖检测，结果如图3中a所示，结果表明，相对于对照dmso组，usp1抑制剂ml323可以有效抑制jurkat细胞的生长。

实施例3和4证明，去泛素化酶usp1是一个抗凋亡、促增殖的分子，在t-all细胞中具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用，抑制usp1的表达或加入其特异性抑制剂可促进肿瘤细胞——t-all白血病细胞发生凋亡，抑制细胞增殖。

实施例5：转录组测序

1、rna提取与检测

采用标准提取方法从重组白血病细胞jurkat/gv493-usp1-sh-1和对照jurkat/gv493-sh-control细胞中提取rna，随后对rna样品进行严格质控，质控标准主要包括以下3个方面：琼脂糖凝胶电泳：分析样品rna完整性及是否存在dna污染；nanophotometerspectrophotometer：检测rna纯度(od260/280及od260/230比值)；agilent2100bioanalyzer：精确检测rna完整性。

2、文库构建与质检

mrna的获取主要有两种方式：一是利用真核生物大部分mrna都带有polya尾的结构特征，通过oligo(dt)磁珠富集带有polya尾的mrna；二是从总rna中去除核糖体rna，从而得到mrna。随后在nebfragmentationbuffer中用二价阳离子将得到的mrna随机打断，按照neb普通建库方式或链特异性建库方式进行建库。

文库构建完成后，先使用qubit2.0fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/μl，随后使用agilent2100bioanalyzer对文库的insertsize进行检测，insertsize符合预期后，qrt-pcr对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2nm)，以保证文库质量。

3、上机测序

库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行illumina测序。测序的基本原理是边合成边测序(sequencingbysynthesis)。在测序的flowcell中加入四种荧光标记的dntp、dna聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dntp就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

4、数据分析

对转录组测序结果进行基因集富集分析(gsea)。

转录组测序结果如图4所示，结果表明：敲降usp1后可增强促凋亡基因的表达，抑制细胞增殖通路，这些与细胞表型实验结果(实施例3)是一致的。

序列表

<110>首都医科大学附属北京儿童医院

<120>降低usp1表达的物质在制备治疗儿童t系急性淋巴细胞白血病的药物中的应用

<130>dsp1f201584jw

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccagugaccaaacaggcauua21

<210>2

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

uaaugccuguuuggucacugg21

<210>3

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leu

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