OsFTIP7基因及其突变体在缓解金属氧化物纳米颗粒对水稻的胁迫中的应用的制作方法

本发明涉及作物生理技术领域，尤其涉及一种osftip7基因及其突变体在缓解金属氧化物纳米颗粒对水稻的胁迫中的应用。

背景技术：

随着纳米技术的迅猛发展，人们已经可以制造出不同类型、尺寸和形状的纳米材料。由于其独特的理化性质，纳米颗粒已被广泛用于日常生活的各个方面，例如电子通信、环境保护、医用药物和农业生产等。

氧化铜(cuo)纳米颗粒和氧化锌(zno)纳米颗粒等作为重要的金属氧化物nps，已在各个领域得到了应用。例如，zno纳米颗粒因其较强的吸收紫外线能力，可用于化妆品和防晒霜；zno纳米颗粒由于能够增强高聚物的韧性，因此可用于橡胶工业生产。此外，cuo纳米颗粒也已广泛用于半导体、气体传感器和农业化学品的生产中。然而，金属氧化物纳米颗粒的过度使用，例如通过农药和化肥等农业活动进入土壤环境中，会对动植物的健康造成不同程度的影响。解决金属氧化物纳米颗粒过度使用造成的污染对于保障我国粮食作物生产和安全具有重要意义。

由纳米颗粒引起的氧化应激会引起活性氧的增加，从而扰乱细胞中的氧化还原系统，并对核酸、蛋白质和脂质等细胞大分子造成氧化损伤。在一些研究中已经报道了金属氧化物纳米颗粒对植物生长的不利影响。例如：玉米植株中可以通过木质部的运输将cuo纳米颗粒从根部转运到茎上；1.0mm的cuo纳米颗粒胁迫会引起h2o2等氧化物的急剧增加，并改变水稻幼苗中抗氧化酶的活性；100mg/l的cuo纳米颗粒能够导致拟南芥根和叶中o2和h2o2的积累；此外，zno纳米颗粒可以抑制不同种类植物(如油菜、黄瓜和玉米等)根的生长；zno纳米颗粒通过增加ros积累而导致细胞死亡；土壤中800mg/kg的zno纳米颗粒可以降低玉米幼苗的叶绿素含量；zno纳米颗粒还可以导致水稻植株中抗氧化酶活性和氧化应激系统的变化；浓度为100和200μm的zno纳米颗粒可以增加小麦植株中h2o2的积累。

因此，缓解金属氧化物纳米颗粒胁迫下的生长抑制对水稻等农作物的生产至关重要。目前，关于如何解决水稻金属氧化物纳米颗粒胁迫的研究还相对较少，而涉及水稻特定基因在水稻中响应金属氧化物纳米颗粒胁迫的研究更是未见报道。

技术实现要素：

为解决和缓解金属氧化物纳米颗粒对水稻的生长抑制，本发明提供了一种osftip7基因及其突变体在缓解金属氧化物纳米颗粒对水稻的胁迫中的应用。

为实现本发明的技术目的，本发明一方面提供了一种osftip7基因及其突变体在缓解金属氧化物纳米颗粒对水稻的胁迫中的应用。

其中，所述osftip7基因在ncbi的genbank中登录号为ak058522。

为实现本发明的技术目的，本发明另一方面提供了一种通过编辑上述osftip7基因获得的水稻osftip7突变体在缓解金属氧化物纳米颗粒对水稻的胁迫中的应用。

其中，该水稻osftip7突变体是利用crispr/cas9基因编辑技术对osftip7基因进行编辑，使osftip7基因发生突变，从而获得丧失功能结构域的osftip7蛋白的水稻植株。

具体的，所述osftip7蛋白的功能结构域的描述记载在如下文献中：shiyongsong,yingchen,luliu,yenhowbenjaminsee,chuanzaomao,yinboganandhaoyu，osftip7determinesauxin-mediatedantherdehiscenceinrice，natureplants，vol4，july2018：495–504。

在本发明的一个实施例中，所述利用crispr/cas9基因编辑技术对osftip7基因进行编辑是向osftip7基因中插入单碱基a来实现的。

当然，本领域技术人员还可以利用crispr/cas9基因编辑技术向osftip7基因中插入其他能够使osftip7蛋白无法表达的碱基来获得水稻osftip7突变体。

在本发明的一个实施例中，本发明提供的水稻osftip7突变体是通过构建pcambia1300-cas9-os-osftip7载体，用bbsi酶切psgr-cas9-os载体，并与合成的sgrnaoligos连接，随后将得到的片段连入水稻pcambia1300二元载体(hindiii/ecori)，转入农杆菌后，并利用水稻品种日本晴进行遗传转化，最终获得发生位点突变的突变体。

优选地，所述金属氧化物纳米颗粒为cu和zn的氧化物纳米颗粒中的至少一种。

优选地，所述金属氧化物纳米颗粒为cuo或zno。

优选地，所述水稻以土培形式进行培养。

优选地，cuo浓度为0.1-1g/kg，例如，0.1、0.5和1g/kg。

优选地，zno浓度为0.1-1g/kg，例如，0.1、0.5和1g/kg

优选地，通过以下方式中的至少一种来缓解金属氧化物纳米颗粒对水稻的胁迫：

(1)提高金属氧化物纳米颗粒胁迫下水稻的株高和干重；

(2)提高金属氧化物纳米颗粒胁迫下水稻叶片中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量；

(3)降低金属氧化物纳米颗粒胁迫下水稻叶片中双氧水(h2o2)、丙二醛(mda)和脯氨酸(pro)的含量；

(4)增加金属氧化物纳米颗粒胁迫下水稻叶片中过氧化氢酶(cat)、过氧化物酶(pod)和过氧化物歧化酶(sod)的含量；

(5)提高金属氧化物纳米颗粒胁迫下水稻叶片中生长素的含量和生长素合成及响应相关基因的表达量。

本发明所述的水稻或水稻植株可以为幼苗期的水稻，也可以为非幼苗期的水稻。

优选地，所述生长素合成及响应相关基因为osyucca1、osyucca4、osyucca6、osyucca8、osiaa10、osiaa13、osiaa14和osiaa20中的一种。

有益效果：

本发明提供的osftip7突变体具有促进金属氧化物纳米颗粒胁迫下水稻的生长，缓解金属氧化物纳米颗粒对水稻的毒害的作用，如提高金属氧化物纳米颗粒胁迫下水稻叶绿素的合成、增加其株高和干重，改善金属氧化物纳米颗粒诱导的氧化应激等等。

附图说明

图1为本申请所用osftip7突变体的突变位点示意图；

图2为本发明试验例1提供的互补系水稻材料、野生型水稻以及实施例2获得的水稻突变体材料在cuonps或znonps胁迫下进行种植；

图3为金属氧化物纳米颗粒胁迫对野生型和osftip7突变体的表型、株高和干重的影响；其中，a为生长示意图；b和c分别为cuo和zno纳米颗粒胁迫下的株高和干重；

图4为金属氧化物纳米颗粒胁迫对野生型和osftip7突变体的叶绿素a，叶绿素b和总叶绿素含量的影响；其中，a和b和分别为cuo和zno纳米颗粒胁迫下的叶绿素a含量、叶绿素b含量和总叶绿素含量；

图5为金属氧化物纳米颗粒胁迫对野生型和osftip7突变体的h2o2、mda和pro含量的影响；其中，a和b分别为cuo和zno纳米颗粒胁迫下的双氧水含量、mda含量和脯氨酸含量；

图6为金属氧化物纳米颗粒胁迫对野生型和osftip7突变体的cat、pod和sod活性的影响；其中，a和b分别为cuo和zno纳米颗粒胁迫下的cat活性、pod活性和sod活性；

图7为金属氧化物纳米颗粒胁迫对野生型和osftip7突变体的生长素含量和生长素合成及响应相关基因表达量的影响；其中，a和b为cuo和zno纳米颗粒胁迫下的生长素含量；c为生长素合成基因(osyucca1、osyucca4、osyucca6和osyucca8)表达量；d为生长素响应相关基因(osiaa10、osiaa13、osiaa14和osiaa20)表达量。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

需要说明的是，本发明使用的突变体osftip7材料为已知材料，并记载于如下文献中：shiyongsong,yingchen,luliu,yenhowbenjaminsee,chuanzaomao,yinboganandhaoyu，osftip7determinesauxin-mediatedantherdehiscenceinrice，natureplants，vol4，july2018：495–504。

实施例1osftip7基因的来源

本申请关于osftip7基因的描述、来源和功能记载在上述文献中，根据该文献的描述可知，osftip7基因是通过以下方式获得：在ncbi中同源比对拟南芥中的ftip1(at5g0685)基因在水稻中的同源基因，发现一个包含与ftip1的mctp结构域高度同源的基因(os05g0370600)，并将其命名为osftip7，其中包含三个c2域和一个磷酸核糖基转移酶c末端域(prt_c)。

当然，本领域技术人员还可以直接根据登录号(osftip7基因在ncbi的genbank中登录号为ak058522)进行人工合成获得。

实施例2osftip7突变体的获得

本发明所使用的突变体osftip7材料的描述、来源和功能记载在上述文献中，根据该文献的描述可知，该突变体是应用crispr/cas9基因编辑技术获得，具体是：首先根据获得的osftip7基因构建pcambia1300-cas9-os-osftip7载体，用bbsi酶切psgr-cas9-os载体，并与合成的sgrnaoligos连接，随后将得到的片段连入水稻pcambia1300二元载体(hindiii/ecori)，转入农杆菌后，并利用水稻品种日本晴进行遗传转化，最终获得突变位点如图1所示的突变体，上述方法和所用试剂均为本技术领域常规方法和试剂，例如上述文献所记载的方法和试剂。

试验例1互补试验

为了验证osftip7基因对金属氧化物纳米颗粒的耐受表型，归因于osftip7基因的功能丧失，我们创制了一个水稻互补系材料osftip73flag-gosftip7，该互补系材料是通过首先构建phgw-3flag-gosftip7载体，转入农杆菌后，并利用osftip7突变材料进行遗传转化，获得水稻互补系材料osftip73flag-gosftip7。

将上述获得的水稻互补系材料、野生型水稻以及实施例2获得的水稻突变体材料的种子种植在cuonps或znonps为1g/kg浓度水平的土壤中，处理35天后，收集水稻互补系材料、野生型水稻材料以及水稻突变体材料的株高和干生物量数据(即整个幼苗重量)，数据结果如图2所示，根据图2所示的的结果可知，与互补系和野生型植物相比，osftip7突变材料均具有较高的株高和干生物量，可见osftip7基因的功能丧失导致nps胁迫处理下osftip7的耐受性增强。

试验例2金属氧化物纳米颗粒的胁迫试验

1、试验材料及处理

选择大小一致，籽粒饱满的水稻种子(所用水稻品种为oryzasatival.ssp.japonicacv.nipponbare(日本晴，野生型)和以日本晴为背景的osftip7突变体)，用2％次氯酸钠溶液消毒处理15min，随后用蒸馏水冲洗5次，然后在37℃下用蒸馏水浸种2天。于30℃人工培养箱发芽4天后，将水稻种子移植到不同的盆中，并放置于自动控制生长室中培养。该生长室设置为光照14小时(30±2℃)，黑暗10小时(26±2℃)，相对湿度40％-60％。土壤是从浙江之豇种业有限公司农场取样。土壤干燥后，过2mm筛，根据我们前期的浓度选择，将不同重量的金属氧化物纳米颗粒与土壤充分混合，以达到0.1、0.5和1g/kg的最终浓度，无金属氧化物纳米颗粒的土壤培养用作对照，每组设6个重复。处理35天后，收集水稻幼苗进行表型、生理生化和分子分析。

2、试验方法

2.1、表型特征的测量

对35天的水稻幼苗进行采样，用无菌水彻底清洗后，测定水稻幼苗的表型特征，包括株高和干重，六次重复。将幼苗在105℃的烘箱中干燥2小时，然后在60℃继续烘干约48小时直到达到恒定重量，测定此时的整个幼苗重量为干生物量。

2.2、叶绿素含量的测定

取100mg新鲜叶片，用液氮研磨后，加入5ml80％丙酮。在黑暗中温育1小时后，将混合物以12,000×g离心3分钟。吸取上清液，用分光光度法在645和663nm处测量吸光度，用80％丙酮作为空白对照。

叶绿素a含量(μg/ml)＝12.7(a663)-2.69(a645)；

叶绿素b含量(μg/ml)＝22.9(a645)-4.68(a663)；

总叶绿素含量(μg/ml)＝20.21(a645)+8.02(a663)。

2.3、双氧水含量的测量

根据zhang等(2014)的方法，使用过氧化氢测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)进行双氧水(h2o2)测量。将约10mg植株叶片在液氮中粉碎，并加入500μl裂解物，4℃条件下以8,000×g离心10分钟。吸取125μl上清液与等量的过氧化氢检测试剂混合，并在室温下温育5分钟，然后用分光光度法在415nm处测量吸光度，并从标准曲线计算过氧化氢浓度。

2.4、mda含量的测量

根据tang等(2013)的方法，测定丙二醛(mda)含量。将大约100mg植株叶片在液氮中粉碎，并加入10ml10％的三氯乙酸。将匀浆以10,000×g离心20分钟。取2ml上清液，加入等量的tba，混合后，95℃加热30分钟，在冰上快速冷却，然后再以10,000×g离心20分钟。然后用分光光度法在450,532和600nm处测定吸光度。

2.5、脯氨酸含量的测量

将约1g的干燥植株叶片在液氮中粉碎，并加入2％磺基水杨酸水溶液(约10ml)。将混合物在室温下以200×g温育1小时。然后将样品以12,000×g离心15分钟，并通过0.22μmmillex-lg膜(waters，usa)，取2ml上清液，通过全自动氨基酸分析仪l-8900(hitachi，japan)测定pro含量。

2.6、抗氧化酶活性的测量

cat采用aebi等(1984)的方法，pod采用hossain等(2010)的方法和sod采用zhang等(2008)的方法，使用cat，pod和sod测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)测量抗氧化酶的活性。

2.7、生长素含量的测量

根据song等(2018)的方法提取叶片中生长素(iaa)。使用商业化酶联免疫吸附测定试剂盒(晶美生物技术有限公司)测量iaa的含量。

2.8、基因表达分析

使用rneasyplantrnaminikit(qiagen，hilden，germany)从植株叶片中提取总rna，并使用1μg总rna，oligo-dt18引物和goscripttm逆转录系统(promega)逆转录cdna。使用sybrgreengotaqqpcrmastermix(promega，wi，usa)进行定量实时聚合酶链反应(qrt-pcr)。水稻actin基因用作内部对照，并使用2^-δδct法计算相对表达水平。

表1定量实时聚合酶链反应(qrt-pcr)引物表

2.9、数据处理

所有统计分析采用单因素方差分析，各处理间的显著性差异小于5％。

3、试验结果

3.1、osftip7突变体对金属氧化物纳米颗粒胁迫的生理响应

从图3中可以看出：在较高浓度(0.5和1g/kg)的金属氧化物纳米颗粒胁迫下，野生型水稻植株的株高和干重明显降低，而金属氧化物纳米颗粒胁迫对osftip7突变体株高和干重没有明显影响。1g/kgcuo纳米颗粒胁迫的野生型水稻植物的株高和干重为不含cuo纳米颗粒胁迫样品的72.1％和80.4％(图3b)。同样，与不含zno金属氧化物纳米颗粒胁迫样品相比，经过1g/kgzno纳米颗粒胁迫后，野生型的株高和干重分别降低了36.6％和19.2％(图3c)。而不同浓度的金属氧化物纳米颗粒胁迫后，osftip7突变体的株高和干重没有显着变化(图3b和3c)。

与不含cuo纳米颗粒胁迫的样品相比，用1g/kgcuo纳米颗粒处理的野生型中的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别为其71.5％、47.9％和59.3％(图4a)。同样，与不含zno纳米颗粒胁迫的样品相比，1g/kgzno纳米颗粒胁迫使野生型中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量的野生型含量分别下降28.6％、48.9％和39.1％(图4b)。然而经过不同浓度的金属氧化物纳米颗粒胁迫处理后，osftip7突变体的叶绿素含量均没有明显变化(图4)。

3.2、金属氧化物纳米颗粒胁迫下，osftip7突变体抗氧化系统的变化

从图5和图6中可以看出：首先，金属氧化物纳米颗粒胁迫改变了两组材料中的h2o2、mda和pro含量(图5)。在较高的金属氧化物纳米颗粒胁迫下，发现osftip7突变体中的这些含量明显低于野生型水稻植物(图5)。cuo纳米颗粒胁迫下，除了0.1g/kg的浓度外，其他浓度都使得野生型和突变体中h2o2、mda和pro含量上升(图5a)。而在高剂量(0.5和1g/kg)cuo纳米颗粒胁迫下，野生型叶片中h2o2、mda和pro含量均显著高于突变体(图5a)。0.1和0.5g/kg的zno纳米颗粒胁迫下，在野生型和突变体叶片中未检测到显着变化；1g/kgzno纳米颗粒胁迫下，突变体的h2o2、mda和pro积累量分别比野生型降低了12.9％、26.2％和16.8％(图5b)。

其次，cuo和zno纳米颗粒胁迫均改变了野生型和突变体中cat、pod和sod的活性(图6)。在较高浓度(0.5和1g/kg)的cuo和zno纳米颗粒胁迫下，osftip7突变体中的抗氧化酶活性明显高于野生型水稻。1g/kgcuo纳米颗粒胁迫下，突变体叶片中的cat、pod和sod酶活分别比野生型高1.28、1.38和1.63倍(图6a)。与h2o2、mda和pro的含量不同，与osftip7突变体相比，0.5g/kgzno纳米颗粒胁迫的野生型植株叶片中cat、pod和sod的活性分别降低了35.1％、35.0％和16.5％。而在1g/kgzno纳米颗粒胁迫后，野生型的cat、pod和sod活性分别比突变体降低了49.0％、32.8％和37.7％(图6b)。这些结果表明，osftip7突变体缓解了氧化应激，降低了ros水平，减少了与胁迫相关的游离氨基酸的积累，并诱导了金属氧化物胁迫下水稻的抗氧化酶活性。

3.3、金属氧化物纳米颗粒胁迫下，osftip7突变体中生长素的生物合成和响应变化

从图7中可以看出：用cuo和zno纳米颗粒胁迫处理后，在突变体和野生型植株叶片中，所有浓度下生长素含量均出现上升的趋势(图7a和7b)。不同浓度水平的cuo和zno纳米颗粒胁迫处理后，突变体植株叶片中生长素含量均显着大于野生型(图7a和7b)。用1g/kgcuo和zno纳米颗粒胁迫的osftip7突变体的生长素含量分别比野生型水稻植物高1.98倍和1.81倍(图7a和7b)。

金属氧化物纳米颗粒胁迫下，突变体叶片中osyucca1、osyucca4、osyucca6和osyucca8的转录表达量显著上调，它们的转录表达量比野生型增加了1.50-2.38倍(cuo纳米颗粒)和1.51-2.54倍(zno纳米颗粒)(图7c)。与生长素生物合成基因的表达相似，在osftip7突变体中生长素应答基因(osiaa10、osiaa13、osiaa14和osiaa20)表达量也显著高于野生型(图7d)。我们的结果证实，在金属氧化物纳米颗粒胁迫下，水稻叶片中生长素的生物合成和响应基因的表达受到抑制，而在osftip7突变体中这些基因被显著诱导。

总之，本发明通过在含有0、0.1、0.5和1g/kg金属氧化物纳米颗粒的土壤中，对水稻oryzasatival.ssp.japonicacv.nipponbare(日本晴，野生型)和以日本晴为背景的osftip7突变体进行为期35天的土培处理，发现：osftip7突变体不仅显著缓解了金属氧化物纳米颗粒胁迫对水稻生长的抑制作用；还提高了金属氧化物纳米颗粒胁迫下叶绿素的株高、干重和叶绿素生物合成；显著改善了金属氧化物纳米颗粒诱导的氧化应激，降低了h2o2、mda和pro的含量，增加了cat、pod和sod的活性。本发明还进一步证明了osftip7突变体提高金属氧化物纳米颗粒胁迫下水稻叶片中生长素的含量和生长素合成(osyucca1、osyucca4、osyucca6和osyucca8)及响应相关基因(osiaa10、osiaa13、osiaa14和osiaa20)的表达量。

本发明的内容不限于具体实施例所举例，本领域技术人员通过阅读本说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。