一种表达免疫调控因子的CAR-T细胞及其应用的制作方法

本发明属于生物医药
技术领域：
，涉及一种表达免疫调控因子的car-t细胞及其应用。
背景技术：
：嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)是将识别肿瘤抗原的单链抗体与诱导t细胞活化的信号转导区融合而得到的嵌合型蛋白。向t细胞中导入编码car的基因，使得car-t细胞在膜上表达特异性识别并结合肿瘤抗原的car分子，诱导t细胞活化，以不依赖于主要组织相容性基因复合体的方式实现对肿瘤细胞的特异性杀伤。目前，car-t疗法在白血病、淋巴瘤等造血系统恶性肿瘤中取得了巨大突破，但是，在实体瘤的治疗上仍然没有比较好的效果。科研人员通过对car-t疗法进行改进和优化，提高car-t对实体瘤的治疗效果。cn109504660a公开了一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用，所述car包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区、细胞因子信号区，其中，胞膜外抗原结合区以nectin-4抗原的两个空间表位为靶点，细胞因子信号区为il7和ccl19，但是存在外源il-7蛋白无法分泌到t细胞外、ccl19的持续性分泌无法最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部的问题。因此，构建一种新型car-t细胞，不仅能转录翻译外源il-7蛋白还能将il-7分泌到t细胞外，而且能避免副反应、提高治疗安全性，在肿瘤的治疗领域具有重要意义。技术实现要素：针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种表达免疫调控因子的car-t细胞及其应用，所述嵌合抗原受体t细胞能够将il-7持续性分泌到胞外，在识别肿瘤抗原后表达分泌ccl19，显著提高了car-t细胞的抗肿瘤效果，同时规避了由于持续性分泌ccl19导致非肿瘤组织环境过多募集免疫细胞可能引起的炎症副反应。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种表达免疫调控因子的car-t细胞，所述car-t细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、分泌性il-7和条件性ccl19；所述il-7的信号肽为ifn-γ信号肽；所述ccl19的启动子为nfat调控启动子。本发明中，将il-7信号肽替换为t细胞分泌蛋白ifn-γ的信号肽，采用nfat调控型启动子作为ccl19编码基因的启动子，实现了car-t细胞对il-7的分泌性表达和对ccl19的条件性表达。优选地，所述ifn-γ信号肽包括seqidno:1所示的氨基酸序列；seqidno:1：mkytsyilafqlcivlgslg。优选地，所述il-7包括seqidno:2所示的氨基酸序列；seqidno:2：dcdiegkdgkqyesvlmvsidqlldsmkeigsnclnnefnffkrhicdankegmflfraarklrqflkmnstgdfdlhllkvsegttillnctgqvkgrkpaalgeaqptksleenkslkeqkklndlcflkrllqeiktcwnkilmgtkeh。优选地，所述ccl19包括seqidno:3所示的氨基酸序列；seqidno:3：malllalsllvlwtspaptlsgtndaedcclsvtqkpipgyivrnfhyllikdgcrvpavvfttlrgrqlcappdqpwveriiqrlqrtsakmkrrss。优选地，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。优选地，所述信号肽包括cd8α信号肽。优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括cd19、cd20、cd22、cd30、cea、egfr、braf、her-2、mesothelin、muc1、psca、gpc3、tert、pten、pd-1、pd-l1或vegf中的任意一种，优选为cd19、muc1、gpc3、mesothelin、psca或her2中的任意一种，进一步优选为gpc3。优选地，所述抗原结合结构域为靶向gpc3的单链抗体。优选地，所述跨膜结构域包括cd28跨膜结构域和/或cd8α跨膜结构域，优选为cd8α跨膜结构域。优选地，所述信号传导结构域包括cd28胞内结构域、cd3ζ、tlr2、4-1bb、tlr1、cd27、ox40或dap10中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1bb和cd3ζ的组合。优选地，所述嵌合抗原受体由cd8α信号肽、抗gpc3单链抗体、cd8α跨膜结构域、4-1bb和cd3ζ串联组成。优选地，所述嵌合抗原受体包括seqidno:4所示的氨基酸序列；seqidno:4：malpvtalllplalllhaarpdvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqnthvpptfgsgtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgasvklsckasgytftdyemhwvkqtpvhglkwigaldpktgdtaysqkfkgkatltadkssstaymelrsltsedsavyyctrfysytywgqgtlvtvsatttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。第二方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括ifn-γ信号肽编码基因、il-7编码基因、nfat调控启动子和ccl19编码基因。优选地，所述ifn-γ信号肽编码基因包括seqidno:5所示的核酸序列；seqidno:5：atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggc。优选地，所述il-7编码基因包括seqidno:6所示的核酸序列；seqidno:6：gattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacac。优选地，所述nfat调控启动子5×nfat-re-il-2包括seqidno:7所示的核酸序列；seqidno:7：gagagtagggaagagagtagggaagagagtagggaagagagtagggaagagagtagggaaagatctagactctagagggtatataatggaagctcgaattccagcttggcattccggtactgttggtaaaaagcttggcaatccggtactgttggtaaagccacc。优选地，所述ccl19编码基因包括seqidno:8所示的核酸序列；seqidno:8：atggccctgctactggccctcagcctgctggttctctggacttccccagccccaactctgagtggcaccaatgatgctgaagactgctgcctgtctgtgacccagaaacccatccctgggtacatcgtgaggaacttccactaccttctcatcaaggatggctgcagggtgcctgctgtagtgttcaccacactgaggggccgccagctctgtgcacccccagaccagccctgggtagaacgcatcatccagagactgcagaggacctcagccaagatgaagcgccgcagcagt。第三方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用第二方面所述的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的car-t细胞的制备方法，所述方法包括将第二方面所述的慢病毒载体或第三方面所述的重组慢病毒导入表达car分子的t细胞的步骤。第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的car-t细胞。优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。第六方面，本发明提供了第一方面所述的car-t细胞、第二方面所述的慢病毒载体、第三方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的药物组合物在制备实体瘤治疗药物中的应用。优选地，所述实体瘤包括肝癌、头颈癌、黑色素瘤、膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、直肠癌、肛区癌、胆管癌、子宫癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、结直肠癌、乳腺癌或成神经管细胞瘤中的任意一种或至少两种的组合。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明将il-7信号肽替换为t细胞分泌蛋白ifn-γ的信号肽，使得il-7可以分泌到t细胞外，充分发挥il-7对t细胞增殖的促进作用；(2)本发明采用nfat调控型启动子5×nfat-re-il-2作为ccl19的启动子，使得car-t细胞条件性表达ccl19，免疫细胞最大程度招募到肿瘤内部，提高了car-t细胞的抗肿瘤效率；(3)本发明构建的表达分泌型il-7和调控型ccl19的car-t细胞具有显著增强的肿瘤抑制作用，在实体瘤治疗领域具有重要意义。附图说明图1为不同car-t细胞分泌il-7和ccl19的结果；图2为不同car-t细胞连续6天的增殖结果；图3为不同car-t细胞对t细胞的招募能力。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1慢病毒载体的制备全基因合成以下核酸分子：①由cd8α信号肽、抗gpc3单链抗体、cd8α跨膜结构域、4-1bb和cd3ζ的核酸序列串联形成的car分子(氨基酸序列如seqidno:4所示)；②由il-7信号肽(seqidno:9)和il-7(不含il-7信号肽)(seqidno:6)、2a肽(seqidno:10)和ccl19(seqidno:8)的核酸序列串联形成的核酸分子；③由ifn-γ信号肽(seqidno:5)和il-7(不含il-7信号肽)(seqidno:6)的核酸序列串联形成的分泌型il-7分子；④由5×nfat-re-il-2启动子(seqidno:7)和ccl19(seqidno:8)串联形成的条件性ccl19分子；seqidno:9：atgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatct；seqidno:10：aaaattgtcgctcctgtcaaacaaactcttaactttgatttactcaaactggctggggatgtagaaagcaatccaggtcca。将合成的car分子克隆至慢病毒表达载体pwpxld-egfp中；将合成的il-7信号肽、il-7(不含il-7信号肽)、2a肽和ccl19的核酸序列串联形成的核酸分子克隆至pwpxld-tcd19中；将合成的ifn-γ信号肽和il-7(不含il-7信号肽)的核酸序列串联形成的分泌性il-7分子克隆至pwpxld-tcd19中，随后将合成的5×nfat-re-il-2启动子和ccl19串联形成的条件性ccl19分子以相反的方向克隆至pwpxld-tcd19的末端。实施例2重组慢病毒包装本实施例采用293t细胞制备重组慢病毒，当293t细胞铺100mm培养皿板底达80～90％时，进行慢病毒包装：在10cm培养皿中培养293t细胞，培养基为dmem高糖培养基+10％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)；待培养皿中的293t细胞密度达80％时，更换培养基为dmem高糖培养基+1％fbs+1％双抗；配制如表1所示的质粒混合液，pwpxld-表达质粒包括表达car分子的慢病毒载体，表达完整il-7和ccl19的慢病毒载体，或表达分泌性il-7和条件性ccl19的慢病毒载体；表1试剂剂量pwpxld-表达质粒4.5μgpmd2.g1.5μgpspax26μg取500μlopti-dmem至15ml离心管中，加入7.2μl浓度为10μg/μl的pei(线性聚乙烯亚胺)，轻微混匀后，静置5min；将表1所示的质粒混合液与pei混合，吹打混匀，室温静置25～30min；将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293t细胞上；培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的dmem，加入量为7ml/100mm培养皿；包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293t细胞补加培养基，加入量为7ml/100mm培养皿；在2500g下离心0.5小时，将上清用0.45μm过滤器过滤，分别得到表达car的重组慢病毒、表达完整il-7和ccl19的重组慢病毒、表达分泌性il-7和条件性ccl19的重组慢病毒，4℃保存待用。实施例3表达il-7和ccl19的car-t细胞的制备(1)采用ficoll密度梯度离心试剂盒(ge公司)从全血中分离外周血单个核细胞(pbmc)，去除红细胞后，再利用macspan-t磁珠分选出t细胞；分选出来的t细胞采用培养基(aim-v培养基+5％fbs+青霉素100u/ml+链霉素0.1mg/ml)稀释至细胞浓度为2.5×106个/ml待用；(2)向每毫升细胞悬液中加入10μl美天旎transactt细胞试剂，激活48小时后更换为新鲜培养基(imdm培养基+5％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)+il-2)；(3)将3×107个激活的t细胞在300g下离心5min，用3ml培养基重悬(imdm培养基+5％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；(4)将3mlt细胞悬液接种在6孔板中，每孔1ml；(5)分别加入以下重组慢病毒组合到6孔板中，每孔9ml；①表达car的重组慢病毒上清；②等量的表达car的重组慢病毒上清、表达完整il-7的重组慢病毒上清和表达ccl19的重组慢病毒上清；③等量的表达car的重组慢病毒上清、表达分泌型il-7的重组慢病毒上清和表达调控型ccl19的重组慢病毒上清；(6)取10μlpolybrene加入到每孔中；(7)培养8h后更换新鲜培养基(imdm培养基+10％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))1ml，重复步骤(4)和(5)；(8)5h后撤去病毒，更换新鲜的培养基4ml(imdm培养基+10％fbs(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；(9)48小时后更换新鲜培养基，调整细胞密度继续培养10天，得到表达car的car-t细胞(gpc3car-t)，表达car、il-7和ccl19的car-t细胞(gpc3-7×19car-t)，和表达car、分泌性il-7和条件性ccl19的car-t细胞(gpc3-secil7×il2pro-ccl19car-t)，保存进行后续实验。实施例4car-t细胞对il-7和ccl19的分泌取实施例3制备的三种car-t细胞各2×106个，用新鲜的t细胞培养基培养24小时，收集细胞上清；同时取2×106个gpc3-secil7×il2pro-ccl19car-t，与等量的表达gpc3肿瘤抗原的hepg2肿瘤细胞共培养24h，收集细胞上清；采用elisa试剂盒(r&dsystem)检测每种细胞对il-7和ccl19的分泌情况。如图1所示，gpc3car-t细胞的培养上清中无il-7和ccl19，gpc3-7×19car-t细胞的培养上清中只有ccl19、没有il-7，gpc3-secil7×il2pro-ccl19car-t细胞的培养上清中只有il-7、没有ccl19，与hepg2肿瘤细胞共培养后，其培养上清中能同时检测到il-7和ccl19。实施例5car-t细胞的体外增殖实验取实施例3制备的三种car-t细胞各2×106个，用新鲜的t细胞培养基培养，每两天进行计数，连续培养6天，分析car-t细胞的增殖情况。结果图2所示，gpc3-7×19car-t由于不分泌il-7，对car-t细胞没有促进增殖的作用；gpc3-secil7×il2pro-ccl19car-t表达的il-7可以顺利分泌到胞外，显著促进了car-t细胞的增殖。实施例6car-t细胞的体外迁移实验取实施例3制备的三种car-t细胞各2×106个，于transwell装置下层培养24h，同时取等量的gpc3-secil7×il2pro-ccl19car-t和hepg2于下层共培养24h，取cfse标记的野生t细胞于上层培养5h，用流式细胞仪检测下层细胞中cfse标记的t细胞的数量。统计结果如图3所示，与gpc3car-t相比，gpc3-7×19car-t可以招募到更多的t细胞，gpc3-secil7×il2pro-ccl19car-t在被肿瘤抗原激活后也招募到了更多的t细胞，说明条件性表达ccl19的gpc3-secil7×il2pro-ccl19car-t只有在识别肿瘤细胞后才会分泌ccl19，发挥招募作用，确保了其在非肿瘤组织中的安全性。综上所述，本发明的gpc3-secil7×il2pro-ccl19car-t细胞能够将il-7持续性分泌到胞外，在识别肿瘤抗原后表达分泌ccl19，显著提高了car-t的增殖能力和肿瘤细胞杀伤效率，治疗过程中炎症副反应低，在实体瘤治疗领域具有重要意义。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>广东昭泰体内生物医药科技有限公司<120>一种表达免疫调控因子的car-t细胞及其应用<130>202009<160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>prt<213>人工序列<400>1metlystyrthrsertyrileleualapheglnleucysilevalleu151015glyserleugly20<210>2<211>152<212>prt<213>人工序列<400>2aspcysaspilegluglylysaspglylysglntyrgluservalleu151015metvalserileaspglnleuleuaspsermetlysgluileglyser202530asncysleuasnasnglupheasnphephelysarghisilecysasp354045alaasnlysgluglymetpheleupheargalaalaarglysleuarg505560glnpheleulysmetasnserthrglyasppheaspleuhisleuleu65707580lysvalsergluglythrthrileleuleuasncysthrglyglnval859095lysglyarglysproalaalaleuglyglualaglnprothrlysser100105110leuglugluasnlysserleulysgluglnlyslysleuasnaspleu115120125cyspheleulysargleuleuglngluilelysthrcystrpasnlys130135140ileleumetglythrlysgluhis145150<210>3<211>98<212>prt<213>人工序列<400>3metalaleuleuleualaleuserleuleuvalleutrpthrserpro151015alaprothrleuserglythrasnaspalagluaspcyscysleuser202530valthrglnlysproileproglytyrilevalargasnphehistyr354045leuleuilelysaspglycysargvalproalavalvalphethrthr505560leuargglyargglnleucysalaproproaspglnprotrpvalglu65707580argileileglnargleuglnargthrseralalysmetlysargarg859095serser<210>4<211>486<212>prt<213>人工序列<400>4metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu151015hisalaalaargproaspvalvalmetthrglnthrproleuserleu202530provalserleuglyaspglnalaserilesercysargsersergln354045serleuvalhisserasnglyasnthrtyrleuhistrptyrleugln505560lysproglyglnserprolysleuleuiletyrlysvalserasnarg65707580pheserglyvalproaspargpheserglyserglyserglythrasp859095phethrleulysileserargvalglualagluaspleuglyvaltyr100105110phecysserglnasnthrhisvalproprothrpheglyserglythr115120125lysleugluilelysglyglyglyglyserglyglyglyglysergly130135140glyglyglyserglnvalglnleuglnglnserglyalagluleuval145150155160argproglyalaservallysleusercyslysalaserglytyrthr165170175phethrasptyrglumethistrpvallysglnthrprovalhisgly180185190leulystrpileglyalaleuaspprolysthrglyaspthralatyr195200205serglnlysphelysglylysalathrleuthralaasplysserser210215220serthralatyrmetgluleuargserleuthrsergluaspserala225230235240valtyrtyrcysthrargphetyrsertyrthrtyrtrpglyglngly245250255thrleuvalthrvalseralathrthrthrproalaproargpropro260265270thrproalaprothrilealaserglnproleuserleuargproglu275280285alacysargproalaalaglyglyalavalhisthrargglyleuasp290295300phealacysaspiletyriletrpalaproleualaglythrcysgly305310315320valleuleuleuserleuvalilethrleutyrcyslysargglyarg325330335lyslysleuleutyrilephelysglnprophemetargprovalgln340345350thrthrglnglugluaspglycyssercysargpheproglugluglu355360365gluglyglycysgluleuargvallyspheserargseralaaspala370375380proalatyrglnglnglyglnasnglnleutyrasngluleuasnleu385390395400glyargarggluglutyraspvalleuasplysargargglyargasp405410415proglumetglyglylysproargarglysasnproglngluglyleu420425430tyrasngluleuglnlysasplysmetalaglualatyrsergluile435440445glymetlysglygluargargargglylysglyhisaspglyleutyr450455460glnglyleuserthralathrlysaspthrtyraspalaleuhismet465470475480glnalaleuproproarg485<210>5<211>60<212>dna<213>人工序列<400>5atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggc60<210>6<211>456<212>dna<213>人工序列<400>6gattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatc60gatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaac120ttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgct180cgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttatta240aaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaa300ccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaag360gaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaact420tgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacac456<210>7<211>165<212>dna<213>人工序列<400>7gagagtagggaagagagtagggaagagagtagggaagagagtagggaagagagtagggaa60agatctagactctagagggtatataatggaagctcgaattccagcttggcattccggtac120tgttggtaaaaagcttggcaatccggtactgttggtaaagccacc165<210>8<211>294<212>dna<213>人工序列<400>8atggccctgctactggccctcagcctgctggttctctggacttccccagccccaactctg60agtggcaccaatgatgctgaagactgctgcctgtctgtgacccagaaacccatccctggg120tacatcgtgaggaacttccactaccttctcatcaaggatggctgcagggtgcctgctgta180gtgttcaccacactgaggggccgccagctctgtgcacccccagaccagccctgggtagaa240cgcatcatccagagactgcagaggacctcagccaagatgaagcgccgcagcagt294<210>9<211>75<212>dna<213>人工序列<400>9atgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttg60ccagtagcatcatct75<210>10<211>81<212>dna<213>人工序列<400>10aaaattgtcgctcctgtcaaacaaactcttaactttgatttactcaaactggctggggat60gtagaaagcaatccaggtcca81当前第1页12