本发明涉及分离纯化技术领域，尤其涉及一种甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料及其应用。
背景技术：
甜叶菊(steviarebaudianabertoni)又称甜草、甜菊等，原产于巴拉圭、巴西等国家，其叶含有甜菊糖苷，甜菊糖苷是一种高甜度、低热量的新型天然甜味剂，主要是从菊科植物甜叶菊的叶子中提取的几种甜叶菊糖苷的混合物，主要成分是rebaudiosidea(ra)—莱鲍迪苷a。由于来自甜叶菊的甜菊糖苷类化合物因其甜度高、热量低、无毒性、耐高温、耐酸碱和水溶性好等优点，因此受到了科学界、产业界等多个领域的广泛重视，其中含量相对丰富的莱鲍迪苷a(甜菊糖苷ra)、甜菊糖等已广泛应用于饮料、食品、调味剂、酒类、乳制品等食品加工领域。
随着甜菊糖苷的需求不断扩大，提高甜菊糖苷的产量越来越显得重要，特别是能提高甜菊糖苷ra的产量。目前工业规模高纯ra生产，需经过甜菊糖苷提取、提取液除杂脱色、ra重结晶分离纯化等多步工艺，才可得到纯度不低于90％的ra产品。由于多步工艺存在耗时较长、有机溶剂污染等问题，造成了现有分离纯化技术的选择性不强，操作步骤多，耗时费力等问题。
分子印迹技术是一种对于目标分子具有特异性识别的技术，对于目标分子它具有选择性分离和提取的能力而越来受到广大关注。现有技术中虽然公开有分子印迹聚合物来对甜菊糖苷ra进行识别并吸附选择，但由于甜叶菊中含有多种与莱鲍迪苷a结构相近的类化合物，其对莱鲍迪苷a的识别能力和吸附选择性还有待加强。
技术实现要素：
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料及应用，该分子印迹材料对甜菊糖苷ra这一特定组分具有优异的特异选择性，因此可以获得高效的分离纯化效率。
本发明提出的一种甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料，该分子印迹材料是采用下述方法制备得到：
将含乙烯基的硅烷偶联剂与氧化石墨烯进行表面修饰反应，得到乙烯基功能化的氧化石墨烯；将乙烯基功能化的氧化石墨烯与模板分子甜菊糖苷ra、4-乙烯基吡啶、4-乙烯基苯硼酸以及乙二醇二甲基丙烯酸酯在乙腈中进行聚合反应后，再脱除模板分子，即得到所述甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料。
优选地，所述含乙烯基的硅烷偶联剂为3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷。
优选地，所述含乙烯基的硅烷偶联剂与氧化石墨烯的质量体积比为1g:0.1-1ml。
优选地，所述乙烯基功能化的氧化石墨烯具体是通过将氧化石墨烯与3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷分散于乙醇中，再在60-80℃下反应2-6h得到。
优选地，所述乙烯基功能化的氧化石墨烯与模板分子甜菊糖苷ra、4-乙烯基吡啶、4-乙烯基苯硼酸以及乙二醇二甲基丙烯酸酯的用量比为3-7g:1g:6-9g:1-3g:33-48g；
所述乙烯基功能化的氧化石墨烯与乙腈的质量体积比为1g:120-220ml。
优选地，所述聚合反应的引发剂包括溴化铜、n，n，n'，n'，n”-五甲基二亚乙基三胺以及偶氮二异丁腈；
优选地，溴化铜、n，n，n'，n'，n”-五甲基二亚乙基三胺以及偶氮二异丁腈与乙二醇二甲基丙烯酸酯的用量比为0.01-0.1g:0.01-0.1g:0.01-0.2g:1g。
优选地，所述聚合反应的温度为40-60℃，时间为10-16h。
优选地，所述脱除模板分子的洗脱剂为甲醇和乙酸的混合溶剂，其体积比优选为8:2。
本发明提出一种分离纯化甜菊糖苷ra的方法，其包括：将权利要求1-9任一项所述分子印迹材料装柱后，再对包含甜菊糖苷ra的样品溶液进行过柱处理。
优选地，所述包含甜菊糖苷ra的样品溶液为甜叶菊水提液。
本发明所述分子印迹材料通过含乙烯基的硅烷偶联剂对氧化石墨烯进行表面修饰，硅烷偶联剂与氧化石墨烯反应生成si-o-si共价键，因此可将乙烯基接枝于石墨烯表面，此后再将乙烯基功能化的氧化石墨烯与功能单体4-乙烯基吡啶、4-乙烯基苯硼酸以及模板分子(甜菊糖苷ra)在一定条件下进行聚合，使功能单体以及氧化石墨烯很好地与模板分子相结合，之后再进行洗脱时就会在聚合物表面形成与模板分子(甜菊糖苷ra)专一性识别的空洞，这种空洞可以专一性识别模板分子(甜菊糖苷ra)。
本发明中，一方面，采用乙烯基功能化的氧化石墨烯参与印迹材料的聚合反应，其可以有效控制分子印迹聚合物的形貌呈现，从而有效地提高分子印迹材料的比表面积，增加了印迹位点和吸附效率；另一方面，采用4-乙烯基吡啶、4-乙烯基苯硼酸的功能单体，二者与模板分子(甜菊糖苷ra)之间形成可逆共价键和氢键的协同效应，因此大大改善了分子印迹材料对模板分子(甜菊糖苷ra)的选择性，具有更加显著的模板分子识别性能和抗干扰能力。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，但是应该明确提出这些实施例用于举例说明，但是不解释为限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提出的一种甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料，其是采用下述方法制备得到：
s1、将1g鳞片石墨和120ml浓硫酸、15ml浓磷酸混匀后，加入6gkmno4在30℃下搅拌反应1.5h，再滴加h2o2(30wt％)溶液，至反应液变为金黄色，加入盐酸后离心洗涤，去离子水洗涤至ph呈中性，干燥，得到氧化石墨烯；将1g氧化石墨烯加入到30ml乙醇中超声分散均匀，再加入0.5ml3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，在80℃下搅拌反应4h，蒸干溶剂后，乙醇洗涤，60℃下真空干燥过夜，得到乙烯基功能化的氧化石墨烯；
s2、将1g乙烯基功能化的氧化石墨烯、0.2g甜菊糖苷ra、1.5g4-乙烯基吡啶、0.4g4-乙烯基苯硼酸和8g乙二醇二甲基丙烯酸酯加入180ml乙腈中，室温下超声分散均匀，得到混合溶液；在混合溶液中通氮气排空氧气后，再加入0.2g溴化铜，0.3gn，n，n'，n'，n”-五甲基二亚乙基三胺和0.4g偶氮二异丁腈，密封条件下，在50℃水浴振荡器中振荡反应12h，冷却至室温后，将所得产物洗涤，烘干，研磨成粉，再用甲醇/乙酸(8/2，v/v)的混合溶剂索氏提取24h，除去模板分子甜菊糖苷ra，直到洗脱剂中检测不到模板分子，再用甲醇洗涤至中性，60℃下真空干燥过夜，得到所述甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料。
实施例2
本实施例提出的一种甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料，其是采用下述方法制备得到：
s1、将1g鳞片石墨和120ml浓硫酸、15ml浓磷酸混匀后，加入6gkmno4在30℃下搅拌反应1.5h，再滴加h2o2(30wt％)溶液，至反应液变为金黄色，加入盐酸后离心洗涤，去离子水洗涤至ph呈中性，干燥，得到氧化石墨烯；将1g氧化石墨烯加入到30ml乙醇中超声分散均匀，再加入0.5ml3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，在80℃下搅拌反应4h，蒸干溶剂后，乙醇洗涤，60℃下真空干燥过夜，得到乙烯基功能化的氧化石墨烯；
s2、将1g乙烯基功能化的氧化石墨烯、0.15g甜菊糖苷ra、0.9g4-乙烯基吡啶、0.45g4-乙烯基苯硼酸和5g乙二醇二甲基丙烯酸酯加入120ml乙腈中，室温下超声分散均匀，得到混合溶液；在混合溶液中通氮气排空氧气后，再加入0.5g溴化铜，0.5gn，n，n'，n'，n”-五甲基二亚乙基三胺和0.5g偶氮二异丁腈，密封条件下，在40℃水浴振荡器中振荡反应16h，冷却至室温后，将所得产物洗涤，烘干，研磨成粉，再用甲醇/乙酸(8/2，v/v)的混合溶剂索氏提取24h，除去模板分子甜菊糖苷ra，直到洗脱剂中检测不到模板分子，再用甲醇洗涤至中性，60℃下真空干燥过夜，得到所述甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料。
实施例3
本实施例提出的一种甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料，其是采用下述方法制备得到：
s1、将1g鳞片石墨和120ml浓硫酸、15ml浓磷酸混匀后，加入6gkmno4在30℃下搅拌反应1.5h，再滴加h2o2(30wt％)溶液，至反应液变为金黄色，加入盐酸后离心洗涤，去离子水洗涤至ph呈中性，干燥，得到氧化石墨烯；将1g氧化石墨烯加入到30ml乙醇中超声分散均匀，再加入0.5ml3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，在80℃下搅拌反应4h，蒸干溶剂后，乙醇洗涤，60℃下真空干燥过夜，得到乙烯基功能化的氧化石墨烯；
s2、将1g乙烯基功能化的氧化石墨烯、0.3g甜菊糖苷ra、2.7g4-乙烯基吡啶、0.3g4-乙烯基苯硼酸和14g乙二醇二甲基丙烯酸酯加入220ml乙腈中，室温下超声分散均匀，得到混合溶液；在混合溶液中通氮气排空氧气后，再加入0.15g溴化铜，0.2gn，n，n'，n'，n”-五甲基二亚乙基三胺和0.5g偶氮二异丁腈，密封条件下，在60℃水浴振荡器中振荡反应10h，冷却至室温后，将所得产物洗涤，烘干，研磨成粉，再用甲醇/乙酸(8/2，v/v)的混合溶剂索氏提取24h，除去模板分子甜菊糖苷ra，直到洗脱剂中检测不到模板分子，再用甲醇洗涤至中性，60℃下真空干燥过夜，得到所述甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料。
对比例1
本对比例提出的一种甜菊糖苷ra分离纯化用非分子印迹材料，其是采用下述方法制备得到：
s1、将1g鳞片石墨和120ml浓硫酸、15ml浓磷酸混匀后，加入6gkmno4在30℃下搅拌反应1.5h，再滴加h2o2(30wt％)溶液，至反应液变为金黄色，加入盐酸后离心洗涤，去离子水洗涤至ph呈中性，干燥，得到氧化石墨烯；将1g氧化石墨烯加入到30ml乙醇中超声分散均匀，再加入0.5ml3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，在80℃下搅拌反应4h，蒸干溶剂后，乙醇洗涤，60℃下真空干燥过夜，得到乙烯基功能化的氧化石墨烯；
s2、将1g乙烯基功能化的氧化石墨烯、1.5g4-乙烯基吡啶、0.4g4-乙烯基苯硼酸和8g乙二醇二甲基丙烯酸酯加入180ml乙腈中，室温下超声分散均匀，得到混合溶液；在混合溶液中通氮气排空氧气后，再加入0.2g溴化铜，0.3gn，n，n'，n'，n”-五甲基二亚乙基三胺和0.4g偶氮二异丁腈，密封条件下，在50℃水浴振荡器中振荡反应12h，冷却至室温后，将所得产物洗涤，烘干，研磨成粉，得到所述甜菊糖苷ra分离纯化用非分子印迹材料。
对比例2
本对比例提出的一种甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料，其是采用下述方法制备得到：
s1、将1g鳞片石墨和120ml浓硫酸、15ml浓磷酸混匀后，加入6gkmno4在30℃下搅拌反应1.5h，再滴加h2o2(30wt％)溶液，至反应液变为金黄色，加入盐酸后离心洗涤，去离子水洗涤至ph呈中性，干燥，得到氧化石墨烯；
s2、将1g氧化石墨烯、0.2g甜菊糖苷ra、1.5g4-乙烯基吡啶、0.4g4-乙烯基苯硼酸和8g乙二醇二甲基丙烯酸酯加入180ml乙腈中，室温下超声分散均匀，得到混合溶液；在混合溶液中通氮气排空氧气后，再加入0.2g溴化铜，0.3gn，n，n'，n'，n”-五甲基二亚乙基三胺和0.4g偶氮二异丁腈，密封条件下，在50℃水浴振荡器中振荡反应12h，冷却至室温后，将所得产物洗涤，烘干，研磨成粉，再用甲醇/乙酸(8/2，v/v)的混合溶剂索氏提取24h，除去模板分子甜菊糖苷ra，直到洗脱剂中检测不到模板分子，再用甲醇洗涤至中性，60℃下真空干燥过夜，得到所述甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料。
对比例3
本对比例提出的一种甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料，其是采用下述方法制备得到：
s1、将1g鳞片石墨和120ml浓硫酸、15ml浓磷酸混匀后，加入6gkmno4在30℃下搅拌反应1.5h，再滴加h2o2(30wt％)溶液，至反应液变为金黄色，加入盐酸后离心洗涤，去离子水洗涤至ph呈中性，干燥，得到氧化石墨烯；将1g氧化石墨烯加入到30ml乙醇中超声分散均匀，再加入0.5ml3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，在80℃下搅拌反应4h，蒸干溶剂后，乙醇洗涤，60℃下真空干燥过夜，得到乙烯基功能化的氧化石墨烯；
s2、将1g乙烯基功能化的氧化石墨烯、0.2g甜菊糖苷ra、1.5g4-乙烯基吡啶和8g乙二醇二甲基丙烯酸酯加入180ml乙腈中，室温下超声分散均匀，得到混合溶液；在混合溶液中通氮气排空氧气后，再加入0.2g溴化铜，0.3gn，n，n'，n'，n”-五甲基二亚乙基三胺和0.4g偶氮二异丁腈，密封条件下，在50℃水浴振荡器中振荡反应12h，冷却至室温后，将所得产物洗涤，烘干，研磨成粉，再用甲醇/乙酸(8/2，v/v)的混合溶剂索氏提取24h，除去模板分子甜菊糖苷ra，直到洗脱剂中检测不到模板分子，再用甲醇洗涤至中性，60℃下真空干燥过夜，得到所述甜菊糖苷ra分离纯化用分子印迹材料。
试验例1
一种分离纯化甜菊糖苷ra的方法，其具体包括：
(1)将甜叶菊干叶粉碎至30目后，按照料液比1:5加入500ml去离子水中，室温下(25℃)超声辅助提取20min(超声功率360w，每工作10s，停5s)，过滤，滤渣拧干后重复提取两次，合并滤液，得到甜叶菊水提液；
(2)将100mg实施例1制得的分子印迹材料加入3ml乙醇水(4:1，v/v)混合溶剂中，湿法装填到3ml色谱柱中，填料的顶端和底端分别盖装有聚丙烯筛板，用3ml的纯水淋洗后，将10ml上述经过精制处理的甜菊糖苷水提液以0.1ml/min的流速过柱上样，先采用20ml纯水进行洗脱，除去杂质，再采用3ml乙醇水(1:4，v/v)混合溶剂进行洗脱，除去甜菊糖s，最后采用6ml乙醇水(2:1，v/v)混合溶剂进行洗脱，收集洗脱液，分离得到甜菊糖苷ra，对其进行hplc分析，其纯度为98.9％，回收率为95.1％。
甜菊糖苷ra的回收率(r，％)按下式计算：
其中，m0和m1分别为吸附到色谱柱上的甜菊糖苷ra的量和洗脱下来的甜菊糖苷ra的量。
试验例2
一种分离纯化甜菊糖苷ra的方法，除了采用100mg实施例2制得的分子印迹材料，其它操作和试验例1相同。
将分离得到的甜菊糖苷ra进行hplc分析，其纯度为98.2％，回收率为95.6％。
试验例3
一种分离纯化甜菊糖苷ra的方法，除了采用100mg实施例3制得的分子印迹材料，其它操作和试验例1相同。
将分离得到的甜菊糖苷ra进行hplc分析，其纯度为97.7％，回收率为96.3％。
试验例4
一种分离纯化甜菊糖苷ra的方法，除了采用100mg对比例1制得的非分子印迹材料，其它操作和试验例1相同。
将分离得到的甜菊糖苷ra进行hplc分析，其纯度为57.2％，回收率为42.3％。
试验例5
一种分离纯化甜菊糖苷ra的方法，除了采用100mg对比例2制得的分子印迹材料，其它操作和试验例1相同。
将分离得到的甜菊糖苷ra进行hplc分析，其纯度为61.1％，回收率为55.8％。
试验例6
一种分离纯化甜菊糖苷ra的方法，除了采用100mg对比例3制得的分子印迹材料，其它操作和试验例1相同。
将分离得到的甜菊糖苷ra进行hplc分析，其纯度为80.5％，回收率为75.2％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。