检测平均单个CAR-T细胞中CAR基因拷贝数的引物组、荧光探针组、试剂盒及方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，尤其涉及一种检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的引物组、荧光探针组、试剂盒及方法。
背景技术：
：car-t细胞是通过以下基因工程手段获得：把识别肿瘤相关抗原的抗体的单链可变区(singlechainfragmentvariable，scfv)和t细胞活化序列的融合蛋白表达到t细胞表面，使可以特异识别肿瘤相关抗原的scfv通过跨膜区与t细胞胞内的活化增殖信号域偶联。表达car的t细胞以抗原依赖、但非mhc限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。用于临床治疗的car-t细胞的制备及质控工艺对于car-t细胞的疗效至关重要。灵敏精准的car基因拷贝数检测方法是car-t细胞放行及临床监测car-t细胞所必需的。双重荧光定量pcr检测基因拷贝数的方法即在dna扩增反应体系中，两个基因的扩增产物分别带有两种不同的荧光基团，通过对两种荧光信号的积累统计，同时实时监测体系中的两个基因的产物表达量，进而计算目标基因的拷贝数。相较于目前较多应用的单基因检测体系，双重荧光定量pcr具有灵敏性高，操作简单等优点。利用双重荧光定量pcr检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数是一种较优的选择，但是目前的方法还存在特异性差、检测范围窄的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的引物组、荧光探针组、试剂盒及方法；所述引物的扩增峰单一，特异性好、利用本发明所述引物组、荧光探针组以及检测方法获得的扩增曲线的精确范围在5～5×106拷贝之间，理论上平均单个car-t细胞中car基因拷贝数检测范围为可达到10-6～106，结果精确，检测范围广。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的引物组，包括检测car基因的引物对和内参基因的引物对；所述car基因包括cd3zeta基因和/或wpre基因，所述内参基因包括abl基因和/或ifng基因；检测cd3zeta基因的引物对的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示；检测wpre基因的引物对的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示；检测abl基因的引物对的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示；检测ifng基因的引物对的核苷酸序列如seqidno.7和seqidno.8所示。本发明提供了一种检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的荧光探针组，包括检测car基因的荧光探针和检测内参基因的荧光探针；所述car基因包括cd3zeta基因和/或wpre基因，所述内参基因包括abl基因和/或ifng基因；检测cd3zeta基因的荧光探针的核苷酸序列如seqidno.9所示；检测wpre基因的荧光探针的核苷酸序列如seqidno.10所示；检测abl基因的荧光探针的核苷酸序列如seqidno.11所示；检测ifng基因的荧光探针的核苷酸序列如seqidno.12所示。本发明提供了一种检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的试剂盒，包括所述的引物组和所述的荧光探针组。优选的，包括检测cd3zeta基因的引物对、检测ifng基因的引物对、检测cd3zeta基因的荧光探针和检测ifng基因的荧光探针。优选的，还包括双重荧光定量pcr反应试剂。本发明提供了一种检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的方法，包括以下步骤：1)将car基因和内参基因共同构建到pzxk质粒载体上获得标准质粒；并设置不同浓度的标准质粒；2)提取待测样本的全基因组dna，并将所述全基因组dna调整到适当浓度范围1ng/μl～500ng/μl；3)将步骤2)中所述的待检测dna、car基因的引物组、内参基因的引物组、car基因的荧光探针、内参基因的荧光探针和双重荧光定量pcr反应试剂混合获得待测样品双重荧光定量pcr反应体系；分别将不同浓度的标准质粒与car基因的引物组、内参基因的引物组、car基因的荧光探针、内参基因的荧光探针和双重荧光定量pcr反应试剂混合获得不同浓度的标准质粒双重荧光定量pcr反应体系；将所述待测样品双重荧光定量pcr反应体系、不同浓度的标准质粒双重荧光定量pcr反应体系上机进行荧光定量pcr检测，获得待测样品car基因的ct值、待测样品内参基因的ct值、不同浓度的标准质粒car基因的ct值和不同浓度的标准质粒内参基因的ct值；计算待测样品car-t细胞中car基因拷贝数；待测样品car-t细胞中car基因拷贝数＝2-△△ct×2；其中△△ct＝待测样品的△ct-矫正系数；待测样品的△ct＝待测样品的car基因ct值-待测样品的内参基因的ct值；矫正系数＝(△ct1+△ct2……△ctn)/n；其中△ctn＝标准质粒car基因的ctn值-标准质粒内参基因的ctn值，n为某一特定浓度。优选的，所述不同浓度的标准质粒的浓度为1.25copies/μl～1.25×106copies/μl。优选的，所述待测样品双重荧光定量pcr反应体系以20μl计，包括以下组分：标准质粒双重荧光定量pcr反应体系以20μl计，包括以下组分：优选的，所述待测样品双重荧光定量pcr和标准质粒双重荧光定量pcr反应程序如下：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。优选的，所述质粒载体为pzxk质粒。本发明的有益效果：本发明提供了一种检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的引物组、荧光探针组、试剂盒及方法；本发明提供的方法能够精确有效的检测t淋巴细胞中car基因的拷贝数，操作简单；所述引物组的扩增峰单一，特异性好；利用本发明所述引物组、荧光探针组以及检测方法获得的扩增曲线的精确范围在5～5×106拷贝之间，理论上平均单个car-t细胞中car基因拷贝数检测范围为可达到10-6～106，结果精确，检测范围广。本发明提供的引物组、荧光探针组、试剂盒及方法能够应用于多个方面：在研发上，可检测car基因的转导效率；在质量放行上，可检测car基因的拷贝数；在临床上，可检测car-t细胞的变化情况；具有非常实际的应用意义。附图说明图1a为pzxk质粒的结构图谱；图1b为s1质粒的结构图谱；图2为标准质粒的结构图谱；图3a为cd3zeta-f/r引物溶解曲线示意图；图3b为cd3zeta-f/r引物扩增曲线示意图；图3c为ifng-f/r引物溶解曲线示意图；图3d为ifng-f/r引物扩增曲线示意图；图3e为abl-f/r引物溶解曲线示意图；图3f为abl-f/r引物扩增曲线示意图；图3g为wpre-gj-f/r引物溶解曲线示意图；图3h为wpre-gj-f/r引物扩增曲线示意图；图4a为cd3zeta-gj-探针，abl探针双重荧光探针扩增下，cd3zeta-f/r引物扩增曲线示意图；图4b为cd3zeta-gj-探针，abl探针双重荧光探针扩增下，abl-f/r引物扩增曲线示意图；图4c为cd3zeta-gj-探针，ifng探针双重荧光探针扩增下，cd3zeta-f/r引物扩增曲线示意图；图4d为cd3zeta-gj-探针，ifng探针双重荧光探针扩增下，ifng-f/r引物扩增曲线示意图；图4e为cd3zeta-gj-探针，ifng探针双重荧光探针扩增下，cd3zeta-f/r引物标准曲线示意图；图4f为cd3zeta-gj-探针，ifng探针双重荧光探针扩增下，ifng-f/r引物标准曲线示意图；图4g为单荧光探针扩增下，ifng-f/r引物标准曲线示意图；图4h为单荧光探针扩增下，cd3zeta-f/r引物标准曲线示意图。具体实施方式本发明提供了一种检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的引物组，包括检测car基因的引物对和内参基因的引物对；所述car基因包括cd3zeta基因和/或wpre基因，所述内参基因包括abl基因和/或ifng基因；检测cd3zeta基因的引物对的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示；检测wpre基因的引物对的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示；检测abl基因的引物对的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示；检测ifng基因的引物对的核苷酸序列如seqidno.7和seqidno.8所示。本发明提供了一种检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的荧光探针组，包括检测car基因的荧光探针和检测内参基因的荧光探针；所述car基因包括cd3zeta基因和/或wpre基因，所述内参基因包括abl基因和/或ifng基因；检测cd3zeta基因的荧光探针的核苷酸序列如seqidno.9所示；检测wpre基因的荧光探针的核苷酸序列如seqidno.10所示；检测abl基因的荧光探针的核苷酸序列如seqidno.11所示；检测ifng基因的荧光探针的核苷酸序列如seqidno.12所示。本发明中所涉及的引物组和荧光探针组的具体核苷酸序列如表1所示。表1引物组和荧光探针组的核苷酸序列在本发明中，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所述荧光探针的3’端标记有荧光淬灭基团；在本发明中，所述荧光报告基团优选的选自fam、hex、vic、rox和cy5中的一种；所述荧光淬灭基团优选的选自bhq1、tamra、joe、bhq2和bhq3中的一种。本发明对所述引物组、荧光探针组的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的生物合成方法委托生物技术公司合成即可。本发明还提供了一种检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的试剂盒，包括所述的引物组和所述的荧光探针组。在本发明的一个优选的实施例中，所述试剂盒包括检测cd3zeta基因的引物对、检测ifng基因的引物对、检测cd3zeta基因的荧光探针和检测ifng基因的荧光探针。在本发明中，所述试剂盒优选的还包括双重荧光定量pcr反应试剂。在本发明中，所述双重荧光定量pcr反应试剂包括荧光定量pcrmix、dyeii和水；本发明对所述荧光定量pcrmix和dyeii的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。在本发明中，所述水优选为荧光定量pcr专用水。本发明提供了一种检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的方法，包括以下步骤：1)将car基因构建到质粒载体上获得s1质粒，将car基因和内参基因共同构建到质粒载体上获得标准质粒；并设置不同浓度的标准质粒；2)提取待测样本的全基因组dna，并将所述全基因组dna调整到适当浓度范围1ng/μl～500ng/μl；3)将步骤2)中所述的待检测dna、car基因的引物组、内参基因的引物组、car基因的荧光探针、内参基因的荧光探针和双重荧光定量pcr反应试剂混合获得待测样品双重荧光定量pcr反应体系；分别将不同浓度的标准质粒与car基因的引物组、内参基因的引物组、car基因的荧光探针、内参基因的荧光探针和双重荧光定量pcr反应试剂混合获得不同浓度的标准质粒双重荧光定量pcr反应体系；将所述待测样品双重荧光定量pcr反应体系、不同浓度的标准质粒双重荧光定量pcr反应体系上机进行荧光定量pcr检测，获得待测样品car基因的ct值、待测样品内参基因的ct值、不同浓度的标准质粒car基因的ct值和不同浓度的标准质粒内参基因的ct值；计算待测样品car-t细胞中car基因拷贝数；待测样品car-t细胞中car基因拷贝数＝2-△△ct×2；其中△△ct＝待测样品的△ct-矫正系数；待测样品的△ct＝待测样品的car基因ct值-待测样品的内参基因的ct值；矫正系数＝(△ct1+△ct2……△ctn)/n；其中△ctn＝标准质粒car基因的ctn值-标准质粒内参基因的ctn值，n为某一特定浓度。在本发明中，所述质粒载体优选的为pzxk质粒，所述pzxk质粒谱图如图1a所示。在本发明中，将car基因和内参基因共同构建到质粒载体上获得标准质粒；并设置不同浓度的标准质粒；所述标准质粒的作用是标定一定浓度范围内car基因与内参基因的扩增效率的差异。在本发明中，所述不同浓度的标准质粒的浓度优选为1.25copies/μl～1.25×106copies/μl；本发明中优选的采用水对标准品质粒进行梯度稀释，所述梯度稀释优选为10倍梯度稀释。本发明根据所述标准质粒的浓度和分子量计算出相应浓度的标准质粒的拷贝数，具体计算公式如下：拷贝数＝6.02×1023×核酸浓度÷(dnalength×660)；拷贝数的单位为copies/ml，核酸浓度单位为g/ml，dnalength为8399。在本发明中，所述待测样品双重荧光定量pcr反应体系以20μl计，优选的包括以下组分：所述标准质粒双重荧光定量pcr反应体系以20μl计，优选的包括以下组分：在本发明中，所述待测样品双重荧光定量pcr和标准质粒双重荧光定量pcr反应程序如下：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。本发明在所述双重荧光定量pcr上机进行荧光定量pcr检测后，根据检测结果计算car-t细胞中car基因拷贝数。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1本实施例中所涉及的引物组和荧光探针组的具体核苷酸序列如表1所示。本实施例中引物和探针的设计基于目的基因car和内参基因的基因序列区或pzxk质粒骨架区，其中上游引物cd3zeta-f位于cd3zeta信号区，下游引物cd3zeta-r位于质粒骨架区。将目的基因cd3zeta引入质粒pzxk上，作为本发明的s1质粒，结构图谱如图1b所示，将目的基因cd3zeta与内参基因引入质粒pzxk上，作为本发明的标准质粒，结构图谱如图2所示。引物和探针的筛选：1)抽提未转染的从人外周血pbmc分离得到的t淋巴细胞全基因组，调整浓度为2.5ng/μl；2)用1)中的基因组10倍梯度稀释s1质粒，使其拷贝数范围在1.25copies/μl到1.25×106copies/μl之间；3)配置sybr反应液，上机检测，检测体系和程序如表2和表3所示；4)分析数据，引物对cd3zeta-f/cd3-r，ifng-f/ifng-r，abl-f/abl-r的特异性最高，灵敏性最好，上述引物的溶解曲线和扩增曲线如图3a-图3h所示，可见扩增峰单一，扩增特异性好；5)用水10倍梯度稀释标准质粒，使其拷贝数范围在1.25copies/μl到1.25×106copies/μl之间；6)内参基因引物及其荧光探针与目的基因引物及其荧光探针配置在同一双重荧光反应体系中，上机检测，检测体系如4所示，检测结果如图4a～图4h所示；7)分析数据，引物对cd3zeta-f/cd3-r，ifng-f/ifng-r，cd3zeta-gj荧光探针及ifng荧光探针一起的双重荧光反应体系，彼此影响最少，扩增曲线与单荧光扩增曲线一致，引物对cd3zeta-f/cd3-r的标准曲线方程皆为y＝3.845x+11.337，r2＝0.9957，引物对ifng-f/ifng-r的标准曲线方程皆为y＝3.8128x+11.406，r2＝0.9963，矫正系数△ct＝-0.05977，几近为零；反应灵敏性最好，有效检测范围在5拷贝到5×106拷贝；反应特异性最高，引物扩增峰单一，无非特异扩增(图4a-图4h)。表2引物特异性筛选反应液配置mix10μldyeii0.4μl上游引物0.8μl上游引物0.8μl模板4μlh2o4μl表3引物筛选反应程序95℃30s95℃5s60℃34s表4双重荧光反应体系mix10μldyeii0.2μl内参基因上游引物0.4μl内参基因下游引物0.4μl目的基因上游引物0.4μl目的基因下游引物0.4μl内参基因荧光探针0.8μl目的基因荧光探针0.8μl模板4μlh2o2.6μl实施例2一种检测t淋巴细胞中car基因拷贝数的方法：1)将未转染的t细胞、转pzxk空载的t细胞和转染了不同浓度的anti-cmetcar的6批car-t细胞共8个待测样品，用血液基因组dna提取试剂盒(天根，dp348)抽提基因组，检测浓度与纯度，用水稀释成2.5ng/μl；2)用水10倍梯度稀释标准质粒，使其拷贝数范围在1.25copies/μl到1.25×106copies/μl之间，并设置标准对照质粒，浓度为2.5×103copies/μl；3)配置双重荧光反应液，上机检测；4)分析数据，用目的基因引物对cd3zeta-f/cd3zeta-r的ct值减去内参基因引物对ifng-f/ifng-r的ct值，获得相应的差值△ct，各个梯度的△ct值的平均值，即为矫正系数。用待测样品的目的基因ct值减去待测样品的内参基因的ct值，获得待测样品的△ct值，待测样品的△ct值减去矫正系数即为△△ct值，2-△△ct值即为人单倍体基因组拷贝数，由于人基因组为2倍体，2-△△ct*2即为待测样品的car基因拷贝数。5)将待测样品的ct值代入计算公式中，获得相应的拷贝数。表5标准品数据分析表6待测样品数据分析由上述实施例可知，本发明提供的方法能够精确有效的检测t淋巴细胞中car基因的拷贝数、操作简单、特异性好、结果精确，检测范围广。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>北京鼎成肽源生物技术有限公司<120>检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的引物组、荧光探针组、试剂盒及方法<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>artificialsequence<400>1cgatggcctttaccagggtc20<210>2<211>21<212>dna<213>artificialsequence<400>2actagttaagccgccaccaag21<210>3<211>20<212>dna<213>artificialsequence<400>3gtccttctgctacgtccctt20<210>4<211>22<212>dna<213>artificialsequence<400>4agctgccttgtaagtcattggt22<210>5<211>21<212>dna<213>artificialsequence<400>5gagccagagatttcccaaagc21<210>6<211>22<212>dna<213>artificialsequence<400>6accaatgataccaaacgcatcc22<210>7<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>7gatactatccagttactgccggtt24<210>8<211>21<212>dna<213>artificialsequence<400>8ggaagcaccaggcatgaaatc21<210>9<211>26<212>dna<213>artificialsequence<400>9acacctacgacgcccttcacatgcag26<210>10<211>26<212>dna<213>artificialsequence<400>10ccctcaatccagcggaccttccttcc26<210>11<211>23<212>dna<213>artificialsequence<400>11ccatggcagcattccgtgtggac23<210>12<211>25<212>dna<213>artificialsequence<400>12atgcctgcaatctgagccagtgctt25当前第1页12