LAMP等温扩增试剂的冻干微球及其制备方法以及应用与流程

本发明属于核酸检测
技术领域：
，具体涉及一种lamp等温扩增试剂的冻干微球及其制备方法以及应用。
背景技术：
：环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是日本荣研株式会发明的一种核酸体外扩增技术，根据靶标基因的6个区域，设计4条特异性引物，利用bstdnapolymerase的链置换作用可以在60～65℃条件下，1小时内完成109～1010倍的扩增。由于lamp扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求。相对于普通pcr技术，lamp技术具有操作简单、检测快速、特异性高、成本低等优点。目前，lamp已成功应用于多个领域的检测，特别是应用于生物病原菌的检测，例如非洲猪瘟病毒、结核杆菌、2019-ncov等，并得到who的认可及大力推广。但是，由于lamp反应所需要的bstdnapolymerase、dntp和引物等成分需要在低温条件下运输保存，成本较高；且非全体系冻干情况下需要实验人员自己配置反应体系，容易出现误差及错误，操作繁琐，同时对实验人员具有较高的要求。同时，lamp技术的气溶胶污染容易造成假阳性结果也进一步增加了该技术的应用及推广难度。冷冻干燥技术又称升华干燥，是一种将含水物料在冰点以下和较高真空条件下直接去除水分的干燥方法。可以避免热敏性物质发生生物、化学或物理变化，并最大限度保持原料的活性和物理、化学性质。申请公布号为cn109486907a的发明专利公开了一种可常温运输的环介导等温扩增试剂、制备方法及应用，该环介导等温扩增试剂包括bstdnapolymerase、dntp、引物混合物、指示剂、保护剂和气溶胶污染预防剂；所述的引物混合物中包含引物fip、bip、lf、lb、f3和b3；所述的指示剂中包含hnb溶液和gelgreen溶液；所述的保护剂中包含牛血清白蛋白、大豆卵磷脂、甘露醇和羟乙基淀粉；所述的气溶胶污染预防剂中包含甘草甜素、海藻酸钠和叔丁醇，制备方法为：将bstdnapolymerase、dntp、引物混合物、指示剂、保护剂和气溶胶污染预防剂按照比例混合，在-70℃～-80℃下冷冻干燥8～16h，即得。上述制备方法得到环介导等温扩增试剂是粉状的，冻干粉试剂不易定量，不易分装，无法满足即时检测类产品的需求。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种lamp等温扩增试剂的冻干微球，该lamp等温扩增试剂的冻干微球，可增加检测试剂的稳定性，可常温运输，节约能源和运输成本，且便于分装。本发明的第二个目的是提供一种lamp等温扩增试剂的冻干微球的制备方法。本发明的第三个目的是提供一种lamp等温扩增试剂的冻干微球的应用。为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：lamp等温扩增试剂的冻干微球，包括lamp引物组、冻干保护剂以及反应液；所述lamp引物组包括外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip、环引物lf、环引物lb；所述冻干保护剂包括牛血清蛋白、苏氨酸和peg20000；lamp引物组、冻干保护剂、反应液的添加的体积份数分别为：7～14份、9～17份、9.2～17.75份。进一步地，所述反应液包括bstdna聚合酶、指示剂、dntps、缓冲剂、mgso4、甜菜碱、逆转录酶，bstdna聚合酶、指示剂、dntps、缓冲剂、mgso4、甜菜碱、逆转录酶的添加的体积份数分别为：0.8～1.5份、0.5～2份、2.5～3.75份、2～4份、1.0～1.5份、2～4份、0.1～0.5份。进一步地，所述反应液还包括dutp和ung酶，dutp和ung酶添加的体积份数分别为：1～2份、0.1～0.5份。进一步地，所述指示剂为sybrgreeni；所述缓冲剂为pcrbuffer。进一步地，所述牛血清蛋白的原始浓度为16.7％(w/v)、苏氨酸的原始浓度为8％(w/v)、peg20000的原始浓度为25％(w/v)。进一步地，所述冻干保护剂中牛血清蛋白、苏氨酸和peg20000添加的体积份数分别为：3～5份、3～5份、3～7份。进一步地，所述lamp引物组中f3、b3、lf、lb、fip、bip的添加的体积份数分别为0.5～1.0份、0.5～1.0份、1～2份、1～2份、2～4份、2～4份。上述lamp等温扩增试剂的冻干微球的制备方法，包括以下步骤：1)制备冻干保护剂：取配方量的牛血清蛋白、苏氨酸、peg20000；2)配制扩增反应体系：取配方量的lamp引物组和反应液，混合得到扩增反应体系；3)冻干成微球：将冻干保护剂与扩增反应体系混合均匀，逐滴的滴入液氮中速冻成球，之后冷冻干燥，即得。进一步地，所述冷冻干燥的程序为：-50～-60℃下进行第一次干燥8～16h，之后在20～30℃下进行二次升华干燥3～4h，即得。上述lamp等温扩增试剂的冻干微球在lamp等温扩增中的应用。本发明的有益效果：本发明的lamp等温扩增试剂的冻干微球，该lamp等温扩增试剂的冻干微球，可增加检测试剂的稳定性，长期放置后冻干微球的检测灵敏度和检出时间与新配置的检测试剂差别不大，说明本发明的lamp等温扩增试剂的冻干微球具有较长的稳定性，可常温运输，节约能源和运输成本，且便于分装。附图说明图1为实施例1的lamp等温扩增试剂的冻干微球的图片；图2为实施例lamp等温扩增试剂的冻干微球在lamp等温扩增中应用的检测结果；图3为对照试剂在lamp等温扩增中应用的检测结果。具体实施方式下面将结合本发明实施例以及附图对本发明作进一步说明。实施例1本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球的制备方法，包括以下步骤：1)制备冻干保护剂：质量体积比(w/v)为8％的苏氨酸的配制，用电子天平称取8g的苏氨酸，加入80ml的纯化水，放到磁力搅拌器中进行加热溶解，最后定容到100ml，用4um的过滤器进行过滤，在4℃条件下放置，备用。质量体积比(w/v)为10％的牛血清蛋白的配制，用电子天平称取10g的牛血清蛋白，加入80ml的纯化水，放到磁力搅拌器中进行加热溶解，最后定容到100ml，用4um的过滤器进行过滤，在-20℃条件下放置，备用。质量体积比(w/v)为25％的peg20000的配制，用电子天平称取25g的peg20000，加入80ml的纯化水，放到磁力搅拌器中进行加热溶解，最后定容到100ml，用4um的过滤器进行过滤，在4℃条件下放置，备用。2)配制扩增反应体系：用于2019-ncov病毒核酸恒温扩增的引物的f3、b3、lf、lb、fip、bip如seqid1-6所示。表12019-ncov病毒特异性恒温扩增的引物引物名称引物序列f3tgcttcagtcagctgatgb3ttaaattgtcatcttcgtccttlfctgcacttacaccgcaalbgtagctggttttgctaaattccfiptcagtactagtgcctgtgcccacaatcgtttttaaacgggtbiptcgtatacagggcttttgacatctatcttggaagcgacaacaa用于2019-ncov病毒核酸恒温扩增的反应体系如表2所示。表2用于2019-ncov病毒核酸恒温扩增的反应体系将表2中的各物质混合即得到2019-ncov病毒核酸恒温扩增的反应体系。3)冻干成微球：取冻干保护剂中的牛血清蛋白3μl、苏氨酸3μl和peg200003μl，将牛血清蛋白、苏氨酸和peg20000分别与2019-ncov病毒核酸恒温扩增的反应体系混合，之后用移液枪吸取20μl加入到液氮中进行预冻之后加入到西林瓶中。将西林瓶放入冻干机中，冻干机气压降到10pa以下-55℃真空处理8小时。空状态下将冻干机内部温度升至10℃真空处理2小时。真空状态下将冻干机内部温度升至30℃真空处理2小时。冻干完毕后，即得到lamp等温扩增试剂的冻干微球。lamp等温扩增试剂的冻干微球如图1所示。本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球，即采用本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球的制备方法制备得到的lamp等温扩增试剂的冻干微球。本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球在lamp等温扩增中的应用，包括以下步骤：1)将lamp等温扩增试剂的冻干微球分装到荧光定量8连管中后进行复融。2)采用3组假病毒进行冻干试剂验证，同时做一组现配液体试剂作为对照试剂。反应程序为65℃，30s，100个循环，80℃，2min。检测结果如图2和图3所示，冻干后的酶活保持良好，冻干试剂与液体试剂的检测结果无明显差别，冻干过程不会影响试剂性能。实施例2本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球的制备方法，步骤与实施例1的步骤相同，与实施例1的区别在于：冻干保护剂的添加量为：牛血清蛋白3μl、苏氨酸3μl和peg200005μl；反应体系如表3所示；冷冻干燥的程序为：-50℃下进行第一次干燥16h，之后在20℃下进行二次升华干燥3h。表3用于2019-ncov病毒核酸恒温扩增的反应体系本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球，即采用本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球的制备方法制备得到的lamp等温扩增试剂的冻干微球。实施例3本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球的制备方法，步骤与实施例1的步骤相同，与实施例1的区别在于：冻干保护剂的添加量为：牛血清蛋白3μl、苏氨酸5μl和peg200007μl；冷冻干燥的程序为：-60℃下进行第一次干燥10h，之后在30℃下进行二次升华干燥3h；反应体系如表4所示。表4用于2019-ncov病毒核酸恒温扩增的反应体系本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球，即采用本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球的制备方法制备得到的lamp等温扩增试剂的冻干微球。实施例4本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球的制备方法，步骤与实施例1的步骤相同，与实施例1的区别在于：冻干保护剂的添加量为：牛血清蛋白5μl、苏氨酸3μl和peg200009μl；反应体系如表5所示；冷冻干燥的程序为：-50℃下进行第一次干燥14h，之后在25℃下进行二次升华干燥4h。表5用于2019-ncov病毒核酸恒温扩增的反应体系本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球，即采用本实施例的lamp等温扩增试剂的冻干微球的制备方法制备得到的lamp等温扩增试剂的冻干微球。对比例：对比例的lamp等温扩增试剂的冻干微球的制备方法，步骤与实施例1的步骤相同，与实施例1的区别在于：冻干保护剂的种类以及添加量不同。冻干保护剂的种类以及冻干保护剂的原始质量浓度如表6所示。表6干保护剂的种类以及冻干保护剂的原始质量体积比由表6可见，peg20000、牛血清蛋白添加之后反应时间较阳性时间短，苏氨酸添加之后与阳性反应时间一样，其他添加之后结果均较对照反应时间稍长。试验例lamp等温扩增试剂的冻干微球结果检测：测定实施例1制备的lamp等温扩增试剂的冻干微球稳定性：冻干试剂相较于液体试剂，最大的特点是能够实现常温储存及运输。为了验证本发明中涉及到的冻干工艺的稳定性，设计以下实验。采用实施例1的lamp等温扩增试剂的冻干微球以及现配未冻干试剂做对照进行验证。采用加速破坏性实验方法来对冻干后的试剂稳定性进行验证，加速温度为37℃，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天对试剂性能进行测试。检测结果如表7所示。表7lamp等温扩增试剂的冻干微球稳定性检测结果由表7可见，在37℃加速破坏性实验中，第1天至第10天样本扩增ct值无明显差异，且扩增曲线无变化。说明按照本发明方法对荧光pcr扩增试剂进行冻干处理，稳定性较好。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。序列表<110>河南智泰生物科技有限公司<120>lamp等温扩增试剂的冻干微球及其制备方法以及应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgcttcagtcagctgatg18<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttaaattgtcatcttcgtcctt22<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ctgcacttacaccgcaa17<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gtagctggttttgctaaattcc22<210>5<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tcagtactagtgcctgtgcccacaatcgtttttaaacgggt41<210>6<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tcgtatacagggcttttgacatctatcttggaagcgacaacaa43当前第1页12