一种用于治理蓝藻水华的菌剂及其制备方法与流程

[0001]
本发明涉及水环境治理领域，更特别地，涉及一种用于制备水体修复菌剂的组合物、制备方法，以及得到的水体修复菌剂。


背景技术：

[0002]
水体富营养化是影响城市水体健康的重要因素之一。当水体富含氮磷等无机物时，微藻尤其是蓝藻在适宜的环境下能够大量增殖，导致水中藻浓度升高，降低水质透光性，从而在低光下微藻的光合作用降低，消耗水体中的氧气，使水中的动物和微生物死亡。此外，一些微藻例如微囊藻等还会分泌藻毒素，对水生生物造成危害，该情况如果发生在饮用水水源，也可能危及人体健康。
[0003]
目前，治理富营养化水体和水华水体的方法主要有物理方法、化学方法和生物方法。
[0004]
本发明的发明人于于2018年2月7日在湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏了一株赖氨酸芽孢杆菌wp，保藏号为cctcc no:m2018093。该菌株对包括鱼腥藻、拟柱孢藻和微囊藻在内的大多数水华蓝藻均有非常好的杀伤效果，可用于治理蓝藻水华。我们针对该菌株申请了两件发明专利，分别为cn2018106709607一种具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物及其应用和cn2018106719420一种溶藻细菌及其应用。
[0005]
然而，以上两个专利中均使用赖氨酸芽孢杆菌wp的发酵液或从发酵液简单分离的菌体或上清液进行处理，该方法简单有效，但是不利于储存和运输，并且，我们在实验中还发现赖氨酸芽孢杆菌wp的一般培养方法可以快速将菌株培养至对数期(数小时)和稳定期(10-15小时)，但是，细菌的一个特点在于当到达了稳定期一段时间后会进入到衰亡期，影响细胞的活性。因此，以上问题限制了该菌株的应用。


技术实现要素：

[0006]
为解决以上问题，本发明提供了赖氨酸芽孢杆菌在制备蓝藻水华治理用菌剂中的应用。
[0007]
在一个具体实施方案中，所述蓝藻水华为微囊藻水华、鱼腥藻水华和拟柱孢藻水华中的一种或多种组合。
[0008]
在一个优选实施方案中，所述赖氨酸芽孢杆菌为赖氨酸芽孢杆菌wp。
[0009]
本发明还提供了一种制备蓝藻水华治理用菌剂的方法，包括发酵底物、第一发酵剂和第二发酵剂发酵的步骤，所述第一发酵剂包含枯草芽孢杆菌和酵母菌，所述第二发酵剂包含赖氨酸芽孢杆菌wp。
[0010]
在一个优选实施方案中，所述第一发酵剂中，枯草芽孢杆菌和酵母菌的活菌数均为2-5
×
106/g。
[0011]
在一个优选实施方案中，所述第二发酵剂通过以下方法得到：将所述赖氨酸芽孢
杆菌wp培养至对数期，并使细胞密度达到2-5
×
108/ml，得到赖氨酸芽孢杆菌wp培养物，向所述赖氨酸芽孢杆菌wp培养物中加入鱼腥藻，孵育，得到所述第二发酵剂。在一个具体实施方案中，将低温保存的赖氨酸芽孢杆菌wp在r2a固体培养基上划线培养，挑取单克隆接种于r2a液体培养基中，在28℃下震荡培养至对数期，然后再转接一次，培养至对数期，使细胞密度为2-5
×
108/ml，向培养物中加入鱼腥藻pcc7120，于28℃孵育30min，得到第二发酵剂。
[0012]
在研究过程中我们发现，通过使用鱼腥藻与赖氨酸芽孢杆菌wp培养物孵育30-60min来获得第二发酵剂，从而使得到菌剂具有更高的溶藻效力。
[0013]
在一个优选实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0014]
s1：将所述发酵底物与第一发酵剂混匀，堆积发酵，得到第一发酵产物；
[0015]
s2：将所述第一发酵产物与第二发酵剂混匀，发酵得到第二发酵产物；
[0016]
s3：将所述第二发酵产物干燥、粉碎、混匀，得到所述菌剂。
[0017]
在一个优选实施方案中，s1中，所述第一发酵剂与所述发酵底物的质量比为1-3:100，发酵环境的湿度保持为55-60％，温度为60-65℃。
[0018]
在一个优选实施方案中，s2包括以下步骤：
[0019]
s21：将所述第一发酵产物冷却至30-35℃；
[0020]
s22：加入第二发酵剂，混匀，于30-35℃下发酵18-24小时，得到所述第二发酵产物，所述第二发酵剂与发酵底物的体积质量比为50-100ml/kg，发酵环境的湿度为70-75％。
[0021]
本发明还提供了通过上述方法制备得到的蓝藻水华治理用菌剂。
[0022]
通过使用本发明的组合物和方法得到菌剂既具有良好的溶解蓝藻的功效，并且能够吸收水中的磷元素，可用于蓝藻水华治理。并且，该菌剂在存放长达1个月以上的时间后，仍然具有良好的溶藻功效，有利于进行长途运输和长期储藏，使用方便。
附图说明
[0023]
图1为本发明的菌剂对铜绿微囊藻m.aeruginosa pcc 7806的抑制效果统计图；
[0024]
图2为本发明的菌剂对真紧密鱼腥藻a.eucompacta chab 1799的抑制效果统计图；
[0025]
图3为本发明的菌剂对拉氏拟柱孢藻c.raciborskii chab 151的抑制效果统计图；
[0026]
图4为本发明的菌剂在储存一段时间后对铜绿微囊藻m.aeruginosa pcc 7806的抑制效果统计图。
具体实施方式
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以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0028]
1、菌剂的制备
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1.1发酵的组分
[0030]
发酵组分包括以下成分：
[0031]
底物按重量比包含以下组分，5-15％的豆粕粉，60-70％的鸡粪干物质和15-25％的稻壳粉。
[0032]
第一发酵剂：包含枯草芽孢杆菌和酵母菌，含量均为2-5
×
106/g。
[0033]
第二发酵剂：将低温保存的赖氨酸芽孢杆菌wp在r2a固体培养基上划线培养，挑取单克隆接种于r2a液体培养基中，在28℃下震荡培养至对数期，然后再转接一次，培养至对数期，使细胞密度为2-5
×
108/ml，得到赖氨酸芽孢杆菌培养物，向培养物中加入鱼腥藻pcc7120，于28℃孵育30-60min，得到第二发酵剂。第二发酵剂在制备完成后于4℃下储存，须在12个小时内使用。
[0034]
1.2发酵
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s1：将发酵底物与第一发酵剂混匀，堆积发酵4-5天，第一发酵剂与所述发酵底物的质量比为1-3:100，发酵环境的湿度保持为55-60％，温度保持为60-65℃，得到第一发酵产物；
[0036]
s2：将第一发酵产物冷却至30-35℃，然后加入第二发酵剂，混匀，于30-35℃下发酵12-24h，第二发酵剂与发酵底物的体积质量比为50-100ml/kg，发酵环境的湿度保持为70-75％。
[0037]
发酵结束后，将发酵产物进行干燥、粉碎并混匀，即得到用于治理蓝藻水华的菌剂，于10-15℃下。
[0038]
2、菌剂的应用实例
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使用前将上述菌剂以每吨10kg红糖的重量比混合，然后加入等重量的水混合，室温放置2h，得到工作液。其中，在不同的处理组中使用放置时间为5天(5d菌剂组)和30天(30d菌剂组)的菌剂配制工作液。
[0040]
2.1实验室验证
[0041]
用ct培养基分别培养铜绿微囊藻m.aeruginosa pcc 7806、真紧密鱼腥藻a.eucompacta chab 1799、拉氏拟柱孢藻c.raciborskii chab 151培养至对数期。将工作液以体积比5％的量加入至对数期微藻培养物中，在25
±
1℃，光照强度为30μmol
·
m-2
·
s-1
，光暗周期比为12h:12h条件下培养，定期测定其叶绿素a的含量，叶绿素浓度稳定后计算溶藻效率。
[0042]
2.11鱼腥藻的诱导效果验证
[0043]
我们使用赖氨酸芽孢杆菌培养物直接作为第二发酵剂来制备菌剂，但是效果不理想。在研究过程中，在获得赖氨酸芽孢杆菌培养物后，接种鱼腥藻孵育30-60min，得到的第二发酵剂用于制备菌剂，我们意外地发现，通过这种方法制备的菌剂的控藻能力大大提高。
[0044]
如图1-3所示，在制备第二发酵剂的过程中使用鱼腥藻进行刺激可以提高获得的菌剂的溶藻能力。
[0045]
2.12货架期的验证
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以加入新制的赖氨酸芽孢杆菌培养物和在4℃下放置了5天的赖氨酸芽孢杆菌(在常温下放置5天，培养物中的赖氨酸芽孢杆菌基本死亡)至微藻培养物中作为阳性对照和对比例。
[0047]
结果如图4所示，5d菌剂组和30d菌剂组均具有良好的控藻效果，与阳性对照差不多，而对比例的控藻效果比较差。由此可见，本发明的方法制备的菌剂具有长达1个月以上的货架期，有利于进行长途运输和长期储藏，使用方便。
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2.2城市水华水体的控藻应用
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治理地点为武汉东湖旁的池塘，该池塘具有严重的微囊藻水华。将储存了30天的菌剂按上述方法配制成工作液，喷洒于上述池塘中，用量为每平方米水域0.1l。施用工作液后，每天取样检测池塘中的叶绿素a含量，取样点为池塘中心和四角，取平均值。
[0050]
结果显示，自施用工作液起，池塘中的叶绿素含量逐渐降低，5天后，叶绿素含量降到低点，水质也变得澄清，并长时间保持该状态。在检测叶绿素含量时，同时检测其中的总磷含量，结果显示，水中的磷含量在前三天升高，从第4天开始磷含量逐渐降低。前期的总磷升高可能是因为藻细胞溶解导致微藻细胞内的磷进入到水中的原因，后期总磷持续降低，说明本发明的菌剂中含有可在野外水体中繁殖并能吸收水体中的磷元素的细菌。
[0051]
以上实验可知，本发明的菌剂既具有良好的溶解蓝藻的功效，并且能够吸收水中的磷元素，可用于蓝藻水华治理。
[0052]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。