一种硫酸新霉素发酵生产中的流加补料方法与流程

本发明涉及生物制药技术领域，尤其是一种硫酸新霉素发酵生产中的流加补料方法。

背景技术：

目前，流加补料法(指在分批发酵过程中，向发酵系统连续补加一些营养物质的一种补料方法)被广泛应用于抗生素发酵行业，但在国内硫酸新霉素的发酵生产中并未得到应用，其主要原因是在硫酸新霉素发酵过程中需要大量补入基质浓度比较高的碳源氮源作为营养物质(例如糖料)，基质浓度高达40％，而且有一定的粘性，若采用流加补料，补料速率偏低，糖料容易堵塞管道阀门，为检修带来不便，而且容易造成灭菌死角。

对于如何实现硫酸新霉素的发酵补料，现有技术通常是采用带多个阀门的计量罐对发酵罐中的发酵液进行手动补料，所采用装置结构如图1所示，每隔一段时间根据所测指标，计算出发酵液在未来一段时间所需要的糖料、硫铵等营养物质，先将所需营养物质压入计量罐(计量罐上配有标记好的刻度管)，再通过计量罐一次性补入发酵罐。

上述手动补料的方式在操作和控制上完全靠人，存在不确定风险，不能精确计量和控制，操作繁琐，劳动强度大，而且手动补料是一次性补料，一次性补入量过多，可能造成过多菌株大量生长，溶氧急剧降低，ph不稳定，造成发酵环境波动，影响菌丝正常代谢，有毒代谢物的大量累积抑制新霉素的转化合成。

为了解决上述手动补料产生的问题，宜昌市三峡制药有限公司还研发了自动计量杯式补料系统进行补料，在上述手动补料(图1)的基础上增加了气动隔膜阀、液位电极和控制系统，在计量罐上增加液位电极来计量体积，用气动隔膜阀来控制进出料，其原理是把欲补充的营养物质按计量罐的容积，根据补料速率，换算成相应的时间，然后等间隔地加进发酵罐，例如，2000l糖料4小时补完，计量罐体积20l，则1小时补糖料25罐，如图2所示。

上述自动计量杯式补料方式虽然降低了劳动强度，降低了人为操作风险，也在一定程度上避免了一次性补料过多带来的不利影响，但是该套补料系统涉及了大量的管道阀门，容易形成灭菌死角，更容易对整个补料系统造成染菌风险，维护不方便，而且由于硫酸新霉素发酵补入的营养物质浓度高，有粘性，比如糖料，会经常黏在液位电极上，影响液位电极的信号传输，造成计量不准或者信号延迟耽误补料时间等问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种硫酸新霉素发酵生产中的流加补料方法，去掉了计量罐及其大量管道阀门，通过气动隔膜阀、手动隔膜阀及排污阀、电磁流量计来实现对发酵罐的精准流加补料，操作简单，无灭菌死角，降低了补料系统染菌的风险，降低了补料系统灭菌的次数；采用本发明所述方法后，发酵环境更稳定，菌丝代谢更旺盛，有用产物转化率更高，效价明显增加。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种硫酸新霉素发酵生产中的流加补料方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：将补料管道直接与硫酸新霉素发酵罐连通，在补料管道上按照进料方向依次设置流量计和气动隔膜阀；

步骤2：确定每次取样的时间间隔h；

步骤3：每隔一个取样时间间隔h，取样人员对硫酸新霉素发酵罐中的发酵液取样检测还原糖、氨态氮等指标，结合发酵液代谢情况，确定一个取样时间间隔h的总补料量s，计算本次取样时间间隔的补料速率v，计算公式为：

补料速率v＝总补料量s/取样时间间隔h

s，单位为l；h，单位为小时；

步骤4：设定本次取样间隔h中的补料周期t＝20-300秒；

步骤5：确定补料瞬间速率v瞬

当气动隔膜阀开启后，流量计所测瞬间流量即为补料瞬间速率v瞬

v瞬，单位为l/h

步骤6：计算一次补料周期t中气动隔膜阀开启的时间t开启，计算公式为

t开启＝(补料速率v×补料周期t)÷补料瞬间速率v瞬

t开启，单位为秒；

步骤7：计算一次补料周期t中气动隔膜阀关闭的时间t关闭，计算公式为

t关闭＝补料周期t-t开启

t关闭，单位为秒；

步骤8：根据步骤4确定的补料周期t以及步骤6计算的一次补料周期t中气动隔膜阀开启的时间t开启，在本次取样时间间隔h内，不断重复开关气动隔膜阀，直至一个取样时间间隔h的总补料量s全部补充进入硫酸新霉素发酵罐，即完成硫酸新霉素发酵生产中的流加补料。

优选地，步骤1中，在气动隔膜阀两端的补料管道上分别设置第一手动隔膜阀和第二手动隔膜阀，第一手动隔膜阀和第二手动隔膜阀上分别设置有排污阀。

优选地，步骤2中，每次取样的时间间隔h由硫酸新霉素生长代谢规律和取样检测可操作性来决定，通常为4-8小时。

优选地，步骤1中的流量计为电磁流量计，安装于垂直的补料管道的底端，其电线连接于补料管道的金属法兰上。

本发明提供的一种硫酸新霉素发酵生产中的流加补料方法，克服了此前硫酸新霉素发酵无法实现流加补料的缺陷，克服自动计量杯式补料系统结构复杂，容易造成灭菌死角，维护不便及电极易受干扰等问题，去掉了计量罐及其大量管道阀门，通过气动隔膜阀、手动隔膜阀及排污阀及电磁流量计来实现对发酵罐的精准流加补料，大大简化了结构和补料步骤，降低了成本；操作简单，无灭菌死角，降低了染菌的风险，降低了补料系统灭菌的次数，气动隔膜阀两端各设有一个手动隔膜阀，防止在生产中气动隔膜阀失灵需要检修时及时关闭手动隔膜阀，避免污染整个补料管道及发酵罐，安全系数更高，手动隔膜阀各连接一个排污阀，确保在灭补料管道或发酵罐时，蒸汽畅通，阀门与阀门之间无灭菌死角，在垂直的补料管道底端安装电磁流量计，并将电线连接到金属法兰上，有效抗电磁干扰，电磁流量计测量不受流体密度、粘度等影响，测量更准确。

硫酸新霉素发酵采用本发明所述的方法后罐内溶氧更稳定，菌丝代谢更旺盛，有用产物新霉素转化率更高，放罐效价明显增加。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

图1为本发明背景技术中手动补料的示意图；

图2为本发明背景技术中自动计量杯式补料系统的示意图；

图3为本发明所述方法的流量计及各阀门的连接示意图；

图4为本发明实施例二的溶氧曲线图，其中横坐标代表发酵周期，单位为h，纵坐标代表溶氧。

具体实施方式

实施例一

一种硫酸新霉素发酵生产中的流加补料方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：将补料管道1直接与硫酸新霉素发酵罐2连通，在补料管道1上按照进料方向依次设置流量计3和气动隔膜阀4。

步骤2：确定每次取样的时间间隔h。

步骤3：每隔一个取样时间间隔h，取样人员对硫酸新霉素发酵罐2中的发酵液取样检测还原糖、氨态氮等指标，结合发酵液代谢情况，确定一个取样时间间隔h的总补料量s，计算本次取样时间间隔的补料速率v，计算公式为：

补料速率v＝总补料量s/取样时间间隔h

s，单位为l；h，单位为小时。

步骤4：补料周期t时间过短会造成气动隔膜阀4频繁开关，影响气动隔膜阀4寿命及整个流加补料系统稳定，补料周期t时间过长就有可能达不到流加补料的效果，步骤4：设定本次取样间隔h中的补料周期t＝20-300秒；

例如：取样时间间隔h＝4小时，总补料量s＝3600l，补料速率v＝总补料量s/取样时间间隔h＝3600l/4h＝900l/h，补料周期t＝10s，补料瞬间速率v瞬＝3600l/h,气动隔膜阀4在一个补料周期t内开启时间t开启＝(补料速率v×补料周期t)÷补料瞬间速率v瞬＝(900l/h×10s)÷3600l/h＝2.5s，气动隔膜阀4在一个补料周期t内关闭时间t关闭＝补料周期t-t开启＝10s-2.5s＝7.5s，虽然达到了很好的流加效果，但1小时内，气动隔膜阀4会开关360次，开关过于频繁。

同样条件下，当补料周期t设定为3600s时，气动隔膜阀4在一个补料周期t内开启时间t开启＝(补料速率v×补料周期t)÷补料瞬间速率v瞬＝(900l/h×3600s)÷3600l/h＝900s，气动隔膜阀4在一个补料周期t内关闭时间t关闭＝补料周期t-t开启＝3600s-900s＝2700s，虽然1小时内气动隔膜阀4只需要开关一次，但在气动隔膜阀4开启的900s内，一次性补入了900l料，然后气动隔膜阀4关闭2700s，这显然达不到流加补料的效果；

因此，通常设定本次取样间隔h中的补料周期t＝20-300秒。

步骤5：确定补料瞬间速率v瞬

当气动隔膜阀4开启后，流量计3所测瞬间流量即为补料瞬间速率v瞬

v瞬，单位为l/h。

步骤6：计算一次补料周期t中气动隔膜阀4开启的时间t开启，计算公式为

t开启＝补料速率v×补料周期t÷补料瞬间速率v瞬

t开启，单位为秒；

步骤7：计算一次补料周期t中气动隔膜阀4关闭的时间t关闭，计算公式为

t关闭＝补料周期t-t开启

t关闭，单位为秒；

步骤8：根据步骤4确定的补料周期t以及步骤6计算的一次补料周期t中气动隔膜阀4开启的时间t开启，在本次取样时间间隔h内，不断重复开关气动隔膜阀4，直至一个取样时间间隔h的总补料量s全部补充进入硫酸新霉素发酵罐2，即完成硫酸新霉素发酵生产中的流加补料。

步骤1中，在气动隔膜阀4两端的补料管道1上分别设置第一手动隔膜阀5和第二手动隔膜阀6，第一手动隔膜阀5和第二手动隔膜阀6上分别设置有排污阀7。

步骤2中，每次取样的时间间隔h由硫酸新霉素生长代谢规律和取样检测可操作性来决定，通常为4-8小时。

步骤1中的流量计3为电磁流量计，安装于垂直的补料管道1的底端，其电线连接于补料管道1的金属法兰上。

上述实施例的数值计算过程如下：

取样时间间隔h＝4小时，总补料量s＝3600l，补料速率v＝总补料量s/取样时间间隔h＝3600l/4h＝900l/h，补料周期t＝60s，补料瞬间速率v瞬＝3600l/h,气动隔膜阀4在一个补料周期t内开启时间t开启＝(补料速率v×补料周期t)÷补料瞬间速率v瞬＝(900l/h×60s)÷3600l/h＝15s，气动隔膜阀4在一个补料周期t内关闭时间t关闭＝补料周期t-t开启＝60s-15s＝45s，气动隔膜阀4在一个补料周期t内开启15s再关闭45s，再在下一个补料周期t内开启15s再关闭45s，直至在一个取样间隔时间h内将料补完，紧接着开始下一个班次的补料，实现不断流加补料。

实施例二

三峡制药有限公司二分厂在硫酸新霉素发酵过程中采用本发明所述的方法后，罐内溶氧更稳定，菌丝代谢更旺盛，生物效价明显增加，在三峡制药一分厂采用手动计量杯式补料和二分厂采用本发明方法分别选取3批放罐周期相同或接近的做对比实验，一分厂选取发酵罐批数f353/0696、f356/0698、f358/0700，二分厂选取发酵罐批数f309/247、f312/248、f303/249，对比结果如下：

(一)罐内溶氧对比：实验罐中选取周期60h～84h进行溶氧对比，这个阶段代谢比较旺盛，补料量大，溶氧波动更明显，从图4可明显看出一分厂采用手动计量杯式补料实验罐批f353/0696、f356/0698、f358/0700在60h～84h内每次补料后，罐内溶氧急剧下滑；二分厂采用本发明方法实验罐批f309/247、f312/248、f303/249在60h～84h内补料后，罐内溶氧并未出现急剧波动，罐内溶氧比较稳定。

(二)代谢对比：三峡制药二分厂在硫酸新霉素发酵补料过程中采用本发明所述的方法后，代谢更旺盛，补糖量明显增加，由于三峡制药一分厂和二分厂发酵罐培养基体积不一样一分厂发酵罐培养基体积75t，二分厂发酵罐培养基体积115t，为了更直观地比较，将一分厂发酵培养基体积折算成115t，在发酵罐培养基体积相同的情况下，再来比较一分厂采用手动计量杯式补料实验罐批f353/0696、f356/0698、f358/0700和二分厂采用本发明方法实验罐批f309/247、f312/248、f303/249代谢情况：

表1为一分厂实验罐批代谢补糖量及折算后代谢补糖量(折算后补糖量＝补糖量

×115÷75)，表2为二分厂实验罐批代谢补糖量；

从表1和表2可以很明显看出，二分厂实验罐批平均补糖量提高了约30％，代谢补糖量大幅增加，放罐体积大幅增加，在放罐效价不变的情况下，产量大幅增加，产量＝放罐效价×放罐体积。

表1

表2

(三)效价对比：三峡制药二分厂在硫酸新霉素发酵补料过程中采用本发明所述的方法后，放罐效价明显增加：

表3为一分厂实验罐批采用手动计量杯式补料实验罐批f353/0696、f356/0698、f358/0700放罐效价；

表4为二分厂采用本发明方法实验罐批f309/247、f312/248、f303/249放罐效价；

从表3和表4可以很明显看出，二分厂实验罐批平均放罐效价提高了约14％，放罐效价增长明显，在放罐体积不变的情况下，产量增加了约14％，产量＝放罐效价×放罐体积。

表3

表4

上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。