一株具有降甘油三酯功能的鼠李糖乳杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物
技术领域：
，特别涉及一株具有降甘油三酯功能的鼠李糖乳杆菌及其应用。
背景技术：
：甘油三酯(tg)是3分子长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人体内含量最多的脂类，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量，同时肝脏、脂肪等组织还可以进行甘油三酯的合成，在脂肪组织中贮存，是体内能量的主要来源。然而随着生活水平的不断提高，出现高血脂的人的比例却越来越高，某项统计数据显示，我国成年人中，出现高血脂问题的比例大约在40％左右，而且这个比例仍然在不断扩大，不断的向低龄化的趋势发展。体内甘油三酯过高会引发人体许多疾病，如高血压、动脉粥样硬化、心血管疾病等。目前防治高脂血症的主要办法有合理饮食、适量运动、适当的理疗和药物治疗，但是对于严重的高脂血症进行长期的药物治疗会出现明显的副作用，包括睡眠问题、腹泻或便秘、记忆或精神问题等。服用安全有效的具有降解甘油三酯功效的菌制剂食品或药品，可以避免或降低现有药物的副作用，但根据现有研究关于菌制剂的甘油三酯降解率普遍较低，列举如表1。表1列举现有研究公开的菌制剂甘油三酯降解率本发明中的鼠李糖乳杆菌具有较强的降甘油三脂功能，为高脂血症的人群治疗提供更多的选择。技术实现要素：针对现有问题，本发明目的在于提供一株耐酸能力强、耐胃肠液能力强、具有降甘油三酯功能的鼠李糖乳杆菌及其应用，尤其在食品或药品组合物中的应用。一株具有降甘油三酯功能的鼠李糖乳杆菌，所述的鼠李糖乳杆菌，所述菌株命名为鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013，该菌株已于2020年03月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmccno.19510。具有降甘油三酯功能的鼠李糖乳杆菌冻干粉，将上述的鼠李糖乳杆菌经过活化、扩培、发酵、冷冻干燥得到鼠李糖乳杆菌冻干粉。上述的一株具有降甘油三酯功能的鼠李糖乳杆菌在制备治疗高血脂症食品或药品中的应用。上述的一株具有降甘油三酯功能的鼠李糖乳杆菌制备具有降甘油三酯功能的食品或药品中的应用。上述的应用，所述食品或药品的剂型是粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液。上述的应用，所述的食品为菌剂或发酵食品、糖果、饮料。一种发酵食品，是上述的一株具有降甘油三酯功能的鼠李糖乳杆菌作为发酵剂生产的食品。一种药物制剂，包括有效剂量的上述的一株具有降甘油三酯功能的鼠李糖乳杆菌和药学上可接受的辅料。一种菌剂，是含有上述的一株具有降甘油三酯功能的鼠李糖乳杆菌的菌剂。本发明所述的鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013分离自顺产的健康6月龄女婴粪便中，是一株耐消化道逆环境能力强的鼠李糖乳杆菌，具有乳杆菌的典型特征，革兰氏阳性，白色菌落，圆形凸起，表面光滑，边缘整齐，细胞呈短粗杆状，单个或成对、成链排列。其理化特征是：接触酶阴性，氧化酶阴性，上述鼠李糖乳杆菌cgmccno.19510的细胞形态和理化实验结果详见表2。表2鼠李糖乳杆菌cgmccno.19510的细胞形态和理化实验结果通过在美国生物工程信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)查阅国际相关的基因库，将本发明的鼠李糖乳杆菌cgmccno.19510的16srdna序列与genbank提交菌株序列相似性比较，鉴定菌株hcs01-013为鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)，比较结果见表3。表3鼠李糖乳杆菌cgmccno.19510的16srdna序列与genbank提交菌株序列相似性比较本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：1、本发明鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013具有降甘油三酯功能，降解率达44.3％；2、本发明鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013具有优秀的耐酸耐胆盐及耐胃肠液能力。当从口摄入进入人体时，能够以较高的存活率到达肠道；3、本发明鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013分离自人源粪便中，应用时安全性高；4、菌种纯化及发酵过程的培养基及中和剂采用的组分原料均为食品级，故菌株安全性高，可用于食品发酵或冻干菌粉等应用；5、本发明鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013冻干菌粉稳定性高，在贮藏过程中能保持较高的存活率(冷藏贮藏12个月时存活率仍高达94.0％)，以发挥其益生作用；本发明提供鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013菌株或其培养液的组合物。本发明提供鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013菌株或其培养液的食品组合物。本发明提供鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013菌株或其培养液的药品组合物。所述的食品组合物可以为保健食品组合物，不同适宜人群的食品组合物，发酵食品组合物。所述食品组合物或药品组合物的剂型不受限制，例如，可以被制成粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等。附图说明图1为邻硝基酚(onp)物质的量的浓度标准曲线。本发明所述的具有降甘油三酯功能的鼠李糖乳杆菌，所述的鼠李糖乳杆菌，所述菌株命名为鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013，该菌株已于2020年03月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmccno.19510。具体实施方式实施例1鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013cgmccno.19510菌株的筛选1、初筛将编号a1809样品进行梯度稀释，将稀释好的样液均匀涂布到酸化mrs改良培养基平板上，mrs培养基平板在37℃培养24～48h(平板放入自封袋中)；2、纯化挑取具有目的菌株典型特征(观察形态、大小、色泽、及其透明度等)、菌落较大、活性较强的单菌落，于mrs改良培养基平板进行划线纯化培养，如此反复3～4次，直到划线平皿中菌落特征一致；所述的酸化mrs改良培养基：蛋白胨10g/l，牛肉粉3g/l，酵母粉4g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸2g/l，乙酸钠5g/l，葡萄糖20g/l，七水合硫酸镁0.58g/l，四水合硫酸锰0.25g/l，吐温-800.6g/l，碳酸钙10g/l，中性红0.05g(1％浓度5ml)，番茄汁10ml/l(v/v)，琼脂粉18g/l，调ph至5.5；115℃,30min灭菌；实施例2鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013cgmccno.19510菌株的鉴定将实施例1中分离纯化后的纯培养物通过划线、涂片镜检，进一步确定其为纯培养物后进行菌种鉴定，包括革兰氏染色试验，接触酶试验及16srdna全序列测序鉴定。最终鉴定分离得到的菌株为一株鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013，已于2020年03月25日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmccno.19510。上述鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013菌株为革兰氏阳性，白色菌落，圆形凸起，表面光滑，边缘整齐，细胞呈短粗杆状，单个或成对、成链排列。其理化特征是：接触酶阴性，氧化酶阴性，可利用d-阿拉伯糖、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-果糖、d-甘露糖、l-山梨醇、l-鼠李糖、甘露醇、山梨醇、α-甲基-d-葡萄糖甙、n-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、水杨苷、纤维二糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、d-塔格糖、葡萄糖酸盐。实施例3鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013cgmccno.19510菌株的耐消化道逆环境试验鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013耐消化道的逆环境能力是其能够以较高存活率到达肠道并在肠道存活、定植生长及发挥功效的先决条件。1、耐酸试验将传代三次的菌液按照10％的接种量分别接种于空白对照培养基、ph3.0、ph2.0的基础mrs培养基中。37℃静置培养，于17h取样，用灭菌的生理盐水进行10倍系列稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000μl进行混菌计数操作，每个稀释度2次重复，37℃静置培养36～48h后计数。耐酸试验数据指标：不同ph条件的培养基测得的活菌数(用n′表示)；空白对照试验测得的活菌数(用n0表示)，其耐酸性活菌数对数比率计算公式如下：受试菌株耐酸存活率(％)＝lgcfun′/lgcfun0×100％；表4hcs01-013耐酸试验数据表由表4可知，hcs01-013菌株在ph3.0的条件下经过17h后，存活率达88.8％，在ph2.0的条件下经过17h后，存活率达63.3％，表明该菌通过胃酸的抑制作用后仍可保持较高活性，从而发挥其益生作用。2、耐胆盐试验将传代三次的菌液按照10％的接种量分别接种于未含有牛胆盐(空白对照)、含有0.3％、0.5％、1.0％、1.5％浓度的mrs液体培养基中，37℃静置培养，于17h取样，测定活菌数。耐胆盐试验数据指标：测得空白对照的活菌数用n0表示，其他胆盐浓度条件下测得的活菌数用n″表示，其耐胆盐活菌数对数比率计算公式如下：受试菌株耐胆盐试验存活率(％)＝lgcfun″/lgcfun0×100％；表5hcs01-013耐胆盐试验数据表由表5可知，hcs01-013菌株耐胆盐能力较强，在1.5％的胆盐浓度条件下经过17h，存活率仍达96.1％。3、模拟胃液试验将传代三次的菌液震荡摇匀，取菌悬液10ml离心(5000×g，10min，5℃)获得菌泥，用pbs缓冲液冲洗3次，获得的菌泥重悬于10ml模拟胃液中，37℃条件下消化3h，分别于0h、3h取样测活菌数。活化三代后的受试菌株在第三代培养液中的活菌数用n表示，经在模拟胃液培养基中消化3h后计数测得的活菌数用n#表示，受试菌株模拟胃液试验存活率计算公式如下：受试菌株模拟胃液试验存活率(％)＝lgcfun#/lgcfun×100％；表6hcs01-013模拟胃液试验数据表由表6可知，hcs01-013菌株在模拟胃液中的存活能力较强，经3h处理后，存活率高达99.8％，其在胃内停留较长时间仍保持高活性。4、模拟肠液试验将传代三次的菌液震荡摇匀，取菌悬液10ml离心(5000×g，10min，5℃)获得菌泥，用pbs缓冲液冲洗3次，获得的菌泥重悬于10ml的人工肠液中，37℃条件下培养，于0h、2h、4h分别取样测活菌数。活化三代后的受试菌株在第三代培养液中的活菌数用n表示，经在模拟肠液培养液中培养2h、4h后计数测得的活菌数用n*表示，受试菌株模拟肠液试验存活率计算公式如下：受试菌株模拟肠液试验存活率(％)＝lgcfun*/lgcfun×100％；表7hcs01-013模拟肠液试验数据表由表7可知，hcs01-013菌株在模拟肠液中的存活能力强，模拟肠液处理4h时后菌株存活率高达100％。综上，说明该菌株具有较强的耐酸能力，且能够有效抵抗胃肠液的影响，从而能够在通过消化道后依然维持较高活性。实施例4鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013cgmccno.19510降甘油三酯体外试验1、试验菌株制备(1)一级培养：将保藏于-80℃的菌株冻存管取出，经手握解冻，混匀，取1环菌液于mrs固体培养基平板划线，37℃静置培养36-48h；(2)二级培养：挑单菌落至5mlmrs培养基中，37℃培养20h；(3)三级培养：5ml菌液接种至100mlmrs培养基中，37℃培养17h；(4)四级培养：将三级培养的菌液以3％接种量接种于100ml甘油三酯培养基中，37℃培养24h。同时将未接种菌液的甘油三酯培养基37℃培养24h。mrs培养基：酵母蛋白胨10g/l，牛肉粉3g/l，酵母粉4g/l，磷酸二氢钾2g/l，柠檬酸2g/l，乙酸钠5g/l，葡萄糖20g/l，七水合硫酸镁0.58g/l，四水合硫酸锰0.25g/l，吐温-800.6g/l，番茄汁10ml/l，琼脂20g/l，调ph至6.5；115℃，30min灭菌。甘油三酯培养基配方的制备：将2％的聚乙烯醇水溶液与植物油按体积比3：1混合，用超声波处理(控制参数每次超声5s，间隔时间5s，共超声70次)后混合均匀制成植物油乳化液，作为甘油三酯的来源。将上述制备的植物油乳化液按5％的比例加入到mrs培养基中，调ph至6.5±0.2，115℃，30min灭菌，制成甘油三酯培养基并于4℃冰箱冷却备用。2、单试剂法甘油三酯含量测定试验(gpo-pap法)将四级培养后的菌液及未接种菌液的甘油三酯培养基分别取10ml用冷冻离心机，4℃，4000r/min离心10min，取上清液，按甘油三酯试剂盒(南京建成生物试剂公司a110-1-1)说明用96孔板将无菌蒸馏水、校准品、样本各取2.5μl分别加入空白孔、校准孔及样本孔中，每孔再加250μl工作液混匀，37℃孵育10min，每组三个平行，用酶标仪测定其510nm处的od值。3试验结果计算方法以如下计算公式计算乳酸菌的tg降解率。总tg含量——未接种菌液的甘油三酯培养基中甘油三酯(tg)含量；残留tg含量——接种菌液的甘油三酯培养基中甘油三酯(tg)含量。鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013tg降解率为44.3％。实施例5对照菌株降甘油三酯体外试验试验选取了现有部分商品菌株进行对照，采用相同的gpo-pap法测定甘油三酯降解率。试验结果见表8，对照菌株中甘油三酯降解率最高的为丹麦科汉森的动物双歧杆菌乳亚种bb-12菌株，其tg降解率为39.3％；其次为丹麦科汉森的植物乳杆菌vegestar2.0，其tg降解率为35.7％。根据实施例4测定结果，鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013的tg降解率为44.3％，高于表8中的所有对照菌株。表8对照菌株甘油三酯降解率实施例6鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013cgmccno.19510冻干粉的制备包括如下步骤：1、菌种发酵1.1)冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的符合要求的鼠李糖乳杆菌菌种冻存管，立即放入37℃水浴锅内进行菌种复苏，15～30s，至冻存管内液体全部融化；待冻存菌种要求：经划线培养后平皿菌落形态均一，无杂菌；实验室300ml级别发酵菌液活菌数大于1.50×109cfu/ml，菌泥离心后收率大于1.3％，且经复核检测结果合格；1.2)菌种活化：按照10％接种量，将复苏好的菌种直接接种至装有10ml基础培养基的50ml三角瓶中，三角瓶密封，37℃培养箱恒温静置培养16.0±0.5小时；1.3)菌种扩培：按照3％接种量，将菌种活化结束的菌悬液接种至装有100ml基础培养基的250ml三角瓶中，三角瓶密封，37℃培养箱恒温静置培养16.0±0.5小时；1.4)一级发酵：按照3％接种量，将菌种扩培结束的菌悬液接种至装有140l优化培养基的200l发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为60rpm，通气量为0，37℃恒温培养，发酵开始时，设定自动流加食品级naoh以调控菌液ph值在5.50，同时校正电极，保证系统显示ph与实测值相差小于0.05；发酵进行7h开始，每0.5h监控菌液od值，当培养时间≥8h，每15min监控菌液od值；当连续两次od值之差＜0.4时，则停止发酵；1.5)二级发酵：按照6％接种量，将一级发酵结束的菌悬液接种至装有150l优化培养基的200l发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为60rpm，通气量为0，37℃恒温培养，在发酵开始时通过流加食品级naoh溶液来维持恒定ph为5.50，同时校正电极，保证系统显示ph与实测值相差小于0.05；发酵进行4.5h开始，每0.5h监控菌液od值，当培养时间≥5.5h，每15min监控菌液od值；当od值出现负增长，或连续两次od值之差＜0.2时，发酵结束；基础培养基组成及制备：葡萄糖20.0g/l、酵母蛋白胨10.0g/l、酵母浸出物5.0g/l、乙酸钠5.0g/l、l-苹果酸3.0g/l、柠檬酸2.0g/l、磷酸二氢钾2.0g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.01g/l、余量为纯化水；按照配方比例称量、溶解，用1mol/l食品级naoh溶液调培养基ph值至6.80，115℃下灭菌30min；优化培养基组成及制备：葡萄糖30.0g/l、酵母蛋白胨15.0g/l、酵母浸出物20.0g/l、乙酸钠5.0g/l、l-苹果酸5.0g/l、柠檬酸2.0g/l、磷酸二氢钾2.0g/l、氯化钙0.5g/l、吐温800.1g/l、硫酸镁0.06g/l、硫酸锰0.01g/l、余量为纯化水；按照配方比例称量、加热溶解，115℃下灭菌30min，用1mol/l食品级naoh溶液调培养基ph值至6.20；1.6)发酵液离心：二级发酵结束后，将发酵罐罐体温度调低，当罐内发酵液温度低于20℃时准备离心，离心设备采用管式离心机，离心前对转鼓进行蒸汽灭菌30min，转速为13000rpm，结束进料后，空转5min，离心结束，收集菌泥。注：1.1)—1.6)操作均需在10万级净化车间内进行。2、冷冻干燥配制6l冻干保护剂：称取海藻糖720.0g，谷氨酸钠60.0g，甘油60.0g，抗坏血酸钠6.0g，溶解于5154g纯化水中，115℃条件下灭菌30分钟，室温冷却后将制得的冻干保护剂冷藏于-4℃冰箱内备用；2.1)冷冻干燥：收集菌泥2.4l，按照菌泥：冻干保护剂＝1:2.5的体积比，添加冻干保护剂，并搅拌、混合均匀，以1.1l/盘装载量分装到冻干机托盘，然后将冻干机托盘放入冻干机内进行菌粉的冻干，冷冻干燥机温度设置见表6，真空度0～1.0pa，持续冻干44小时；表9冷冻干燥机温度设置表2.2)环境温度25℃以下，湿度小于30％收集冻干粉，检测活菌数为1.02×1012cfu/ml；2.3)按质量要求进行粉碎后包装。注：2.1)—2.3)操作均需在10万级净化车间内进行。实施例7鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013cgmccno.19510冻干粉稳定性将鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013冻干粉置于温度为-4℃±2℃，湿度为42％±5％的冷藏环境中，密封贮藏12个月，分别于1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月取样测定活菌数，并根据公式计算存活率。鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013冻干粉活菌数初检数据用n1表示，经冷藏环境贮藏后活菌数用n2表示，冻干粉稳定性试验存活率计算公式如下：冻干粉稳定性试验存活率(％)＝lgcfun2/lgcfun1×100％；表10鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)hcs01-013稳定性试验结果贮藏时间活菌数(cfu/g)活菌对数值存活率(％)初检数据1.02×101212.01——1个月5.70×101111.7697.92个月4.35×101111.6496.93个月3.10×101111.4995.76个月1.77×101111.2593.79个月1.55×101111.1993.212个月1.95×101111.2994.0由表10鼠李糖乳杆菌hcs01-013稳定性试验结果可知，整体趋势随着贮藏时间延长，冻干菌粉的活菌数及存活率有所下降，但贮藏12个月时，存活率仍高达94.0％，即通过此冻干工艺得到鼠李糖乳杆菌hcs01-013冻干菌粉的稳定性较强。<110>汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司<120>一株具有降甘油三酯功能的鼠李糖乳杆菌及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1368<212>dna<213>鼠李糖乳杆菌（lactobacillusrhamnosus）hcs01-013<400>1cggcttcgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaac60gtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagt120tgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacctcgcggtctcg180caactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatga240tttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactagagtgcccaac300taaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctca360cgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaacctg420atctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaatt480aaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgc540ggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaacc600ctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcg660ctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgcctgcgccactgg720tgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctg780cactcaagtttcccagtttccgatgcacttcctcggttaagccgagggctttcacatcag840acttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacct900acgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcac960gccgacaacagttactctgccgaccattcttctccaacaacagagttttacgacccgaaa1020gccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagacttgcgtccattgtggaagattccct1080actgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtttcagtcccaatgtggccgatcaacctc1140tcagttcggctacgtatcattgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatacgc1200cgcgggtccatccaaaagcgatagcttacgccatctttcagccaagaaccatgcggttct1260tggatttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccacttaagggcaggtta1320cccacgtgttactcacccgtccgccactcgttcaaaattaaatcaaga1368当前第1页12